用于病毒灭活的方法与流程

用于病毒灭活的方法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年8月1日提交的美国临时专利申请第62/881,692号的优先权，该临时专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
2.本公开总体上涉及用于在含有多肽的混合物中得到目标ph值的方法。更具体地，本公开涉及用于在含有多肽的混合物中得到目标ph值以有助于确保包膜病毒或病毒样颗粒被灭活的方法


背景技术：

3.在多肽类的生产中，可将目标分子(例如，药物产品的目标多肽组分)从培养基分离。分离过程(例如亲和层析等)可作为目标分子制备过程的一部分而实施。在这种分离过程后，所形成的含有多肽的混合物会潜在地包含不合适的病毒、或者不适合包含于药物产品中的其他污染物。因此，去除或灭活这种污染物的方法是合乎需要的。
4.在一些工业规模的目标分子合成过程中，可实施过程分析技术(pat)。过程分析技术包括与目标分子生产过程的设计、分析和控制有关的系统和方法。过程分析技术包括确定影响产品质量的工艺参数以及定期地监测这些参数以确保产品的质量得以保持。过程分析技术受到管理部门的鼓励，用以广泛地降低与目标分子和药物产品相关的风险。过程分析技术可提供统计验证，或者确认可提高或保持目标分子和/或产品的质量的一个或多个工艺条件得到满足。
5.本文中所公开的方法和系统可提高包括病毒灭活的多肽制备方法的效率和/或生产率。本文中所公开的方法和系统也可提高药物产品制备方法的效率和/或生产率，并且可解决上述的一个或多个问题。


技术实现要素：

6.本公开的各实施方案可涉及一种用于使混合物(例如，洗脱液)中的病毒灭活的方法。该方法可包括将在大于3.9且小于8.5的ph值的混合物从层析柱中进行洗脱。该方法还可包括测定混合物的蛋白质浓度以及测定混合物的ph值。然后，可基于混合物的蛋白质浓度，计算使混合物的ph值降低至灭活ph值所必需的酸的量。在计算酸添加量之后，可将第一部分的酸添加到混合物中，其中第一部分的酸为酸添加量的68％至99％。该方法还可包括将另外部分的酸添加到混合物中，使得混合物的ph值处在或低于灭活ph值。在本公开的方法中，可将混合物保持在灭活ph值达灭活时间段，用于使混合物中的病毒灭活。
7.在本公开的一些实施方案中，用于使混合物中的病毒灭活的方法可包括将包含目标分子的混合物加载到层析柱中，该加载发生在大于或等于约5.0且小于或等于约8.5的ph值下。该方法还可包括在大于约3.9且小于或等于约5.0的ph值下从层析柱中洗脱，经洗脱的混合物包含目标分子。该方法还包括将酸加入到混合物中，从而形成混合物与酸的组合
物，其中该组合物是用于显示有效的病毒灭活并且该组合物具有小于或等于约3.8且大于或等于约3.0的ph值。可利用ph确认模型预先确定该组合物的预期ph值。此外，可测定和/或记录该组合物的ph值。可计算预期ph值与记录ph值之间的差，并且可基于预期ph值与记录ph值之间的计算的差，采取纠正措施。
8.本公开的其他实施方案可包括一种用于建立酸灭活方案的方法。该方法可包括制作洗脱物的池，其中该洗脱物池的各洗脱物含有在蛋白亲和捕获过程中被纯化的目标分子。该方法可包括测定洗脱物池的各洗脱物的ph值和/或蛋白质浓度。此外，可对洗脱物池的各洗脱物进行滴定，以确定使洗脱物达到灭活ph值所需酸的量。然后，可对酸添加量、洗脱物蛋白质浓度、洗脱物ph值、和灭活ph值之间的关系进行回归。
9.在本公开的一些实施方案中，一种用于使混合物中的病毒灭活的方法可包括测定混合物的蛋白质浓度。然后，可基于混合物的蛋白质浓度，计算使混合物的ph值降低至灭活ph值所必需的酸量。在计算酸添加量之后，可将使该合物ph值降低所必需量的酸添加到混合物中。
附图说明
10.并入本说明书中且构成其一部分的附图图示说明了各种示例性实施方案，并且连同描述是用来解释所公开实施方案的原理。本文中所描述的实施方案或实施例的任何特征(例如，组成、剂型、方法，等)可与任何其他实施方案或实施例结合，并且所有的这种组合物被本公开所包含。此外，所描述的系统和方法是既不局限于任何单个方面或其实施方案也不局限于上述方面和实施方案的任意组合物或排列。为了简洁起见，本文中未对某些排列和组合物分别地进行论述和/或说明。
11.图1以流程图的形式描绘了根据本公开的用于使洗脱物(洗脱液)中的病毒灭活的示例性过程；
12.图2以流程图的形式描绘了根据本公开的用于使洗脱物中的病毒灭活的示例性过程；以及
13.图3以流程图的形式描绘了根据本公开的用于建立酸性灭活方案的示例性过程。
14.如本文中使用的词语“包括”、“包含”或者任何它们的其他变体意图涵盖非排他性包含，因而包括一系列要素的过程、方法、物件、或器械不仅包括这些要素，而且可包括未明确地列出或者这种过程、方法、物件或器械所特有的其他要素。术语“示例性”是以“示例”而不是“理想的”意义而使用。就词语“例如”和“如”及其语法对等而言，应理解成遵循短语“并且没有限制”，除非另有明确说明。
15.如本文中使用的词语“约”意图解释由于实验误差所造成的变化。当应用于数值时，词语“约”和“约”可包括相对于所公开数值的 /-5％的变化，除非规定了不同的变化。当应用于ph值时，术语“约”和“约”可包括 /-0.05的变化。如本文中使用的单数形式“一”、“一种”和“所述”包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。
16.应当指出的是，本文中所公开的所有数值(包括所有公开的值、限值、和范围)可具有相对于所公开数值 /-5％的变化，除非规定了不同的变化。本文中所公开的ph值可具有 /-0.05的变化。此外，所有范围被理解成包含端点，例如1厘米(cm)至5cm将会包括1cm、5cm的长度，及在1cm和5cm之间的所有距离。
