椿乳凝胶在制备抗低危HPV感染和防治低危HPV相关疾病的药物中的应用的制作方法

椿乳凝胶在制备抗低危hpv感染和防治低危hpv相关疾病的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及椿乳凝胶在制备抗低危hpv感染和防治低危hpv相关疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，hpv)是一种球形双链dna病毒，其基因组序列全长约为7900bp。目前已有160多种不同的hpv病毒亚型被检测出来，主要通过性行为传播到生殖器及其周围皮肤。
3.研究报道，不同的hpv亚型可引起不同的临床疾病，根据疾病的严重程度，可大体分为低危亚型和高危亚型。低危型hpv，又称非癌相关型，主要包括hpv6、11、13、42、43、44、53和54等，可认为这类hpv的感染主要引起寻常疣、尖锐湿疣、复发性呼吸道乳头状瘤等良性皮肤疾病，不会直接诱导宫颈癌、阴茎癌等恶性肿瘤的发生。高危型hpv，又称恶性肿瘤相关类型，包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和61等，一般认为这类hpv感染主要引起宫颈癌、阴茎癌等恶性上皮肿瘤。hpv病毒已经是最常见的生殖道病毒，但大多数hpv病毒都能被受感染者机体的免疫系统消灭掉，只有极个别亚型会持续性地感染宿主，并最终会进展成为尖锐湿疣、癌前病变、乃至恶性肿瘤。最近几年，hpv感染相关疾病的发病率和死亡率在世界范围内，尤其是亚非拉美国家逐年上升，且发病年龄有年轻化趋势。
4.在性传播疾病的防治过程中，低危型人乳头状瘤病毒hpv6和hpv11是两类重要的致病病毒，特异感染肛门生殖器部位上皮中的角质形成细胞，引起细胞异常增生和出现肉质赘生物。由于感染部位及皮肤生理状态的不同，而有不同的病理变化，其中最典型的是尖锐湿疣，该病多发生于生殖器和肛门周围。尖锐湿疣的皮损初起可以仅为细小的单个淡红色丘疹，常无自觉症状，后来逐渐体积和数量慢慢增大增多。本病容易复发，一般认为复发的原因除了病灶切除不彻底和患者的局部免疫力低下之外，主要与hpv病毒颗粒未能得到有效清除有关。虽然多数研究认为采用传统物理手段切除病灶并辅助以抗病毒治疗的综合疗法将可以有效控制尖锐湿疣的发展和复发，但目前仍然缺乏十分有效的抗病毒治疗药物，因此只能降低复发率，缺乏早期控制尖锐湿疣的药物。且现有的抑制高危型hpv的药物如瑞贝生等，仅为高危型hpv抑制剂，缺乏专门针对低危型hpv的药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供椿乳凝胶在制备抗低危hpv感染和防治低危hpv相关疾病的药物中的应用。
6.本发明的目的是提供有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片的中药组合物在制备抗低危型hpv病毒和/或治疗低危型hpv病毒引起的疾病的药物中的应用。
7.一种中药组合物在制备抗低危型hpv病毒的药物中的应用，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片。
8.优选地，所述抗低危型hpv病毒为抑制低危型hpv病毒复制和/或增殖。
9.优选地，所述抗低危型hpv病毒为抑制低危型hpv病毒感染。
10.优选地，所述抗低危型hpv病毒为恢复低危型hpv宿主细胞环境ph失调和/或减轻低危型hpv病毒感染导致的宫颈组织病变。
11.更优选地，抑制低危型hpv的mrna表达、抑制低危型hpv的蛋白表达或恢复低危型hpv宿主细胞周期失调中的一种或几种。
12.更优选地，所述抑制低危型hpv病毒感染包括降低低危型hpv病毒感染力和/或降低低危型hpv病毒在组织中的滴度。
13.一种中药组合物在制备治疗低危型hpv病毒引起的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片。
14.优选地，所述治疗低危型hpv病毒引起的疾病为减轻宫颈组织病变、恢复低危型hpv宿主细胞周期失调或恢复低危型hpv宿主细胞环境ph失调中的一种或几种。
15.优选地，所述疾病为尖锐湿疣。
16.更优选地，所述尖锐湿疣为早期尖锐湿疣。
