高产L-2-氨基丁酸的基因工程菌、构建方法及应用

高产l-2-氨基丁酸的基因工程菌、构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种高产l-2-氨基丁酸的基因工程菌、构建方法及应用。


背景技术：

2.2-氨基丁酸 （2-aminobutyrate），是四碳脂肪族氨基酸，有两种光学异构体，分别为d-2-氨基丁酸和l-2-氨基丁酸，其中天然分布并存在于动植物组织中的是l-2-氨基丁酸 （l-2-aminobutyric acid），简称l-aba。l-aba的分子式为c4h9no2，相对分子量为103.12，熔点为270-280 oc，在25 oc下每100 g水中可溶解22.7 g、等电点为6.05，微溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，为无臭、微甜的白色片状晶体，是一种非蛋白质手性α-氨基酸。
3.作为重要的化工原料和医药前体，l-aba广泛应用于化工和医药行业，用于化学品和药物的合成。l-aba可经酰胺化作用生成 （s）-2-氨基丁酰胺 （（s）-2-aminobutyramid），是制备抗癫痫药物布瓦西坦 （brivaracetam） 和左乙拉西坦 （levetiracetam, lev） 的关键中间体，也可经过末端羧基的还原来合成 （s）-2-氨基丁醇 （（s）-2-aminobutanol），用于制备抗结核药物乙胺丁醇 （ethambutol）。左乙拉西坦，属吡咯烷酮衍生物，为吡拉西坦 （piracetam） 类似物，是一种新型抗癫痫药物，左乙拉西坦因其独特的抗癫痫机制，较强的药物代谢动力学特性、耐受性，高效安全的临床效果已经成为目前最有应用前景的新型抗癫痫药物之一。乙胺丁醇具有抑菌抗结核的作用，主要作用于人型及牛型的结核杆菌，抑制其核糖核酸的合成，同时对其他分枝杆菌也有较好的抑制效果。但单独使用乙胺丁醇时，会导致细菌的耐药性迅速产生，故应与其它的抗结核药物配合使用，临床上主要应用于肺结核以及结核性脑膜炎的治疗。
4.随着国际市场对左乙拉西坦、布瓦西坦以及乙胺丁醇等药物的需求不断增长，作为这些药物合成的关键中间体l-aba的需求量也日益增加，l-aba的生产受到越来越多的关注。化学法和生物法是合成l-aba的主要途径，化学法包括脱硫反应法、2-kb还原法、α-卤代酸的氨解法以及氨化水解法等，生物法包括微生物发酵法和酶催化法等。
5.近年来，生物法合成l-aba受到广泛关注，和化学法相比较，生物法有着明显的优势，如催化剂立体选择性强、催化效率高、原料来源广泛且价格便宜、反应条件温和以及绿色环保等，具有非常广阔的应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的目的是通过代谢工程技术，提供一株具有高产l-2-氨基丁酸能力的基因工程菌及其构建方法，以及该工程菌在微生物发酵制备l-2-氨基丁酸中的应用。
7.本发明采用的技术方案是：高产l-2-氨基丁酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：（1）以e.coli 19031为底盘菌，将菌株19031基因组中的ilvih基因用来源于t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh替换，得到重组菌株19031ilvih::leudh，记为19031-1；（2）将菌株19031ilvih::leudh基因组中的ptsg基因用解除l-异亮氨酸反馈抑制
的ilva
*
替换，得到重组菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
，记为19031-2；（3）将菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
基因组中的rhta基因用来自t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh替换，得到重组菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
/rhta::leudh，记为19031-3；（4）将菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
/rhta::leudh基因组中的laci基因敲除，得到重组菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
/rhta::leudh /
△
laci，记为19031-4，即所述高产l-2-氨基丁酸的基因工程菌。
8.所述底盘菌e.coli 19031可由如下方法构建获得：（1）以escherichia.coli w3110为出发菌株，将菌株escherichia.coli w3110基因组中的thra基因用thra突变基因（c1034t，s345f）替换，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
*
，记为thr1；（2）将菌株thr1基因组中lysc基因用lysc突变基因（c1055t，t342i），得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
*
/lysc
*
记为thr2；（3）将菌株thr2基因组中thrabc基因启动子替换为tac启动子，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
*
/lysc
*
/tac-thrabc记为thr3；（4）将菌株thr3基因组中lysa基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
*
/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa，记为thr4；（5）将菌株thr4基因组中meta基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
*
/lysc
*
/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta，记为thr5；（6）将菌株dpa5基因组中tdh基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh，记为thr6；（7）将菌株dpa6基因组中ilcr基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh/ilcr，记为thr7；（8）将菌株thr7基因组中的ppc基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh/ilcr/trc-ppc，记为thr8，即所述e.coli 19031。