具体实施方式
17.本公开并不局限于特定的组成、剂型、材料生产商、药物产品、装置、系统、实验条件、或者本文中所公开的特定方法，因为在本领域技术人员的视界内许多变化是可能的。本文中使用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，而并非意图是限制性的。
18.除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。尽管任何合适的方法和材料(例如，类似于或相当于本文中所描述的)可以用于本公开的实施或测试，但现在对具体方法进行描述。所提及的所有出版物以引用的方式并入本文中。
19.如本文中使用的术语“多肽”是指具有多于约20个经由酰胺键以共价键连接的氨基酸的任何氨基酸聚合物。蛋白质类含有一个或多个氨基酸聚合物链(例如，多肽类)。因此，多肽可以是蛋白质，并且蛋白质可含有多个多肽类以形成单一的功能生物分子。
20.翻译后修饰可修改或改变多肽的结构。例如，在一些蛋白质中，可以在翻译后形成二硫键(例如，半胱氨酸残基之间的s-s键)。一些二硫键对于多肽类、免疫球蛋白类、蛋白质类、辅助因子、底物等的适当的结构、功能、和相互作用而言是必不可少的。除了二硫键形成外，蛋白质类可经历其他的翻译后修饰，如脂化(例如，豆蔻酰化、棕榈酰化、法尼基化、香叶酰香叶酰化、和糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定形成)、烷基化(例如，甲基化)、酰化、酰胺化、糖基化(例如，在精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和/或色氨酸处糖基的添加)、及磷酸化(即，将磷酸基添加到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和/或组氨酸)。翻译后修饰会影响疏水性、静电表面性质、或者决定由多肽所参与的表面-表面相互作用的其他性质。
21.如本文中使用的术语“蛋白质”包括生物治疗蛋白类、用于研究或治疗的重组蛋白质类、trap蛋白质类和其他fc-融合蛋白类、嵌合蛋白类、抗体、单克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体样分子、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽类激素等。感兴趣的蛋白质(poi)可包括希望被分离、纯化、或制备的任何多肽或蛋白质。poi可包括目标多肽类或者由细胞产生的其他多肽类(包括抗体)。
22.如本文中使用的术语“抗体”包括由利用二硫键而相互连接的四条多肽链(两条重(h)链和两条轻(l)链)所组成的免疫球蛋白类。通常，抗体具有超过100kda，例如在130kda和200kda之间，如约140kda、145kda、150kda、155kda、或160kda的分子量。各重链包括重链可变区(本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域：ch1、ch2和ch3。各轻链包括轻链可变区(本文中缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域cl。vh区和vl可以被进一步细分为散布有更加保守的区域(被称为框架区(fr))的超突变区域(被称为互补决定区(cdr))。各vh和vl是由按以下顺序从氨基末端布置到羧基末端的三个cdr和四个fr所组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4(重链cdr可缩写为hcdr1、hcdr2和hcdr3；轻链cdr可缩写为lcdr1、lcdr2和lcdr3)。
23.例如，被称为免疫球蛋白g(igg)的一类免疫球蛋白在人血清中是常见的，并且包括四条多肽链(两条轻链和两条重链)。各轻经链由胱氨酸二硫键连接到一个重链，并且两条重链经由两个胱氨酸二硫键彼此结合。其他类型的人免疫球蛋白包括iga、igm、igd和ige。在igg的情况下，存在四个亚类：igg1、igg2、igg3和igg4。各亚类在它们的恒定区中不同，并因此可具有不同的作用或功能。在本文中描述的一些实施方案中，poi可包含目标多
肽(其包括igg)。在至少一个实施方案中，目标多肽包括igg4。
24.如本文中使用的术语“抗体”也包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文中使用的术语：抗体的“抗原结合部”、抗体的“抗原结合片段”等包含特异性地与抗原结合以形成复合物的任何天然存在的、可利用酶法获得的、合成的、或基因工程的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可例如利用包括dna编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的操作和表达的任何合适的标准技术(如蛋白酶切)或者重组基因工程技术由完整抗体分子得到。这种dna是已知的，并且/或者可容易地从例如商业来源、dna库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或者可以合成。dna可利用化学方法或者利用分子生物学技术进行进行测序和操作，例如以将一个或多个可变和/或恒定结构域布置成合适的构型，或者导入密码子，形成半胱氨酸残基，修改、添加或删除氨基酸，等。
