一种双网络水凝胶及其制备方法与流程

1.本发明属于水凝胶材料领域，具体涉及一种双网络水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.皮肤作为人体组织中最大的器官，在日常生活中发挥着不可替代的作用。皮肤既参与了人体的日常代谢，也是人体的保护屏障，因此，维持人的皮肤完整健康是非常重要的。伤口敷料是一类对各种创伤和伤口表面进行临时覆盖的医用材料，其主要的功能是提供有利于伤口愈合的环境；保护伤口，控制伤口的渗出液，避免伤口受到外界细菌和灰尘的污染。相比于传统的干性敷料，水凝胶敷料具有更好的亲水性，能吸收伤口的渗出液同时保持伤口的湿润，不与伤口发生粘连，避免了伤口的二次损伤，能促进伤口更好地愈合，进一步改善创面的微环境，抑制细菌的生长及减轻患者的疼痛，因而非常适用于常见的体表损伤，如擦伤、划伤等。
3.传统的水凝胶材料，一般是通过交联作用制备而成的高分子材料单层网络的水凝胶由于结构单一，因此其力学性能受限。水凝胶的力学性能在实际应用中需要考虑的关键性能。因此，为了改善传统水凝胶在力学性能方面的缺陷，增强了水凝胶的交联强度，使水凝胶材料接近于人体软组织的性能，采用各种方法合成了新型复合水凝胶，例如双网络水凝胶、纳米复合水凝胶、疏水缔合水凝胶以及大分子微球复合水凝胶等。
4.双网络水凝胶是由两层聚合物网络相互作用形成的水凝胶。其中，第一层网络交联点密集，赋予了水凝胶足够的硬度，第二层网络疏松，链段柔软，赋予了水凝胶一定的可变形性，两层网络之间可以通过化学交联或者物理交联的方式结合在一起。当水凝胶受到外力作用时，第一层网络结构可以承受较大应力，而第二网络较为柔软，可变形性较强，可以吸收机械能，起到增韧的作用。因此，双网络水凝胶成为水凝胶材料的研究热点。尽管一些双网络水凝胶的设计和制备方面已经取得了一些成果，但这些制备方法往往制备工艺繁琐，合成步骤复杂，且制备过程耗时较长，往往需要高温或者通过紫外光的作用实现水凝胶的成功制备。这些复杂的工艺限制了水凝胶的生产与应用。同时，在合成过程中会引入大量的有机试剂或金属离子，来实现水凝胶网络结构的构建，这些试剂具有一定的细胞毒性，限制了水凝胶在生物医用材料领域的应用。因此，用一种简单、方便的方法制备生物相容性较好的水凝胶材料，使其应用于伤口敷料领域成为研究的巨大挑战和任务。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有双网络水凝胶的制备方法步骤复杂，耗时长以及需要引入大量具有细胞毒性的有机试剂或金属离子的技术问题，而提供了一种双网络水凝胶及其制备方法。
6.本发明的一种双网络水凝胶由聚丙烯酰胺和壳聚糖衍生物制备而成，所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖和壳寡糖中的一种或两种的混合物。
7.进一步限定，所述聚丙烯酰胺由丙烯酰胺和过硫酸铵制备而成。
8.进一步限定，所述丙烯酰胺与过硫酸铵的质量比为(100～200)：1。
9.进一步限定，所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖时，所述双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含量为5mg/ml～50mg/ml。
10.进一步限定，所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖和壳寡糖的混合物时，双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含量为2.5mg/ml～25mg/ml，壳寡糖的含量为0.1mg/ml～0.5mg/ml。