9.本发明通过：（1）对大肠杆菌的l-2-氨基丁酸合成途径相关基因进行了编辑，并采用crispr-cas9基因编辑技术将基因组上合成l-2-氨基丁酸相关基因ilvih用来源于t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh基因进行替换，使大肠杆菌无需质粒也能发酵生产l-2-氨基丁酸；（2） 使用crispr-cas9基因编辑技术将与葡糖糖的磷酸酶转移系统（pts）相关基因ptsg基因用解除l-异亮氨酸反馈抑制的ilva
*
替换，ptsg基因的缺失减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，增加丙酮酸的积累，使反应更多的向tca循环进行，ilva
*
基因提高了苏氨酸的分解代谢能力，增加了α-酮丁酸的产生；（3） 使用crispr-cas9基因编辑技术将基因组中l-苏氨酸转运相关基因rhta用来源于t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh替换，进一步加强了大肠杆菌自身对l-2-氨基丁酸的合成能力，同时也减少了l-苏氨酸的外运，增加了l-苏氨酸的积累；（4）使用crispr-cas9基因编辑技术将基因laci敲除，最终构建一株更高产的l-2-氨基丁酸发酵生产基因工程菌——19031-4。（5）对19031-4号菌株进行5l发酵罐的扩大扩大培养，产量进一步提升至10.86g/l。
10.本发明还涉及所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
（1） 以escherichia.coli w3110为出发菌株，将菌株escherichia.coli w3110基因组中的thra基因用thra突变基因（c1034t，s345f）替换，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
*
，记为thr1；（2） 将菌株thr1基因组中lysc基因用lysc突变基因（c1055t，t342i），得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
*
/lysc
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记为thr2；（3） 将菌株thr2基因组中thrabc基因启动子替换为tac启动子，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
*
/lysc
*
/tac-thrabc记为thr3；（4） 将菌株thr3基因组中lysa基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
*
/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa，记为thr4；（5） 将菌株thr4基因组中meta基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta，记为thr5；（6） 将菌株dpa5基因组中tdh基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh，记为thr6；（7） 将菌株dpa6基因组中ilcr基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh/ilcr，记为thr7；（8） 将菌株thr7基因组中的ppc基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh/ilcr/trc-ppc，记为thr8，即e.coli 19031；（9） 以e.coli 19031为底盘菌，运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株19031基因组中的ilvih基因用来源于t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh基因替换，得到重组菌株19031ilvih::leudh，记为19031-1；（10）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株19031ilvih::leudh基因组中的ptsg基因用解除l-异亮氨酸反馈抑制的ilva
*
替换，得到重组菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
，记为19031-2；（11）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
基因组中的rhta基因用来自t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh替换，得到重组菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
/rhta::leudh，记为19031-3；（12）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
/rhta::leudh基因组中的laci基因敲除，得到重组菌株19031ilvih::leudh /ptsg:: ilva
*
/rhta::leudh /
△
laci，记为19031-4，即所述高产l-2-氨基丁酸的基因工程菌。
11.优选的，所述tac启动子核苷酸序列如seq id no.1所示，所述trc启动子核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.优选的，所述thra突变基因序列如seq id no.5所示，所述lysc突变基因序列如seq id no.4所示，所述leudh基因序列如seq id no.7所示，所述ilva
*
基因序列如seq id no.8所示。
13.本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备l-2-氨基丁酸中的应用。