25.可利用基于重组细胞的生产系统(如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母))，或者哺乳动物系统(例如，cho细胞和cho衍生物样cho-k1细胞)而生产目标分子(例如，目标多肽)。术语“细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母，等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，sf-9、sf-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾，等)、非人动物细胞、人细胞、或者细胞融合(例如杂交瘤或四源杂交瘤)。在一些实施方案中，细胞可以是人、猴、猿、仓鼠、大鼠、或小鼠的细胞。在一些实施方案中，细胞可以是真核细胞，并且可选自下列细胞：cho(例如，chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如，cos-7)、视网膜细胞、非洲绿猴肾细胞、cv1、肾细胞(例如，hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk)、海拉细胞(hela)、hepg2、wi38、mrc5、colo205、hb8065、hl-60(例如，bhk21)、jurkat细胞、daudi细胞、a431(表皮)、cv-1、u937、3t3、l细胞、c127细胞、sp2/0、ns-0、mmt060562、支持细胞(sertoli cell)、brl3a细胞、ht1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞、及来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞可包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，per.c6
tm
细胞)。
26.本文中的术语“目标分子”可用于指目标多肽(例如，抗体、抗体片段、或者其他蛋白质或蛋白质片段)，或者指意图生产、分离、纯化，并且/或者包含于药物产品中的其他分子(例如，腺相关病毒(aav)或者用于治疗用途其他分子)。虽然根据本公开的方法可适用于目标多肽，但它们也可适用于其他目标分子。例如，腺相关病毒可根据合适的方法(例如，深层过滤、亲和层析，等)而制备，并且包含腺相关病毒的混合物(例如，包含腺相关病毒的洗脱物)可经历根据本公开的方法。在采用本公开的一种或多种方法之前或之后，包含腺相关病毒的混合物可经历另外的步骤(例如，经历“空盒”或不含有目标序列的腺相关病毒的去除)。
27.术语“病毒含量”是指对混合物的定性描述。例如，如果混合物含有病毒或病毒样颗粒，则该混合物具有病毒含量。在一些实施方案中，病毒含量可用病毒颗粒的数量或每体积混合物的感染单位的数量(即，浓度)进行定量。术语“病毒浓度”可指代病毒粒子(例如，有活性和无活性的病毒颗粒)的浓度或者感染单位的浓度。
28.用于病毒灭活的示例性方法可包括将的酸添加到混合物中从而达到已知使一些病毒和病毒样颗粒灭活的ph值，并且将该混合物保持在达到的ph预定量的时间。例如，在一
些实施方案中，本文中的方法可使反转录病毒和反转录病毒样颗粒灭活。在一些实施方案中，用于由包含目标分子的混合物制备目标分子的方法可包括使该混合物与层析装置接触。这种层析装置可包括预制装置(例如，cadence
tm biosmb(pall biosciences公司)、(nnovasep公司)、(novasep公司)、或者octave(biosciences公司))、定制装置、手工组装的装置，或者仅串联地使用两个或更多的标准批量层析装置。
29.在一些实施方案中，通过使剥离缓冲液与层析装置(例如，层析柱)接触，和/或使平衡缓冲液与层析装置接触，可将目标分子从层析装置中洗脱。在一些实施方案中，剥离缓冲液可包括水、碱性溶液、或者包含醇的溶液。水(如去离子水)例如可具有小于5体积百分比(体积％)的溶解离子、小于1体积％的溶解离子、小于0.1体积％的溶解离子、或者甚至小于0.01体积％的溶解离子。根据一些实施方案，碱性溶液可包含一种或多种碱性离子化合物，如lioh、naoh、koh、ca(oh)2、nh4oh或其他碱性化合物。碱性化合物在剥离缓冲液中的浓度可在例如约0.1n至约1.5n、约0.1n至约1n、约0.1n至约1.5n、约0.5n至约1.5n、约0.1n至约0.8n、约0.1n至约0.6n、约0.1n至约0.5n、约0.1n至约0.4n、或者约0.1n至约0.3n的范围内。例如，碱性化合物在剥离缓冲液中的浓度可为约0.1n、约0.2n、约0.3n、约0.4n、约0.5n、约0.6n、约0.7n、约0.8n、约0.9n、约1n、约1.1n、约1.2n、约1.3n、约1.4n、或者约1.5n。包含醇的剥离缓冲液可包括甲醇、乙醇、丙醇、苄醇、或其他醇。基于剥离缓冲液的总重量，醇在剥离缓冲液中的浓度可在约0.1体积％至约30体积％，如约0.5体积％至约30体积％、约0.5体积％至约25体积％、约0.5体积％至约25体积％。约0.5体积％至约25体积％、约1体积％至约20体积％、约1体积％至约15体积％、约1体积％至约10体积％、约10体积％至约50体积％、约10体积％至约40体积％、约10体积％至约30体积％、约10体积％至约25体积％、约15体积％至约25体积％、或约20体积％至约25体积％的范围内。例如，醇在剥离缓冲液中的浓度可为约0.1体积％、约0.5体积％、约1体积％、约2体积％、约3体积％、约5体积％、约10体积％、约15体积％、约20体积％、或者约25体积％。
30.在一些实施方案中，平衡缓冲液的组成可类似于或等同于剥离缓冲液。在其他实施方案中，与剥离缓冲液相比，平衡缓冲液组成可变化。在一些实施方案中，平衡缓冲液可包含一种或多种盐类，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、硫酸盐、三羟甲基氨基甲烷、或其他盐。