11.本发明的一种双网络水凝胶的制备方法按以下步骤进行：
12.步骤1：将丙烯酰胺溶于水，然后加入过硫酸铵，密封后加热搅拌反应，得到聚丙烯酰胺凝胶；
13.步骤2：将羧甲基壳聚糖溶于水，磁力搅拌至固体粉末完全溶解，得到羧甲基壳聚糖溶液，然后加入聚丙烯酰胺凝胶，室温下密封放置24h～48h，得到双网络水凝胶。
14.进一步限定，步骤1中所述丙烯酰胺的质量与水的体积的比为(2～3)g：25ml。
15.进一步限定，步骤1中所述丙烯酰胺与过硫酸铵的质量比为(100～200)：1。
16.进一步限定，步骤1中所述加热搅拌反应的参数为：温度为60～80℃，搅拌转速为100rpm～200rpm，时间为50min～70min。
17.进一步限定，步骤2中所述羧甲基壳聚糖的质量与水的体积的比为(0.25～2.5)g：25ml。
18.进一步限定，步骤2中所述羧甲基壳聚糖溶液与聚丙烯酰胺凝胶的体积比为1：(0.8～1.2)。
19.本发明的一种双网络水凝胶的制备方法按以下步骤进行：
20.步骤1：将丙烯酰胺溶于水，然后加入过硫酸铵，密封后加热搅拌反应，得到聚丙烯酰胺凝胶；
21.步骤2：将羧甲基壳聚糖溶于水，磁力搅拌至固体粉末完全溶解，得到羧甲基壳聚糖溶液，然后加入聚丙烯酰胺凝胶，室温下密封放置24h～48h，得到羧甲基壳聚糖双网络水凝胶；
22.步骤3：将壳寡糖粉末溶于水，得到壳寡糖溶液，然后加入步骤2得到的双网络水凝胶，混合均匀，室温下密封放置24h～48h，得到双网络水凝胶。
23.进一步限定，步骤1中所述丙烯酰胺的质量与水的体积的比为(2～3)g：25ml。
24.进一步限定，步骤1中所述丙烯酰胺与过硫酸铵的质量比为(100～200)：1。
25.进一步限定，步骤1中所述加热搅拌反应的参数为：温度为60～80℃，搅拌转速为100rpm～200rpm，时间为50min～70min。
26.进一步限定，步骤2中所述羧甲基壳聚糖的质量与水的体积的比为(0.25～2.5)g：25ml。
27.进一步限定，步骤2中所述羧甲基壳聚糖溶液与聚丙烯酰胺凝胶的体积比为1：(0.8～1.2)。
28.进一步限定，步骤3中所述壳寡糖粉末的质量与水的体积的比为(0.2～1)mg：1ml。
29.进一步限定，步骤3中所述壳寡糖溶液与羧甲基壳聚糖双网络水凝胶的体积比为1：(0.8～1.2)。
30.本发明相比现有技术的优点如下：
31.1)本发明的双网络水凝胶以聚丙烯酰胺作为第一网络结构，聚丙烯酰胺在制备
时，可以通过交联剂的含量、温度以及加水量控制成胶情况，无需复杂的改性处理；将羧甲基壳聚糖、壳寡糖混合溶液与聚丙烯酰胺凝胶混合，二者充分溶胀后可在常温下得到双网络水凝胶，成胶原理为：聚丙烯酰胺中的氨基与羧甲基壳聚糖中的羧基形成分子间氢键作用，壳寡糖结构中的氨基也可以通过分子间氢键作用于不同的分子链之间，原料之间的分子间氢键作用的形成说明双网络水凝胶的成功合成。
32.2)本发明制备方法简单便捷，常温下即可实现双网络水凝胶的交联反应，节约了能源。同时，在制备过程中，未添加有机试剂，省去了后期除杂的步骤。此外，羧甲基壳聚糖与壳寡糖具有良好的生物相容性，同时来源广泛，制备成本较低。
33.3)本发明的双网络水凝胶具有优异的机械性能，干凝胶拉伸强度为2
‑
14mpa，可以吸收超过水凝胶质量的10倍的水分，吸水性能优异，可以附着于伤口上，使人体活动更为方便。
34.4)本发明的双网络水凝胶采用羧甲基壳聚糖和壳寡糖复配，协同增效显著提高了抗菌性能，大肠杆菌的杀菌率超过80％，可以有效的阻止伤口表面的大肠杆菌的入侵，可以促进伤口更快的愈合。