14.具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于30～37℃、150～300rpm条件下进行发酵培养至od
600
＝10～30时，添加终浓度为0.1mm的iptg，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到l-2-氨基丁酸。
15.所述发酵培养基组成如下：葡萄糖30~50 g/l，酵母粉5~8 g/l，硫酸镁 1~3g/l，磷酸氢二钾 3~4g/l，硫酸铵10~20g/l，甜菜碱盐酸盐0.5~1.5g/l，l-蛋氨酸 0.05~0.5 g/l，l-赖氨酸 0.05~0.5g/l，金属盐离子溶液 1~5 ml/l，碳酸钙 20~30g/l，溶剂为水，ph值自然；金属盐离子溶液组成为：feso4·
7h2o 10g/l，cacl
2 1.35g/l，znso4·
7h2o 2.25g/l，mnso4·
4h2o 0.5g/l，cuso4·
5h2o 1g/l，（nh4）6mo7o
24
·
4h2o 0.106g/l，na2b4o7·
10h2o 0.23g/l，35% hcl 10ml/l，溶剂为水。
16.优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖50g/l，酵母粉6g/l，硫酸镁 2g/l，磷酸氢二钾 4g/l，硫酸铵 14g/l，甜菜碱盐酸盐 1g/l，l-蛋氨酸 0.149 g/l，l-赖氨酸 0.164 g/l，金属盐离子溶液 5ml，caco
3 30g/l，溶剂为水。
17.通常，所述基因工程菌株发酵前，先接种至lb培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。
18.本发明的有益效果主要体现在：本发明通过对大肠杆菌的l-2-氨基丁酸合成途径相关基因进行了编辑，将基因组上合成l-2-氨基丁酸相关基因ilvih用来源于t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh基因进行替换，使大肠杆菌无需质粒也能发酵生产l-2-氨基丁酸，将与葡糖糖的磷酸酶转移系统（pts）相关基因ptsg基因用解除l-异亮氨酸反馈抑制的ilva
*
替换，ptsg基因的缺失减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，增加丙酮酸的积累，使反应更多的向tca循环进行，ilva
*
基因提高了苏氨酸的分解代谢能力，增加了α-酮丁酸的产生，将基因组中l-苏氨酸转运相关基因rhta用来源于t. intermedius的亮氨酸脱氢酶leudh替换，进一步加强了大肠杆菌自身对l-2-氨基丁酸的合成能力，同时也减少了l-苏氨酸的外运，增加了l-苏氨酸的积累，最后敲除阻遏蛋白编码基因laci，最终获得更高产l-2-氨基丁酸工程菌，在无需质粒引物外源酶增强关键酶酶活，无诱导剂添加的情况下， 5l发酵罐分批补料发酵产量达到10.86g/l。
附图说明
19.图1为实施例2发酵结果od 600 及发酵液上清中的l-2-氨基丁酸含量；图2为实施例3发酵结果od 600 及发酵液上清中的l-2-氨基丁酸含量；图3为实施例4发酵结果od 600 及发酵液上清中的l-2-氨基丁酸含量；图4为实施例5发酵结果od 600 及发酵液上清中的l-2-氨基丁酸含量。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/l，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/l。
21.菌株escherichia.coli w3110来自耶鲁大学cgsc保藏中心（coli genetic stockcenter），保藏日期1975年8月5日，保藏编号cgsc#4474，已在专利us 2009/0298135 a1，us2010/0248311a1中公开。
22.本发明所述亲本菌株e.coli 19031来自实验室保藏，为e.coliw3110衍生物，其基因型为下列描述（e.coliw3110/thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh/ilcr/
trc-ppc）实施例2～5中使用的引物序列信息如表1所示：表1：引物序列pt-x-f/r为ptatget质粒的突变引物，其中x为携带基因组的目的基因所含pam位点 （ngg）前20bp序列；x p1/p2为目的基因的上游同源臂上下游引物；ptd-x p3/p4为目的
基因的下游同源臂上下游引物；x vf/vr为编辑目的基因的验证引物。
23.hplc法测定发酵液中l-2-氨基丁酸含量：样品处理：取1 ml发酵液，室温，12000 rpm离心1 min，上清稀释适当倍数，保持d-泛酸含量在0.1g/l到2.0g/l之间；色谱条件：色谱柱为c18柱（150
ꢀ×ꢀ
4.6 mm），柱温33 o
c，流速1 ml/min，采用梯度洗脱，进样量为10 μl，检测波长为360 nm。
24.表2：梯度洗脱程序流动相：流动相a：50%乙腈，流动相b：称量4.1 g无水乙酸钠溶于800 ml去离子水中，用乙酸调ph至6.4，然后用去离子水定容至1 l。
25.数据采集时间：30min。
26.实施例1：底盘菌19031的构建所述底盘菌e.coli 19031由如下方法构建获得：（1）以escherichia.coli w3110为出发菌株，运用crispr-cas9基因编辑技术，将出发菌株escherichia.coli w3110基因组中的thra基因用thra突变基因（c1034t，s345f）（seq id no.5）替换，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
*
，记为thr1；（2）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株thr1基因组中lysc基因用lysc突变基因（c1055t，t342i）（seq id no.4），得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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记为thr2；（3）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株thr2基因组中thrabc基因启动子替换为tac启动子（seq id no.1），得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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/tac-thrabc记为thr3；（4）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株thr3基因组中lysa基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