31.在一个或多个实施方案中，可在将包含目标分子的混合物从层析装置(例如，填充床亲和层析柱、疏水相互作用层析柱、离子交换层析柱、和/或尺寸排阻层析柱)中洗脱之后采用用于病毒灭活的方法。将目标分子加载入层析装置可基于上游过程而变化，而含有目标分子的混合物可从层析装置中以恒定的体积而洗脱。在一些实施方案中，在大于或等于约5.0且小于或等于约8.5，例如大于或等于约5.5且小于或等于约8.5、大于或等于约6.0且小于或等于约8.5、或约5.0至约6.5的ph值下，将包含目标分子的混合物加载于层析柱上。由于加载中的变化，洗脱物(例如，从层析装置中洗脱的洗脱物)中的蛋白质浓度和/或ph值可变化。由于此变化，被添加用于病毒灭活所需酸的量也发生变化。
32.在常规的生产过程中，利用检误法(trial and error methodology，试错法)完成低ph病毒灭活，其中将预定量的酸添加到洗脱物中、测定洗脱物和酸混合物的ph值，并且反复地继续添加和测定步骤直至达到灭活ph值。由于过多的酸添加会产生潜在成本和损失，因而这种过程是保守的并涉及小的酸添加量和长的灭活工艺时间(常常以数小时的规模)。
33.本公开的各方面可给制备目标多肽或其他目标分子的过程提供各种益处。例如，可实施本文中所描述的一种或多种方法和/或数学模型以确定酸添加量，例如，使混合物(含有目标分子及潜在地不需要的病毒或病毒样颗粒)达到灭活ph值所需酸的量。可将大致相当于酸添加量的量的酸添加到该混合物。如下文更详细所述，可以以单次或两次或更多次的酸施加来添加与酸添加量相当的酸量。与传统的试错法相比，以这种方式给药进行病毒灭活可能更有效，更不容易出错。
34.在本公开的一些方面，作为过程的一部分，在混合物中病毒含量或者感染单位的含量可以是已知的或者期望是极小的或不存在。在本公开的一些这种方面，本文中所公开的系统和方法有利地可并入作为过程分析技术的一部分的生产过程中，用以例如减少过程内部的潜在可变性，提供对过程标准的依从性的实时确认，并且/或者提高过程完整性的可信度。
35.本公开各方面的其他益处和优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
36.如前所述，在利用一种或多种层析和/或分离过程制备目标分子之后，可获得混合物(例如，洗脱物)。在一些实施方案中，可对该混合物进行一次或多次测定，包括例如蛋白质浓度、目标分子浓度、ph值、或者其组合。可通过任何合适的方法(包括例如利用紫外/可见光光谱学)测定蛋白质浓度。在一些实施方案中，利用被目标分子(其可以是多肽)特征吸收波长来测定蛋白质浓度。在这种实施方案中，总蛋白质浓度可大致等于目标分子(例如，目标多肽)的浓度。在一些实施方案中，包含目标分子的混合物可具有约7.0克蛋白质每升洗脱物(g/l)至约35.0g/l、大于或等于7.0g/l、小于或等于约20.0g/l、约8.5g/l至约18.5g/l、或者约10.0g/l至约17.0g/l的蛋白质浓度。
37.可通过任何合适的方法测定混合物的ph值。准确且前后一致的ph值测定对于通过低ph值对病毒蛋白质的成功灭活是重要的。ph值的测定会受到温度、所使用ph探针的类型、相同类型ph探针之间的个体差异、和/或测定介质与ph探针之间的物理相互作用的影响。甚至在标准化的ph测定过程中，
±
0.05ph的变化会是常见的。在多肽生产或病毒灭活的领域中，
±
0.05ph规模的变化可相当于约20％的工作ph范围并且会不利地影响病毒灭活和/或工艺验证。随着时间的推移这种变化甚至会是复合的，从而导致ph值测定中的仪器漂移和更极端变化。因此，在一些实施方案中，当测定ph值时，会考虑ph测定中的变化。在一些实施方案中，如前文所述，通过标准化方法测定洗脱物的ph值，并且目的是减小或消除ph值测定中的可变性。ph测定方法的标准化可包括：使用单个生产商的ph探头，使用单个批次的ph探头，在预定的温度下测定ph值，使测定样本矩阵标准化，等。在一些实施方案中，可利用ph计(例如电位计式ph计)测定洗脱物的ph值。在一些实施方案中，包含目标分子的洗脱物可具有大于或等于约3.9且小于或等于约8.5，例如约3.9至约6.5、约3.9至约5.5、约4.5至约6.5、约4.0至约4.4、约3.9至约4.4.或者约4.0至约4.3的ph值。如本文中使用的ph值或ph值的范围可具有
±
0.05ph单位的变化。
38.一些病毒和病毒样颗粒(例如，包膜病毒、反转录病毒、反转录病毒样颗粒、伪狂犬病病毒、疱疹病毒，等)在混合物(例如，洗脱物)、制剂、和/或药物产品中的存在会影响这种混合物、制剂、和/或药物产品的组分、特性或可用性。例如，不需要的病毒或病毒样颗粒在药物产品中的存在会影响产品稳定性，减小产品的保质期，或者导致产品无法满足内部、药典或监管(例如，美国食品与药品管理局)规范。在施用包含病毒的药物产品时，一些病毒或
病毒样颗粒会导致临床效应(如免疫源性反应)。本公开的各实施方案可用于使病毒或病毒样颗粒灭活，以减小或消除任何或所有不良影响。例如，本公开的各实施方案可适用于在一次或多次多肽纯化过程(例如，包括蛋白a亲和柱的分离过程)之后具有病毒含量的混合物(例如，洗脱物)。
39.在一些实施方案中，在病毒灭活之前，可测定混合物的电导率。在一些实施方案中，在病毒灭活之前，可将一种或多种盐添加到混合物中以调节其电导率(例如，提高电导率)。一种或多种盐可包括碱金属盐类、碱土金属盐类、卤化物类、和/或一种或多种其他离子活性化合物。不受理论的限制，添加一种或多种盐以调节电导率可减少目标分子、病毒或反转录病毒样颗粒的聚集。目标分子、病毒或反转录病毒样颗粒的聚集会影响这些物质有多少表面与酸的相互作用。将盐添加到混合物中可提高混合物的离子活性，提高混合物的电导率，并且减小目标分子或病毒聚集。因此，在一些实施方案中，混合物的电导率可与目标分子或病毒的聚集程度有关。
