一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的制作方法

1.本发明涉及化学发光酶免疫分析领域，尤其涉及一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用。


背景技术：

2.化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay,cleia)是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成磁珠包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入发光剂，酶催化和分解底物发光，计算出测定物的浓度。cleia将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。它是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫测定技术。cleia为科学研究、药物研发、疾病诊断、疗效评估及食品分析检测等提供了一种超微量的免疫检测手段。
3.由于cleia在应用过程中受到标记酶的生物活性，酶的稳定性以及固相载体对酶活和检测的影响。以往的研究着重于相关化学试剂和反应溶剂方面，而有关固相载体，比如磁珠颗粒表面特征对酶活以及检测的影响鲜有研究。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供了一种提高检测灵敏度和降低检测成本的苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用。
5.为了实现上述目的，本发明提供了一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用方法是在化学发光酶免疫分析中的应用。
6.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的聚合度在25000～118000mw。
7.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的聚合度为89000mw左右。
8.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物制成溶液的浓度为3-4％。
9.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物制成溶液的ph值在4～5之间。
10.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述化学发光酶免疫分析中的阻聚剂是浓度为1％、用量是10～20ul的二乙胺或其结构类似物。
11.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述化学发光酶免疫分析中的非离子表面活性剂是10-20ul的10％曲拉通100。
12.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述化学发光酶免疫分析中苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的反应温度是30～35℃，所述化学发光
酶免疫分析中苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的反应时间是30～40min。
13.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述化学发光酶免疫分析是基于纳米磁珠作为固相载体的化学发光酶免疫分析。
14.对本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用，所述纳米磁珠浓度为10mg/ml的20～30ul的纳米磁珠
15.综上所述，本发明具有如下优点：
16.苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物在化学发光酶免疫分析的应用过程中酶的稳定性以及固相载体对酶活和检测均有影响,比如固相载体磁珠颗粒表面特征对酶活以及检测都有影响，苯乙烯-马来酸酐共聚物作为芯片表面官能团可用于结合生物大分子，在表面等离子体共振方面可以作为比较理想的感光材料，本发明可以通过固相载体提升抗体的表面附着程度，标记酶的亲和力，检测复合体三维空间的稳定性以及反应的微环境，因而提升标记生物酶的活性和稳定性，进而提高检测灵敏度和降低检测成本。
17.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
18.图1是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用中苯乙烯-马来酸酐共聚物的结构示意图；
19.图2是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的实施例中sma聚合度和检测信号的示意图；
20.图3是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的实施例中sma浓度和检测信号的示意图；
21.图4是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用中实施例中sma溶液的ph值和检测信号的示意图；
22.图5是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的实施例中纳米磁珠的用量和检测信号的示意图；
23.图6是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的实施例中阻聚剂二乙胺的用量和检测信号的示意图；
24.图7是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的实施例中非离子型表面活性剂曲拉通100的用量和检测信号的示意图；
25.图8是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的实施例中反应温度和检测信号的示意图；
26.图9是本发明提供的一种苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物的应用的实施例中反应时间和检测信号的示意图。
具体实施方式
27.下面结合实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
28.实施例
29.一、sma修饰纳米磁珠，然后偶联捕获抗体；
30.二、第一步的磁珠抗体 样本 酶标记抗体35℃反应15min；
31.三、清洗2次；
32.四、底物35℃反应15min；
33.五、上化学发光检测仪读数。
34.在本实施例中，sma聚合程度对化学发光有较大的影响，选择不同sma的聚合度分别为6000wm、9100wm、25000wm、89000mw、118000mw和100000-500000mw，不同聚合度对于抗体的表面附着程度，标记酶的亲和力，检测复合体三维空间的稳定性以及反应的微环境有不同程度的影响。6000wm和9100wm因其聚合度低，无法使抗体牢固地附着在固相载体上，因而不能形成有效的酶促三维空间，构不成有效的酶促反应。sma聚合物100000-500000mw引其聚合度过高，容易形成空间位阻，使得附着和结合的稳定性和标记酶的微环境不利于酶促反应。比较理想的聚合度是从25000mw到118000mw，最佳的聚合度是89000mw左右，见图2。
35.在本实施例中，聚合度为89000mw的sma浓度在一定程度影响固相载体表面sma的厚度，三维空间结构的形成，官能团的密度和感光强度。用1％-8％sma处理的固相载体表面都可以检测到光学信号，浓度过低或过高都不利于cleia的检测，而最适的sma浓度是3～4％，见图3。
36.在本实施例中，sma溶液ph值从3.5到9都可以检测到光学信号，但是当ph高于5，检测信号随着ph值的升高而减小，当酸碱度高于7时会明显影响酸酐基的稳定性，进而影响抗体的结合能力及检测信号。最适的ph值是在4到5之间，见图4。
37.在本实施例中，需要确定纳米磁珠的最佳用量，从实验结果可以看出10～50ul的10mg/ml的纳米磁珠都可以给出信号，考虑到成本和检测的灵敏度，建议纳米磁珠的用量是20～30ul的10mg/ml，见图5。
38.在本实施例中，阻聚剂二乙胺或其结构类似物可以有效地结合sma聚合物中多余的酸酐集团，从而降低非特异性结合，增加检测的特异性和灵敏度。而且由于二乙胺的加入，可以有效打开sma里多余的酸酐基，进而增加载体表面的疏水性。从实验结果可以看出10ul及其以上1％二乙胺能够有效地提升化学发光信号，见图6。10～50ul二乙胺处理后检测到的化学信号没有明显的区别，预示sma里多余的酸酐基被充分打开。从检测成本和有效性考量，建议用10～20ul的1％二乙胺。
39.在本实施例中，表面去污剂sds，乳化剂吐温20和非离子型表面活性剂曲拉通100对于检测信号的影响不尽相同，当使用体积高于20ul时反而降低检测信号强度，低剂量时有利于检测到信号，其中非离子型表面活性剂曲拉通100的信号增强效果最佳，见图7。
40.在本实施例中，反应温度是决定生物酶学反应的重要因素之一，测试结果显示反应温度在25～45度均能检测到信号。最佳温度在30～35度，见图8。
41.在本实施例中，反应时间从10min开始即可检测到明显的信号，到30min左右接近峰值。考虑到检测的实效性，建议反应时间为30～40分钟左右，见图9。
42.苯乙烯-马来酸酐共聚物及其复合物在化学发光酶免疫分析的应用过程中酶的稳定性以及固相载体对酶活和检测均有影响,比如固相载体磁珠颗粒表面特征对酶活以及检测都有影响，苯乙烯-马来酸酐共聚物作为芯片表面官能团可用于结合生物大分子，在表面等离子体共振方面可以作为比较理想的感光材料，本发明中sma修饰的固相载体(比如纳米
磁珠)，可以提升抗体的表面附着程度，标记酶的亲和力，检测复合体三维空间的稳定性以及反应的微环境，因而提升标记生物酶的活性和稳定性，进而提高检测灵敏度和降低检测成本。
43.以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
44.在本发明中所有的描述中，需要理解的是，除非另外定义，否则本文中所用的术语具有与本发明所属领域的技术人员的通常所理解相同的含义。应进一步理解，术语应被解释为具有与其在相关技术以及本发明的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度形式化意义进行解释，除非本文中明确地这样定义。