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lysa，记为thr4；（5）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株thr4基因组中meta基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
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lysa/
△
meta，记为thr5；（6）运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株dpa5基因组中tdh基因敲除，得到重组
菌株escherichia.coli w3110/ thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
△
lysa/
△
meta/
△
tdh，记为thr6；（7） 运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株dpa6基因组中ilcr基因敲除，得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
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lysa/
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meta/
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tdh/ilcr，记为thr7；（8） 运用crispr-cas9基因编辑技术，将菌株thr7基因组中的ppc基因的启动子替换为trc启动子（seq id no.2），得到重组菌株escherichia.coli w3110/thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
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lysa/
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meta/
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tdh/ilcr/trc-ppc，记为thr8，记为19031。
27.实施例2：leudh基因替换ilvih基因的菌株19031-1的构建及发酵以基因工程菌19031（即e.coli w3110 thra
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/lysc
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/tac-thrabc/
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lysa/
△
meta/
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tdh/ilcr/trc-ppc）为出发菌株，使用crispr-cas9 介导的基因编辑技术（yujiang et al.2015multigene editing in the escherichia coli genome via thecrispr-cas9 system.applied environmental microbiology.81:2506-2514），在基因组上用leudh基因（seq id no.7）替换ilvih基因（seq id no.6），使大肠杆菌无需质粒也能发酵生产l-2-氨基丁酸：（1）构建ptarget-ilvih：：leudh质粒：以ptarget f质粒（addgene plasmid#62226）为模版，以 pt-ilvih：：leudh f/pt-ilvih：：leudh r为引物pcr扩增，得到的pcr产物经过dpn i在37℃保温消化30min，再转化到e.coli dh5α化转感受态中，壮观霉素（sd）平板筛选，测序验证获得正确的ptarget-ilvih：：leudh质粒，用于后续连接donor dna。
28.（2）构建ptd-ilvih：：leudh质粒：以e.coli w3110基因组为模版，ilvih：：leudh p1与ilvih：：leudh p2为引物扩增获得donor dna的上游同源臂记为l，ilvih：：leudh p3和ilvih：：leudh p4为引物扩增获得donor dna的下游同源臂记为r，ilvih：：leudh p5和ilvih：：leudh p6为引物扩增获得donor dna leudh基因记为d，clean up试剂盒回收dna片段得到同源臂a，c和donor dna b；ptarget-ilvih：：leudh质粒以pt d cfcom和pt d crcom为引物pcr扩增，得到的pcr产物经过dpn i在37℃保温消化1-2h ，clean up试剂盒回收dna片段；按照 （one step clone kit，vazyme biotech，nanjing，china）说明书将ptarget-ilvih：：leudh 质粒、同源臂a c、donor dna b连接在一起，导入e.coli dh5α化转感受态中，菌落pcr筛选阳性克隆子，通过测序验证得到ptd-ilvih：：leudh质粒。
29.（3）将pcas质粒（addgene plasmid#62225）导入19031化转感受态中，挑取阳性克隆转接到含0.05mg/l卡那霉素的lb试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50ml lb培养基的250ml摇瓶中，并加入500μl 1mol/l的l-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养od 600 至0.4～0.6；于4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见（molecular cloning:a laboratory manual，3ed edition，99-102）的描述。