附图说明
35.图1为实施例1
‑
3的双网络水凝胶的红外光谱图；
36.图2为实施例1
‑
3的双网络水凝胶的微观结构图；a
‑
实施例1，b
‑
实施例2，c
‑
实施例3；
37.图3为实施例1
‑
3的双网络水凝胶在ph＝7.4的pbs缓冲溶液的溶胀曲线；
38.图4为实施例2、6的双网络水凝胶的抗菌性能图；
39.图5为实施例2、6的双网络水凝胶的mtt实验结果图。
具体实施方式
40.实施例1、本实施例的一种双网络水凝胶由聚丙烯酰胺和壳聚糖衍生物制备而成，所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖，所述聚丙烯酰胺由丙烯酰胺和过硫酸铵制备而成，所述丙烯酰胺与过硫酸铵的质量比为50：0.3，所述双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含量为5mg/ml。
41.制备实施例1的双网络水凝胶的方法按以下步骤进行：
42.步骤1：将2.5g丙烯酰胺溶于25ml去离子水，然后加入0.015g过硫酸铵，密封后于70℃和150rpm的条件下加热搅拌反应60min，得到聚丙烯酰胺凝胶；
43.步骤2：将0.25g羧甲基壳聚糖溶于25ml去离子水，磁力搅拌至固体粉末完全溶解，得到羧甲基壳聚糖溶液，然后加入与羧甲基壳聚糖溶液等体积的聚丙烯酰胺凝胶，室温下密封放置48h，得到双网络水凝胶。
44.实施例2、本实施例与实施例1不同的是：所述双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含量为25mg/ml；步骤2：将1.25g羧甲基壳聚糖溶于25ml去离子水，磁力搅拌至固体粉末完全溶解，得到羧甲基壳聚糖溶液，然后加入与羧甲基壳聚糖溶液等体积的聚丙烯酰胺凝胶，室温下密封放置48h，得到双网络水凝胶。
45.实施例3、本实施例与实施例1不同的是：所述双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含
量为50mg/ml；步骤2：将2.5g羧甲基壳聚糖溶于25ml去离子水，磁力搅拌至固体粉末完全溶解，得到羧甲基壳聚糖溶液，然后加入与羧甲基壳聚糖溶液等体积的聚丙烯酰胺凝胶，室温下密封放置48h，得到双网络水凝胶。
46.实施例4、本实施例的一种双网络水凝胶由聚丙烯酰胺和壳聚糖衍生物制备而成，所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖和壳寡糖的混合物，所述聚丙烯酰胺由丙烯酰胺和过硫酸铵制备而成，所述丙烯酰胺与过硫酸铵的质量比为50：0.3，所述双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含量为12.5mg/ml，壳寡糖的含量为0.1mg/ml。
47.制备实施例4的双网络水凝胶的方法按以下步骤进行：
48.步骤1：将2.5g丙烯酰胺溶于25ml去离子水，然后加入0.015g过硫酸铵，密封后于70℃和150rpm的条件下加热搅拌反应60min，得到聚丙烯酰胺凝胶；
49.步骤2：将1.25g羧甲基壳聚糖溶于25ml去离子水，磁力搅拌至固体粉末完全溶解，得到羧甲基壳聚糖溶液，然后加入与羧甲基壳聚糖溶液等体积的聚丙烯酰胺凝胶，室温下密封放置48h，得到羧甲基壳聚糖双网络水凝胶；
50.步骤3：将2mg壳寡糖粉末溶于10ml去离子水，得到壳寡糖溶液，然后加入与壳寡糖溶液等体积的步骤2得到的羧甲基壳聚糖双网络水凝胶，混合均匀，室温下密封放置48h，得到双网络水凝胶。