40.在一些情况下，本公开的各实施方案可适用于具有极低病毒含量(例如，小于或等于约0.0001病毒颗粒或感染单位/ml)的混合物，或者甚至不存在病毒含量。层析和其他分离过程(单独地或组合地)可充分地从混合物中纯化和/或分离目标分子并且去除不需要的病毒或病毒样颗粒。在一些这种情况下，根据本公开的方法可有利于进一步确保病毒或病毒样颗粒被灭活，以及确保产品稳定性、产品安全性、产品有效性、和对内部或管理规范的遵从。因此，本公开的各实施方案也可适用于没有任何已知病毒含量的混合物，从而例如确保管理准则得到满足并且/或者提供冗余的质量控制。
41.本文中描述的病毒灭活方案和方法可在不对某些类型的病毒(如腺相关病毒(例如，包含目标序列的腺相关病毒))造成负面影响的情况下实施。例如，有利地，本文中描述的方案和方法可在不使腺相关病毒降解的情况下实施。因此，本文的描述的方法可适用于含有作为目标分子的腺相关病毒(aavs)的混合物。
42.如前面所提到的，通过将混合物保持在灭活ph值达灭活时间段，可使混合物中的病毒灭活。灭活ph值可以是小于或等于3.8且大于或等于3.0，例如3.35至3.8、小于或等于3.75且大于或等于3.0、小于或等于3.7且大于或等于3.0、小于或等于3.65且大于或等于3.0、小于或等于3.6且大于或等于3.0、小于或等于3.55且大于或等于3.0、小于或等于3.5且大于或等于3.0、小于或等于3.45且大于或等于3.0、小于或等于3.4且大于或等于3.0、3.35至3.75、3.5至3.8、3.5至3.75、3.5至3.7、3.5至3.6、或3.5至3.65的ph值。如本文中所用，ph值或ph值的范围可具有
±
0.05ph单位的变化。如果将灭活ph设置为过高，则存在过程中变化的风险从而可能导致不充分的病毒灭活。如果将灭活ph设置为过低，则存在使目标分子或其他蛋白质类变性的风险，或者以不合适的方式改变该混合物。
43.灭活时间段表示在其间将混合物保持在灭活ph值的时间段。灭活时间段可为约20分钟至约90分钟，例如约30分钟、约45分钟、约60分钟、约30分钟至约45分钟、约30分钟至约60分钟、约30分钟至约75分钟、约30分钟至约90分钟、约45分钟至约60分钟、约45分钟至约75分钟、约45分钟至约90分钟、约60分钟至约75分钟、或者约60分钟至约95分钟。将该混合物保持在灭活ph值达灭活时间段可降低、消除混合物中的病毒活性或确保其不存在。低ph环境可使病毒蛋白质(例如，病毒包膜蛋白)变性。变性的病毒蛋白质可使得反转录病毒和反转录病毒样颗粒无活性，从而降低混合物的不需要的病毒活性。
44.混合物中病毒活性的降低可用缩减因子(reduction factor)进行定量。缩减因子可根据下面所示的方程式1进行计算方程式(1)reduction factor：缩减因子其中v1是在病毒灭活之前混合物的体积，c1是在病毒灭活之前每体积混合物的病毒浓度或感染单位，v2是在病毒灭活之后混合物的体积，并且c2是在病毒灭活之后混合物的病毒浓度。在包括用于病毒灭活的方法的本公开各种实施方案中，得到大于或等于2.5的缩减因子，例如大于或等于3、大于或等于3.5、大于或等于4、大于或等于4.5、或大于或等于5的缩减因子。如本文中使用的“有效的病毒灭活”可指代与大于或等于2.5、大于或等于3、大于或等于3.5、大于或等于4、大于或等于4.5、或大于或等于5的缩减因子相关的病毒灭活。
45.根据一个或多个实施方案，可基于混合物的蛋白质浓度和灭活ph值计算酸添加量。例如可根据下面所示出的方程式2来计算酸添加量w＝ax by c
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方程式(2)其中x是混合物的蛋白质浓度(单位是克每升(g/l))，y是灭活ph值，w是酸添加量(单位：每千克混合物的酸摩尔数(mol/kg))，并且a、b和c是常数。方程式2的常数a具有升
·
摩尔酸每克千克混合物的单位(l
·
mol/g
·
kg)。常数a可大于或等于0.0003l
·
mol/g
·
kg且小于或等于0.0006l
·
mol/g
·
kg，例如约0.0003l
·
mol/g
·
kg至约0.0005l
·
mol/g
·
kg、约0.0004l
·
mol/g
·
kg至约0.0006l
·
mol/g
·
kg、约0.00035l
·
mol/g
·
kg至约0.0005l
·
mol/g
·
kg、约0.00035l
·
mol/g
·
kg至约0.0006l
·
mol/g
·
kg、或者约0.0004l
·
mol/g
·
kg至约0.00055l
·
mol/g
·
kg。方程式2的常数b和c具有酸摩尔数每千克混合物的单位(mol/kg)。常数b可大于或等于-0.1mol/kg且小于或等于0mol/kg，例如约-0.1mol/kg至约0mol/kg、约-0.1mol/kg至约-0.05mol/kg、约-0.05mol/kg至约0mol/kg、或约-0.08mol/kg至约-0.01mol/kg。常数c可大于或等于0.02mol/kg且小于或等于0.1mol/kg，例如，约0.02mol/kg至约0.1mol/kg、约0.02mol/kg至约0.05mol/kg、约0.05mol/kg至约0.1mol/kg、或者约0.04mol/kg至约0.08mol/kg。
46.在一些实施方案中，可基于混合物的蛋白质浓度、灭活ph值和混合物的ph计算酸添加量。例如，可根据下面所示的方程式3来计算酸添加量，w＝ec fy gz h
ꢀꢀꢀꢀꢀ
方程式(3)其中x是混合物蛋白质浓度(单位是克每升(g/l)，y是灭活ph值，z是混合物ph，w是酸添加量(单位是酸摩尔数每千克混合物(mol/kg))，并且e、f、g和h是常数。方程式3的常数e具有升
·
摩尔酸每克
·
千克混合物的单位(l
·