30.（4）取200～500ng ptd-ilvih：：leudh质粒与100-200μl电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm 电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪（micropluser tm ，bio-rad）进行电击转化，电击完成后立即加入预冷的1ml lb培养基并立即吸出，转移到2mlep管中，30℃复苏3～4h 后涂布含0.05mg/l卡那霉素和0.05mg/l壮观霉素的lb平板，37℃倒置培养14～18h，以ilvih：：leudh vf和ilvih：：leudh vr为验证引物进行菌落pcr验证，若能成功克隆出一段1500左右的片段，并测序验证成功则证明该单菌落是19031/ilvih：：leudh的阳性菌落，
即编辑成功，得到新的菌株19031-1。
31.（5）质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mm iptg和0.05mg/l卡那霉素的lb试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/l卡那霉素的lb平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/l壮观霉素的lb平板，不能在含0.05mg/l壮观霉素的lb平板的单菌落其ptarget-ilvih：：leudh质粒成功消除，挑取ptarget-ilvih：：leudh质粒成功消除的单菌落于lb试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于lb平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/l卡那霉素的lb平板，不能在含0.05mg/l卡那霉素的lb平板的单菌落其pcas质粒成功消除，最终得到无质粒菌株19031/ilvih：：leudh （简称19031-1）。
32.lb培养基：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l nacl，溶剂为去离子水，ph值自然。
33.tpm发酵培养基：葡萄糖50g/l，酵母粉6g/l，硫酸镁 2g/l，磷酸氢二钾 4g/l，硫酸铵 14g/l，甜菜碱盐酸盐 1g/l，l-蛋氨酸 0.149 g/l，l-赖氨酸 0.164 g/l，金属盐离子溶液 5ml，caco3 30g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；金属盐离子溶液:feso4·
7h2o 10g/l，cacl
2 1.35g/l，znso4·
7h2o 2.25g/l，mnso4·
4h2o 0.5g/l，cuso4·
5h2o 1g/l，（nh4）6mo7o
24
·
4h2o 0.106g/l，na2b4o7·
10h2o 0.23g/l，35% hcl 10ml，溶剂为去离子水。
34.（6）将构建的19031-1菌株从甘油管中划线到lb平板，挑取单菌落接种到10ml的lb培养基中，以野生型菌株e.coli w3110（de3）为对照，37℃、200rpm培养用作种子液； 8～12h后，接种1ml种子液到装有30ml的tpm发酵培养基的250ml摇瓶中，然后在35℃、 200rpm培养发酵至菌株生长到od 600 ＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mm的iptg，继续培养至48h；发酵结束后取1ml发酵液测定od 600 ，取1ml发酵液，12000rpm室温离心2min，将发酵上清稀释5～10倍，根据前述方法进行hplc检测l-2-氨基丁酸含量，分光光度计检测od 600 确定菌株生长情况，结果见图1。
35.由图1可见，利用基因编辑手段外源加入亮氨酸脱氢酶基因leudh替换ilvih基因，19031-1菌株的生长无明显抑制作用，但能使大肠杆菌在无质粒情况下发酵生产l-2-氨基丁酸，使得l-2-氨基丁酸效价从0g/l增加到3.35g/l，这说明leudh基因的基因组替换使大肠杆菌有了l-2-氨基丁酸的合成能力。
36.实施例3：ilva
*
基因替换ptsg基因的菌株19031-2的构建及发酵（1）构建ptarget-ptsg：：ilva
*
质粒：以ptarget f质粒（addgene plasmid#62226）为模版，以 ptarget-ptsg：：ilva
* f/ ptarget-ptsg：：ilva
* r为引物pcr扩增，得到的pcr产物经过dpn i在37℃保温消化30min，再转化到e.coli dh5α化转感受态中，壮观霉素（sd）平板筛选，测序验证获得正确的ptarget-ptsg：：ilva
*
质粒，用于后续连接donor dna。
37.（2）构建ptd-ptsg：：ilva
*
质粒：以e.coli w3110基因组为模版，ptsg：：ilva
* p1、 ptsg：：ilva
* p2、 ptsg：：ilva
* p3、ptsg：：ilva
*
p4、 ptsg：：ilva
* p5和ptsg：：ilva
* p6为引物。构建步骤同实施例2（2），得到ptd-ptsg：：ilva
*
质粒。
38.（3） 将pcas质粒（addgene plasmid#62225）导入实施例2获得的菌株19031-1感受态中，菌株19031-1感受态制备方法同实施例2（3）。
39.（4） 构建得到菌株19031-2阳性菌落，构建方法同实施例2（4）。
40.（5） 质粒消除：实施方法同实施例2（5），获得无质粒菌株19031-2。
41.（6） 摇瓶发酵：将构建的菌株19031-2生产菌株从甘油管中划线到lb平板，挑取单
2-氨基丁酸含量如图4所示。
56.由图4可见，在菌株19031-3基因组上利用基因编辑手段敲除laci基因（seq id no.10），构建得到菌株19031-4，发酵结果显示，敲除laci基因后，菌株的生长有略微改善，19031-4的l-2-氨基丁酸产量10.86g/l，这说明敲除laci基因对菌株的生产产生了一定影响，但发酵过程中无需诱导剂添加。