一种稳定的蛋白质乳液的制备方法

1.本发明属于食品科学与工程的乳液制备技术领域，尤其涉及一种稳定的蛋白质乳液的制备方法。


背景技术：

2.乳液是由界面主导的体系，是由两种或多种互不相溶的液体(如油和水)组成的混合物，蛋白质作为乳化剂的主要作用是吸附到两相界面维持界面稳定。对于一种蛋白质来说，它在o/w界面上的吸附行为和吸附蛋白层的性质在很大程度上决定了它的乳化性能，特别是乳液的稳定性。在实际应用中，乳液涉及食品、化妆品、医药等多个领域，但乳液的稳定性极大地限制了其应用范围，因此，合理调控界面蛋白的结构组成是解决乳液稳定性的关键。
3.在过去的几十年里，不断增长的世界人口极大地增加了对高营养附加值食物来源的需求，由于人们健康意识和环保理念的增强，植物蛋白逐步替代动物蛋白，努力的重点是用廉价和有营养的植物蛋白替代昂贵的动物蛋白。植物蛋白天然绿色，健康环保，也有独特的生理功效，由食物蛋白制成的纳米颗粒与食物配方完全生物相容，从而避免了安全问题，其中越来越多的证据表明大豆蛋白是制造用于水包油乳液的良好材料。
4.乳液稳定性是限制其应用的关键问题。目前，将蛋白质与其他小分子表面活性剂、多酚、多糖等复合物组装是提高乳液稳定性的一种常用策略，但是操作过程会涉及有机溶剂或者流程相对繁琐。中国发明申请专利202010696083.8公开了“一种高稳定pickering乳液及其制备方法”，以乳清分离蛋白和糖类复合物形成复合纤维溶液为乳化剂制备pickering乳液具有较高理化稳定性，但方法涉及酸热处理和乙醇旋蒸，操作步骤略复杂且涉及有机溶剂。中国发明申请专利202110277502.9以大豆分离蛋白溶液和甜菊糖苷溶液混合制备复合稳定体系步骤繁琐，需要提前将植物甾醇溶于90～99℃油中获得油相。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的在于提供一种无需加热或选择特定的多酚、多糖复合，通过蛋白的构象调控界面稳定性的稳定蛋白质乳液的制备方法。
6.技术方案：本发明的稳定的蛋白质乳液的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)将脱脂豆粕分散于水中，调节ph为碱性，室温下搅拌，离心去除沉淀，上清液调节ph为酸性，静置过夜，离心后取沉淀水解得到多肽，离心的上清液调ph为酸性再离心，同样调ph离心后得到沉淀球蛋白；2)将多肽和球蛋白分别分散于水中，室温下搅拌溶解完全，测定蛋白浓度并稀释到一定浓度；(3)将多肽和球蛋白两种构象的蛋白溶液按一定比例复配，充分水合得到水相蛋白液；(4)水相蛋白液中加入油相，比例为9∶1，混合制备得到稳定的蛋白质乳液。
8.进一步地，步骤(1)中，所述脱脂豆粕分散于水中的料液比为1∶15，所述碱性ph为7.5～8.0，搅拌时间是2～2.5h，离心条件是6000～7000rpm，首次酸性ph为6～6.5，后述酸
性ph为4.5～5。球蛋白为7s，多肽为11s配成浓度为5wt％的蛋白液并用e/s＝0.05％的胃蛋白酶在ph＝2～2.5的条件下水解1～1.5h得到。
9.进一步地，步骤(2)中，所述多肽和球蛋白是在中性条件溶解，搅拌2～3h完全溶解，采用lowry法测定蛋白浓度，蛋白质的质量浓度稀释为为1～1.2wt％。
10.进一步地，步骤(3)中，所述水相蛋白液为多肽和球蛋白互相混合得到，固定总蛋白量，多肽占蛋白总量30～70％，无其他乳化剂加入，水合条件为冷藏过夜，更优地，50％为最佳条件。
11.进一步地，步骤(4)中，所述水相蛋白质溶液的比例为90wt％，油相为大豆油，油相比例为10wt％，制备方法是高速剪切分散和高压均质。
12.进一步地，上述剪切分散的转速是13000～14000rpm，分散时间2～3min；所述高压均质的均质压力是25～35mpa，均质2～3次遍。
13.本发明制备方法得到的蛋白乳液，乳液均匀细腻，两种构象的蛋白稳定o/w界面的能力优于球蛋白自身。