51.实施例5、本实施例与实施例4不同的是：所述双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含量为12.5mg/ml，壳寡糖的含量为0.3mg/ml；步骤3：将6mg壳寡糖粉末溶于10ml去离子水，得到壳寡糖溶液，然后加入与壳寡糖溶液等体积的步骤2得到的羧甲基壳聚糖双网络水凝胶，混合均匀，室温下密封放置48h，得到双网络水凝胶。
52.实施例6、本实施例与实施例4不同的是：所述双网络水凝胶中羧甲基壳聚糖的含量为12.5mg/ml，壳寡糖的含量为0.5mg/ml；步骤3：将10mg壳寡糖粉末溶于10ml去离子水，得到壳寡糖溶液，然后加入与壳寡糖溶液等体积的步骤2得到的羧甲基壳聚糖双网络水凝胶，混合均匀，室温下密封放置48h，得到双网络水凝胶。
53.检测试验：
54.试验一、红外表征：
55.图1为实施例1
‑
3所得双网络水凝胶的红外光谱表征。由图1可以看出，在3300
‑
3500cm
‑1之间可以观察到
‑
nh2的伸缩振动峰。当cmc含量增多时，
‑
nh2从3473cm
‑1移动至3443、3447以及3421cm
‑1处。而1600cm
‑1处的
‑
coo
‑
拉伸振动峰从1616cm
‑1移动至1654、1672和1689cm
‑1处。因此，通过红外光谱图结果可知，pam与cmcs分子之间的氢键作用，使得
‑
n
‑
h和
‑
c
‑
o的特征峰发生了变化，从图1中也可以观察到形成的双网络水凝胶没有出现新的吸收峰，说明双网络水凝胶的成功制备。
56.试验二、微观结构测试：
57.将实施例1
‑
3所得的双网络水凝胶经液氮预冻后，置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，将冻干后的样品用导电胶固定，进行喷金，之后通过扫描电子显微镜来观察水凝胶的微观形貌，如图2所示。
58.由图2可以看出，当cmcs含量较少时，水凝胶呈现平面多孔结构，这是由于此时的水凝胶中pam含量较多，因此此时凝胶结构中大部分是pam交联产生的3d网络结构。而随着cmcs的含量增加，水凝胶开始呈现层状微观结构：当cmcs含量为5％时，平面结构已经开始
出现弯曲不平的趋势，而10％cmcs
‑
pam可以清晰地观察到层状结构。结果表明，cmcs的加入使pam的形态由三维孔隙结构转变为层状结构。平面结构到立体结构的转变说明cmcs已经完全嵌入和分散到pam基体中。
59.试验三、溶胀性能测试：
60.将实施例1
‑
3所得双网络水凝胶冻干样品，先称取其质量记为m0，浸泡于pbs溶液中，置于25℃和50hz的恒温振荡摇床中进行溶胀实验，模拟人体的环境。溶胀后的水凝胶分别于5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h取出，并立即用滤纸吸去表面水分并再次称量水凝胶的质量m1。根据公式sr＝(m1‑
m0)/m0计算溶胀度，如图3所示。
61.从图3中可以看出，在刚开始发生溶胀时，水凝胶内可以吸收大量的水分，因此溶胀速度较快，随着时间的增加，水凝胶网络内吸水量逐渐达到饱和，因此溶胀速度开始下降，当溶胀时间达到24h，溶胀度稍有下降，这可能是一些水凝胶内未参与交联的部分溶解在pbs溶液中的原因。当羧甲基壳聚糖含量增加时，水凝胶的溶胀度增加，这是由于羧甲基壳聚糖中含有大量的亲水基团，可以吸收更多的水分，使得其溶胀性能提高。
62.试验四：抗菌性能测试：
63.分别向含有9ml浓度为106cfu/ml的细菌悬液的试管中加入1ml的实施例2、6的双网络水凝胶样品，混匀后在37℃下培养24h。对照组为10ml不加任何样品的细菌悬液。分别从各个试管中取出2ml的细菌悬液，通过紫外可见分光光度计在波长600nm出测试细菌悬液的吸光度，结果如图4所示。