mol/g
·
kg)并且常数f、g和h具有酸的摩尔数每千克混合物的单位(mol/kg)。常数e可大于或等于0.00005l
·
mol/g
·
kg且小于或等于0.0005l
·
mol/g
·
kg，例如约0.00005l
·
mol/g
·
kg至约0.0005l
·
mol/g
·
kg、约0.0001l
·
mol/g
·
kg至0.0005l
·
mol/g
·
kg、约0.00005l
·
mol/g
·
kg至0.00045l
·
mol/g
·
kg、约0.0001l
·
mol/g
·
kg至约0.00035l
·
mol/g
·
kg、或者约0.00035l
·
mol/g
·
kg至约0.0005l
·
mol/g
·
kg。常数f可大于或等于-0.2mol/kg且小于或等于0mol/kg，例如约-0.1mol/kg至约0mol/kg、约-0.1mol/kg至约-0.05mol/kg、约-0.05mol/kg至约0mol/kg、或者约-0.08mol/kg至约-0.01mol/kg。常数g可大于或等于0mol/kg且小于或等于0.03mol/kg，例如约0mol/kg至约0.03mol/kg、约0.001mol/kg至约
0.03mol/kg、约0.005mol/kg至约0.3mol/kg、或者约0.005mol/kg至约0.025mol/kg。常数h可以是大于或等于-0.1mol/kg且小于或等于0.1mol/kg，例如约-0.1mol/kg至约0.1mol/kg、约-0.08mol/kg至约0.08mol/kg、约-0.05mol/kg至约0.1mol/kg、或者约-0.1mol/kg至约0.05mol/kg的数。
47.使混合物蛋白质浓度与酸添加量和灭活ph值(其可任选地取决于混合物ph)联系起来的该特定方程式可随着目标分子和/或所用酸系统而变化。上面所定义常数的值，应用于给定的目标分子和酸系统，可根据上面所定义的一般方程式通过回归而确定。如在下面的实施例节中所描述的，意外地发现根据上面所定义的方程式，酸添加量与混合物蛋白质浓度具有强相关性。此意外地强的相关性可允许本文中所描述的一般方程式及它们的衍生式并入过程分析技术(pat)中。
48.在一个或多个实施方案中，酸添加量为约0.002摩尔酸每千克混合物(mol/kg)至约0.025mol/kg，例如约0.002mol/kg至约0.025mol/kg、约0.01mol/kg至约0.025mol/kg、约0.002mol/kg至约0.020mol/kg、或者约0.005mol/kg至约0.020mol/kg。
49.在一些实施方案中，在计算酸添加量之后，可将酸添加到混合物中以使混合物处在灭活ph值。例如，在至少一个实施方案中，可将一剂量的酸(等于酸添加量)添加到混合物中，以使混合物的ph处在小于或等于灭活ph值。在其他实施方案中，将第一部分的酸添加到混合物中，然后可将一个或多个另外部分的酸添加到混合物中，使得混合物的ph值处在或低于灭活ph值。在这种实施方案中，第一部分的酸为酸添加量的68％至99％，例如约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约85％至约95％、或者约90％至约99％。
50.可将第一部分的酸的比例确定为，使得具有最低可能ph值的混合物中的目标分子不会因第一部分酸的添加而使其变性。另外部分的酸可包括在第一部分酸的添加后发生的一次或多次酸的添加，在第一部分酸的添加后进行的例如3次酸添加、4次酸添加、或5次酸添加。一次或多次酸添加的各次添加可以是酸添加量的0.1％至32％，例如约0.1％至约30％、约0.1％至约25％、约0.1％至约20％、约1％至约25％、约0.1％至约15％、约0.1％至约10％、约1％至约15％、约1％至约10％、或者约0.1％至约5％的量。一次或多次酸添加的各添加可采用与一次或多次其他酸添加相同的量。在其他实施方案中，各酸添加采用与各其他酸添加相同的量。
51.在一些实施方案中，在将第一部分的酸添加到混合物中之后但在另外部分的酸添加之前，可测定ph值。在一些这种实施方案中，混合物的ph值，在添加第一部分酸之后所测定，为大于或等于3.5且小于或等于3.75，例如约3.5至约3.75、约3.6至约3.7、约3.5至约3.65、约3.6至约3.75、或者约3.5至约3.65。如本文中使用的ph值或ph值的范围可具有
±
0.02ph单位的变化。
52.酸可以以一个或多个酸性溶液的形式而添加。酸性溶液可包括任何合适的酸，例如hcl、hbr、h3po4、ho2c2o2h、c6h8o7、h2so3、h3po4、hno2、c6h5co2h、ch3co2h、hclo、hcn、h3bo3、或者其组合。另外或可替代地，酸性溶液可包含一种或多种盐，例如甘氨酸、精氨酸、乙酸钠、和/或氯化钠。
53.在将酸添加量添加到包含目标分子的混合物中之后，所形成的混合物具有处在或低于灭活ph值的ph值。在一些实施方案中，可测定所形成混合物的ph值，例如以确认它在期
望的范围内。如前所述，可将混合物保持在灭活ph值达灭活时间段。在将混合物保持在灭活ph值达灭活时间段之后，病毒活性的降低可以以等于例如大于或等于2.5、大于或等于3、大于或等于3.5、或者大于或等于4的缩减因子而发生。在将混合物保持在灭活ph值达灭活时间段之后，可通过添加碱性溶液对混合物进行滴定(滴加)，使得混合物的ph值大于或等于4.5且小于或等于8.5例如大于或等于4.5且小于或等于8.5、大于或等于5.0且小于或等于8.5、大于或等于5.8且小于或等于8.5、大于或等于5.9且小于或等于8.5、大于或等于6.0且小于或等于8.5、大于或等于6.1且小于或等于8.5、大于或等于6.2且小于或等于8.5、大于或等于6.3且小于或等于8.5、或者大于或等于6.4且小于或等于8.5。如本文中使用的ph值或ph值的范围可具有