14.与以往研究相比，本发明无需加热或选择特定的多酚、多糖复合，通过蛋白的构象调控界面稳定性，工艺流程较为简单，生产容易，原理清晰，制备乳液稳定性高。
15.事实上，蛋白质的界面性质很大程度上取决于它的聚集状态和结构特性(特别是构象的灵活性)。对于多组分蛋白共存体系，界面结构的形成主要取决于蛋白质分子间相互作用，以及蛋白质与溶剂间相互作用。小分子表面活性剂在形成含有小液滴的乳液时非常有效的原因之一，因为它们能够在均质过程中快速吸附到液滴表面，从而快速降低界面张力并快速形成保护涂层。由于肽是小分子，它们的扩散迁移和吸附到界面的亲和力加快了，它们也可能填充界面区域中没有被球蛋白覆盖的部分，界面层一旦形成，其在乳化液形成过程中的弹性以及分散体系在物理应力作用下的胶体稳定性取决于其力学性能。由于多肽分子量小、灵活性高，球蛋白分子量大、结构完整，两者结合呈现一个比球蛋白和多肽更稳定的新界面结构，这是球蛋白与多肽结构互补的结果。综上，利用不同构象的蛋白制备的o/w型乳液极具创新性、挑战性与应用前景。
16.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
17.1、本发明想法独特、构思巧妙，打破传统的提高蛋白乳化性能的方式，通过不同构象的蛋白质稳定乳液界面，提供了一个新的科研思路和乳液制备方式。
18.2、本发明所用的蛋白提取方便，来源广、成本低、产量高、可持续获取，绿色环保、对人体无害且具有一定功能特性，扩大了植物蛋白的利用。
19.3、本发明工艺条件简单温和，制备步骤简单易实现，原料全天然健康，无需添加其他合成抗氧化剂或辅助添加剂，制备的乳液粒径小、分散均匀，能够依靠自身结构保持长时间稳定。
附图说明
20.图1为本发明所得不同比例gh为乳化剂的o/w型乳液粒径图；
21.图2为本发明所得不同比例gh为乳化剂的o/w型乳液电位图；
22.图3为本发明所得不同比例gh为乳化剂的o/w型乳液界面吸附量；
23.图4为本发明所得不同比例gh为乳化剂的o/w型乳液的clsm显微图(比例尺10μm)，
其中a为gh-0，b为gh-10％，c为gh-30％，d为gh-50％，e为gh-70％；
24.图5为本发明所得不同比例gh为乳化剂的o/w型乳液于室温保存1月后的显微图(比例尺20μm)，其中a为gh-0，b为gh-10％，c为gh-30％，d为gh-50％，e为gh-70％；
25.图6为本发明不同比例gh为乳化剂的o/w型乳液于室温保存1月后的外观图(从左至右依次是gh-0，gh-10％，gh-30％，gh-50％，gh-70％)；
26.图7为本发明所得不同比例gh为乳化剂的o/w型乳液于室温保存7天后的外观图，其中a为gh-0，b为gh-10％，c为gh-30％，d为gh-50％，e为gh-70％(从左至右依次是未处理、0.1m、0.2m、0.3m、0.4m和0.5m nacl)。
具体实施方式
27.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
28.实施例1
29.以脱脂豆粕为原料，经过多次离心得到球蛋白11s和7s，其中11s稀释到5wt％，调ph到2再加入胃蛋白酶(e/s＝0.05％)，在37℃下连续搅拌1h制得柔性多肽；分别将多肽和球蛋白在中性条件下分散于水中，室温下搅拌溶解完全，采用lowry法准确测定蛋白浓度并稀释至1wt％；固定总蛋白量，多肽占蛋白总量的比例30％，其余用球蛋白补足，二者互相混合，充分水合得到水相蛋白液；球蛋白与多肽混合制备好后，将其储存在4℃的冰箱里，使得蛋白溶液充分水合得到水相蛋白液；在水相蛋白液中加入大豆油，13500rpm剪切分散2min制取粗乳液，30mpa过两遍高压均质机制备得到稳定的蛋白乳液。结果表明，图1～2显示多肽占比30％的蛋白乳液粒径450nm、电位－30mv左右，一般而言，乳液电位绝对值达到30mv足以维持液滴稳定。尽管图6和图7所示(30％)的乳液热稳定性和离子稳定性略差，但储藏稳定性较好。