64.从图4中可以看出，在24h内壳寡糖缓慢向外释放，使得细菌的生存率下降。壳寡糖是一类带正电荷的多糖物质，其结构中的氨基正离子可以与带负电的细胞膜发生静电相互作用，影响细菌的蛋白质合成，进而抑制了大肠杆菌的生存。一部分通过氢键作用被包括在羧甲基壳聚糖分子链中的壳寡糖可以发挥其抗菌作用。实验结果说明，双网络水凝胶对药物的吸附作用不会影响药物的释放性能及其发挥生物活性，并且抗菌药物的加入可以防止伤口的细菌感染，加快愈合速度。同时，由于载药过程温和可控，可以考虑负载更多的功能性药物，使其发挥特定的功能。
65.试验五、mtt测试：
66.具体试验方法如下：
67.(1)细胞培养：将对数生长期的l929细胞加入胰酶进行消化，得到细胞悬浮液，将悬浮液接种于96孔板中，接种体积为200μl，在37℃，5％co2的条件下培养过夜，使细胞贴壁生长；
68.(2)水凝胶浸提液的制备：按照10mg实施例2、6的双网络水凝胶样品加入1ml培养基的比例，向双网络水凝胶样品中加入1640培养基，配置成浓度为10mg/ml的溶液，在37℃下浸泡24h，得到水凝胶浸提液；
69.(3)将mtt固体与pbs溶液混合，配置成5mg/ml的溶液，再加入1640培养基进行稀释，得到0.5mg/ml的mtt溶液；
70.(4)将10mg/ml的水凝胶浸提液分别稀释为7.5mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml，将96孔板中的培养基弃去，加入200μl稀释后不同浓度的水凝胶浸提液，每个浓度设置6个复孔，同时设置对照组为加入200μl的1640培养基，在37℃，5％co2的培养条件下继续培养24h，然后吸除96孔板中的水凝胶浸提液，加入步骤(3)得到的0.5mg/ml的mtt溶液
200μl，在37℃下培养4h，然后吸去孔中液体，终止培养，再向每个孔中加入150μl的dmso，孵育10min，通过酶标仪测量492nm处每孔的吸光值，计算细胞存活率，得到试验结果如图5所示。
71.从图5中可以看出，即使是高浓度的水凝胶浸提液细胞的存活率也高于90％，因此可以认为双网络水凝胶无细胞毒性；同时，从测试结果中还可以进一步观察到加入壳寡糖之后，细胞的存活率大于100％，这可能是壳寡糖对细胞的增殖作用造成的，因此，当实施例6的双网络水凝胶作为伤口敷料时，壳寡糖的存在可以促进l929细胞的增殖，使得伤口的恢复速度加快。
72.试验六、机械性能测试：
73.具体试验方法如下：作为医用敷料，材料的拉伸强度和断裂伸长率是反映其塑性的关键指标，足够的拉伸强度有利于材料在使用中较好的保持其原有的形貌和结构完整性。根据gb13022
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1991的测试方法进行，使用万能力学材料试验机进行测定，将复合膜切割成40mm
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20mm的矩形进行试验，使用试验夹具固定材料，使上下夹具间的距离为20mm进行测试，以0.1mm/min的速度进行拉伸实验，根据最大拉伸力和位移计算出复合膜的抗拉强度和断裂伸长率，从测试结果中发现，双网络水凝胶在干燥状态下得到的干凝胶拉伸强度为2
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14mpa，拉伸强度较大，高于单网络结构的水凝胶，可以更好的进行应用。