±
0.02ph单位的变化。碱性溶液可包含一种或多种碱，例如naoh、koh、lioh、ca(oh)2、nh4oh、nach3co2和/或(hoch2)3cnh2。
54.在一些实施方案中，在添加第一部分的酸之后，对混合物进行滴定(滴加)达小于1小时，例如小于约50分钟、小于约45分钟、小于约40分钟、小于约35分钟、或者小于约30分钟。
55.本公开的多个方面也可包括用于确定组合物(即，组合的混合物与酸)的ph值的函数预测的方法。例如，可确定基于混合物的测定蛋白质浓度和/或ph值来预测组合物ph值(例如，灭活ph值)的函数，并且将一定量的酸添加到混合物中。这种函数可以用于检出处理误差(例如，不充分的混合、不良的取样，等)或者设备中的缺陷(仪器误差、仪器漂移、ph探头功能失常，等)。
56.在一些实施方案中，根据确认模型预先确定酸化混合物的预期ph值。该确认模型可采用下面所示方程式4的形式y＝kx lw mz n
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方程式(4)其中y是灭活ph值，x是混合物的蛋白质浓度(单位是每升(g/l))，z是混合物ph值，w是酸添加量(单位是酸的摩尔数每千克混合物(mol/kg)，并且k、l、m和n是常数。方程式4的常数k具有升每克的单位，常数l具有千克混合物每摩尔酸的单位，并且常数m和n是无单位的。常数k可大于或等于0l/g且小于或等于0.03l/g，例如约0l/g至约0.03l/g、约0.001l/g至约0.03l/g、约0l/g至约0.025l/g、或者约0.001l/g至约0.025l/g。常数l可大于或等于-80kg/mol且小于或等于-60kg/mol，例如约-75kg/mol至约-60kg/mol、约-80kg/mol至约-65kg/mol、或者约-75kg/mol至约-65kg/mol。常数m可大于或等于0且小于或等于2.0，例如约0至约2.0、约0.3至约2.0、约0至约1.7、或者约0.3至约1.7。常数n可以是大于或等于-1.0且小于或等于0，例如约-1.0至约0、约-1.0至约-0.1、或者约-0.9至约-0.1的数。
57.在一些实施方案中，可在酸添加之前测定和/或记录混合物的ph值和蛋白质浓度。基于混合物ph值、混合物的蛋白质浓度、和酸添加量，可利用确认模型预先确定酸化混合物的预期ph值。可测定、记录酸化混合物的实际ph值，并且/或者与预期ph值进行比较。记录的ph值与预期的ph值的比较可包括计算记录的ph值预期ph值之间的差(例如，百分比差)。
58.在一些实施方案中，如果记录的ph值与预期的ph值之间的差大于阈值量，则可采取纠正措施。阈值量可以是例如预期ph值的
±
0.03ph、预期ph值的
±
0.05ph、预期ph值的
±
0.07ph、预期ph值的
±
0.09ph、预期ph值的
±
0.1ph、预期ph值的
±
0.15ph、或者预期ph值的
±
0.2ph。纠正措施可包括但不限于：调节ph计、调节混合物的组成、调节处理过程的一个或多个环境条件、或者其组合。调节ph计可包括使ph计标准化，重新校准ph计，清洗、重置和/
或替换ph探头，调节参比电极溶液，替换ph计的部件，调节ph探头的位置，和/或用于改变ph计的信噪比的其他措施。调节混合物的组成可包括重新制定混合物的任何组分溶液或上游组成，改变一个或多个层析或分离过程的过程条件或器械部件、和/或用于改变混合物的材料组成的其他措施。调节处理的一个或多个环境条件可包括：调节混合和/或均化过程和系统、调节处理过程的温度、调节处理过程的湿度、调节过程的压力、或者其组合。基于相对于预期参数的偏差的这种调节可作为过程分析技术(pat)的一部分而并入。
59.上述的方程式和数学模型可作为用于形成酸性灭活方案的方法的一部分而生成。用于形成酸性灭活方案的方法可包括制作混合物(例如，洗脱物)的池，其中池的各混合物含有在蛋白质亲和捕获过程中被纯化的目标分子。例如，可从蛋白亲和层析柱的洗脱物中收集样品池。该方法还可包括测定各样品的ph值和蛋白质浓度(例如，目标分子的浓度)。在确定各样品的ph值和蛋白质浓度之后，可对各样品进行滴定以确定使样品处在灭活ph值所需酸的量。在实施方案中，灭活ph可被定义为足够宽的范围，可以进行两次或多次反复滴定，允许从池子的每个样品中收集多个数据点。在其他实施方案中，可从样品中仅收集单个数据点。
60.在一些实施方案中，可在添加酸的量、洗脱物蛋白质浓度、混合物的ph值、和/或灭活ph值之间的关系(例如，数学模型)进行回归。可根据如上所述方程式2或方程式3对该关系进行回归。在一些实施方案中，建立酸性灭活方案的方法还包括对确认模型进行回归。可根据上述方程式4对该确认模型进行回归。
61.图1以流程图的形式描绘了根据本公开的用于使混合物中的病毒灭活的示例性过程100。根据步骤101，可从层析柱中进行洗脱在第一ph值(例如，大于3.9)的混合物。根据步骤102，可通过例如紫外/可见光光谱学或其他方法测定混合物的蛋白质浓度(例如，目标分子浓度)。任选地，利用例如电位计式ph计或其他方法测定混合物的电导率和/或ph值。根据步骤103，可以足以调节混合物的电导率的量将一种或多种盐添加到混合物中。根据步骤104，可计算使混合物的ph值降低至第二ph值(例如，灭活ph值)所必需酸的量。可基于混合物的蛋白质浓度、混合物的ph值、或者其组合而执行此计算。根据步骤105，可将第一部分的酸添加到混合物中。在一些实施方案中，第一部分的酸是等于计算的酸添加量的一剂量的酸。在其他实施方案中，第一部分的酸可以是计算的酸添加量的68％至99％的体积或酸的量。根据步骤105，任选地，可将二级酸添加到混合物中，使得混合物与酸的组合物处在或低于第二ph值(例如，灭活ph值)。根据步骤106，可将混合物与酸的组合物保持在第二ph值(例如，灭活ph值)达灭活时间段，从而使洗脱物中的病毒灭活。