30.实施例2
31.以脱脂豆粕为原料，经过多次离心得到球蛋白11s和7s，其中11s稀释到5wt％，调ph到2再加入胃蛋白酶(e/s＝0.05％)，在37℃下连续搅拌1h制得柔性多肽；分别将多肽和球蛋白在中性条件下分散于水中，室温下搅拌溶解完全，采用lowry法准确测定蛋白浓度并稀释至1wt％；固定总蛋白量，多肽占蛋白总量的比例50％，其余用球蛋白补足，二者互相混合，充分水合得到水相蛋白液；球蛋白与多肽混合制备好后，将其储存在4℃的冰箱里，使得蛋白溶液充分水合得到水相蛋白液；在水相蛋白液中加入大豆油，13500rpm剪切分散2min制取粗乳液，30mpa过两遍高压均质机制备得到稳定的蛋白乳液。结果中图1表明本实施例(gh-50％)的乳液粒径小，图2电位值高达－35mv，图3显示界面吸附量也很高，这些结果预示着乳液具有良好的稳定性。微观结构图4～5(d)显示制备的乳液液滴细小均匀，分散良好，没有液滴聚集现象，图6和图7(d)显示此条件制备的乳液经过100℃高温和不同弄度盐离子的处理仍然可以保持原有的外观和微观形态，维持乳液长期保存稳定性，表现出最佳的稳定性。
32.实施例3
33.以脱脂豆粕为原料，经过多次离心得到球蛋白11s和7s，其中11s稀释到5wt％，调ph到2再加入胃蛋白酶(e/s＝0.05％)，在37℃下连续搅拌1h制得多肽；分别将多肽和球蛋白在中性条件下分散于水中，室温下搅拌溶解完全，采用lowry法准确测定蛋白浓度并稀释
至1wt％；固定总蛋白量，多肽占蛋白总量的比例70％，其余用球蛋白补足，二者互相混合，充分水合得到水相蛋白液；球蛋白与多肽混合制备好后，将其储存在4℃的冰箱里，使得蛋白溶液充分水合得到水相蛋白液；在水相蛋白液中加入大豆油，13500rpm剪切分散2min制取粗乳液，30mpa过两遍高压均质机制备得到稳定的蛋白乳液。图1～3(70％)结果表明本实施例的乳液粒径350nm左右，电位绝对值大于30mv，界面吸附量约55％，图4(e)clsm显示新鲜制备的乳液颗粒很小，无大量不规则油滴出现，分散良好，只是储存一个月后的微观结构图5(e)中发现有小部分聚集产生。图6和图7结果同样表明本实施例制备的乳液经过高温和不同浓度盐离子的处理大致保持原有的外观和微观形态，稳定性相对较好。
34.实施例4
35.对比实施例1，本实施例以脱脂豆粕为原料，经过多次离心得到球蛋白7s，将7s在中性条件下分散于水中，室温下搅拌溶解完全，采用lowry法准确测定蛋白浓度并稀释至1wt％，4℃充分过夜水合得到水相蛋白液；在水相蛋白液中加入大豆油，13500rpm剪切分散2min制取粗乳液，30mpa过两遍高压均质机制备得到蛋白乳液。采用本方法制备的蛋白乳液在图1结果显示液滴粒径较大，远远大于有多肽参与制备的乳液。图4(a)中液滴分布不均匀，有大量不规则油滴，并且部分水相已经沉淀并析出均匀。通过图6～7(a)也可以看出，由于结构稳定性不好，导致热稳定和离子稳定性也较差，乳析分层现象非常明显，这是乳液失稳的重要特征。
36.实施例5
37.对比实施例2，以脱脂豆粕为原料，经过多次离心得到球蛋白11s和7s，其中11s稀释到5wt％，调ph到2再加入胃蛋白酶(e/s＝0.05％)，在37℃下连续搅拌1h制得柔性多肽；分别将多肽和球蛋白在中性条件下分散于水中，室温下搅拌溶解完全，采用lowry法准确测定蛋白浓度并稀释至1wt％；固定总蛋白量，多肽占蛋白总量的比例10％，其余用球蛋白补足，二者互相混合，充分水合得到水相蛋白液；球蛋白与多肽混合制备好后，将其储存在4℃的冰箱里，使得蛋白溶液充分水合得到水相蛋白液；在水相蛋白液中加入大豆油，13500rpm剪切分散2min制取粗乳液，30mpa过两遍高压均质机制备得到稳定的蛋白乳液。图3(10％)显示采用本方法制备的蛋白乳液界面吸附量偏低，表明油滴周围吸附的蛋白质较少，液滴的稳定性会受到影响；通过图4(b)clsm表明乳液分布相对图4(a)均匀，但同样存在较多聚集液滴和大的蛋白质聚集的颗粒。