62.图2以流程图的形式描绘了根据本公开的用于使混合物中的病毒灭活的示例性过程200。根据步骤201，可将第一ph值的(例如，大于或等于约5.0且小于或等于约8.5)包含目标分子的混合物加载到层析柱上。根据步骤202，可将第二ph值下(例如，大于约3.9且小于或等于约5.0)的被洗脱混合物从层析柱中进行洗脱。根据步骤203，通过例如紫外/可见光谱学测定并且/或者记录被洗脱混合物的蛋白质浓度(例如，目标分子浓度)。根据步骤204，任选地，可测定被洗脱混合物的ph值和/或电导率。利用例如电位计式酸碱计(ph计)测定并且/或者记录ph值。根据步骤205，以足以调节混合物的电导率的量将一种或多种盐添加到混合物中。根据步骤206，可将酸添加到被洗脱混合物中，从而形成被洗脱混合物与酸的组合物，使得该组合物展现有效的病毒灭活。此外，该组合物可具有小于或等于第二ph值的ph
值(例如，小于或等于约3.8且大于或等于约3.0)。根据步骤207，可利用ph确认模型预先确定该组合物的预期ph值。根据步骤208，可测定和/或记录该组合物的ph值。根据步骤209，可计算该组合物的预期ph值与测定/记录ph值之间的差。根据步骤210，可基于计算得到的该组合物的预期ph值与测定和/或记录ph值之间的差，采取纠正措施。
63.图3以流程图的形式描绘了根据本公开的用于建立酸性灭活方案的示例性过程300。根据步骤301，可制作洗脱物样品的池，其中洗脱物样品的池的各洗脱物样品含有在亲和捕获过程中被纯化的目标分子。根据步骤302，可通过例如紫外/可见光光谱学测定洗脱物样品池的各洗脱物样品的蛋白质浓度(例如，目标分子浓度)。任选地，可通过例如电位计式酸碱计测定洗脱物样品池的各洗脱物样品的ph值。根据步骤303，通过对洗脱物样品池的各洗脱物样品进行滴定，可确定使各洗脱物样品的ph值降低至灭活ph值所必需酸的量。根据步骤304，可对添加酸的量、洗脱物蛋白质浓度、洗脱物ph值、和/或灭活ph值之间的关系进行回归。根据步骤305，任选地，也可对确认模型进行回归。
64.尽管图1-图3的每个图描绘了步骤的具体顺序，但应当理解的是可修改执行的步骤以及实施步骤的顺序。另外，可添加步骤(例如，一个或多个的测定和/或记录步骤)，或者将步骤从任何本文中所公开的方法中去除。此外，尽管图1-图3的每个图描绘了与洗脱物有关的步骤，但应当理解的是这些步骤可适用于含有目标分子的任何混合物。实施例
65.以下的实施例是用来说明本公开而在本质上并非限制性的。当然，本公开包括与前面的描述和以下的实施例一致的其他方面和实施方案。
66.在以下的实施例中，目标多肽是由包含目标多肽、宿主细胞蛋白质、病毒、和其他污染物、杂质、和组分的混合物所制备。目标多肽是在悬浮培养中生长的中国仓鼠卵巢细胞中制备。实施例1
67.目标多肽从蛋白a亲和柱中洗脱，并且获得混合物的多个样品。各混合物样品的蛋白质浓度是通过紫外/可见光谱学而获得并且示于下面的表1中(单位是克蛋白质每升混合物)。另外，测定各混合物样品的ph并且示于表1中。
68.洗脱物的池包含四十个洗脱物样品(即，混合物的四十个样品)并且用0.25m磷酸(h3po4)溶液将各样品滴定到3.35至3.86的灭活ph值，以确定酸添加量(例如，使该混合物处在灭活ph值所需添加的酸的量)。就四十个样品中的六个样品而言(表1中所示的样品1
–
6)，多次反复执行滴定以产生多个数据点。例如，使样品1处在3.70的灭活ph值的30.89克酸每千克混合物是一个数据点，并且当添加5.35克额外的酸每千克混合物时，使样品1处在3.59的灭活ph值的36.24克酸每千克混合物是另一个数据点。将用于这些滴定的数据示于下面的表1中，其中所显示酸添加量的单位是酸的克数每千克混合物和酸的摩尔数每千克混合物。
表1：混合物滴定数据实施例2
69.表1中所示的滴定数据是用于根据方程式2对混合物蛋白质浓度、灭活ph值、和酸添加量之间的关系进行回归。确定下面所示的回归方程式(方程式5)具有0.84的决定系数(r2)。w＝0.0004532x-0.01135y 0.04213
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方程式(5)实施例3
70.仍然参考表1中所示的滴定数据，根据方程式3，对混合物蛋白质浓度、混合物ph值、灭活ph值、和酸添加量之间的关系进行回归。确定下面所示的回归方程式(方程式6)具有0.97的决定系数(r2)。意外地，酸添加量与一般方程式2和3中所示的蛋白质浓度、混合物ph值、和灭活ph值之间的关系高度相关。w＝0.0001986x-0.01162y 0.01510z-0.01692
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方程式(6)实施例4
71.表1中所示的滴定数据也可用于根据一般方程式4对确认模型进行回归。确定下面所示的回归方程式(方程式7)具有0.93的决定系数(r2)。也是意料之外地，灭活ph值与蛋白质浓度、混合物ph值、和灭活ph值之间的关系高度相关。y＝0.01488x-71.65w 1.094z-0.6727
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方程式(7)
72.本领域技术人员将理解的是，本公开所基于的构思可容易地用作用于设计其他方法和系统以实现本公开的若干目的基础。另外，虽然关于特定过程中的特定步骤(例如，混合物中的病毒灭活)对本公开的各方面进行了描述，但本领域技术人员将理解的是，本文中所公开的系统和方法可适用于其他语境(例如，在包含多肽的其他混合物中的病毒灭活，例如在制备所配制药物的过程中在层析过程之前或者在洗脱物与其他成分的组合之后)。因此，权利要求不被认为受到前面的描述的限制。