17.优选地，所述低危型hpv病毒为hpv6、hpv11、hpv13、hpv42、hpv43、hpv44、hpv53和/或hpv54中的一种或几种。
18.更优选地，所述低危型hpv病毒为hpv6和/或hpv11。
19.优选地，所述中药组合物含有以下重量份的组分：椿皮：35～45；苦参：25～35；牡丹皮：25～35；乳香：25～35；冰片：0.8～1.2，其中苦参和牡丹皮、乳香等量。
20.更优选地，所述中药组合物含有以下重量份的组分：椿皮：40；苦参：30；牡丹皮：30；乳香：30；冰片：1。
21.更优选地，所述中药组合物制成凝胶剂。
22.更优选地，所述中药组合物的凝胶剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
23.s1：椿皮加2～9倍量水，加水煎煮1～3次，每次煎煮1～2.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.10的椿皮清膏；
24.s2：苦参加6～12倍量水，加水煎煮1～3次，第一次煎煮前浸泡0.5～1.5小时，每次煎煮0.5～3小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.15的苦参清膏，放冷，加乙醇使含醇量达60～70％，静置8～24小时，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，与椿皮清膏合并，浓缩至相对密度1.05～1.10的清膏；
25.s3：乳香加6～10倍量水，蒸馏5～9小时，收集挥发油；
26.s4：牡丹皮用水蒸汽蒸馏法蒸馏，收集质量为4～8倍药材量的蒸馏液，放置析晶，滤过，丹皮酚结晶另置；水溶液重蒸馏，收集质量为2～4倍药材量的蒸馏液，放置析晶，滤过，合并丹皮酚结晶；
27.s5：取药用羧甲基纤维素钠、药用甘油加入到椿皮和苦参的混合清膏中，搅匀，放置，使充分溶胀；
28.s6：取冰片加入乳香的挥发油，丹皮酚结晶用乙醇溶解后，加入羟苯乙酯和聚山梨酯-80，搅拌使溶解后，加入到步骤s5得到的溶胀的溶液中，加水混匀，放置12～36小时使充分溶胀，搅拌均匀，分装即得凝胶剂。
29.更优选地，羧甲基纤维素钠、药用甘油的用量分别是所用冰片重量的0.6～1.5重
量份，羟苯乙酯和聚山梨酯-80的用量分别是所用冰片重量的0.01～0.1重量份；所得凝胶剂为所用中药原料药总重量的0.1～0.2重量份。
30.最优选地，所述中药组合物为椿乳凝胶。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.椿乳凝胶为千金药业自主开发并独家生产的纯中药制剂，由椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片5味中药组方而成，具有清热燥湿，祛瘀生肌的功效，组方清补结合，科学合理。根据其功能主治的特点，本发明对椿乳凝胶体内及体外抗低危型hpv病毒的药效学进行研究。体外试验观察椿乳凝胶对hpv6和hpv11病毒和293ft细胞周期的影响；体内试验采用含hpv6基因组和hpv11基因组的293ft细胞提取的低危型hpv病毒感染balb/c小鼠模型，通过检测宫颈组织病毒效价、hpv6 e6 mrna、hpv6 e7 mrna、hpv11 e6 mrna和hpv11 e7mrna及hpv6和hpv11的蛋白表达，评价椿乳凝胶体内抗hpv6和hpv11的药效作用。
33.根据本发明研究，椿乳凝胶可明显降低hpv6和hpv11相关基因及蛋白表达，抑制hpv6和hpv11病毒增殖，降低病毒感染力，恢复由低危型hpv感染诱导的细胞周期分布异常，对低危型hpv感染诱导的细胞发育异常起到恢复治疗作用。且椿乳凝胶能明显降低低危型hpv感染后阴道ph值及宫颈组织病毒滴度，减轻宫颈组织病变，缓解hpv6和hpv11感染所致宫颈组织上皮细胞增生、坏死和炎症细胞浸润情况。因此，椿乳凝胶可用于预防低危型hpv病毒感染和治疗低危型hpv病毒引起的疾病。如防治尖锐湿疣，且可在尖锐湿疣形成早期发挥作用，避免了尖锐湿疣形成出现赘生物后还需要进行赘生物切除的痛苦以及出现复发的可能，为预防和治疗低危型hpv和早期尖锐湿疣的临床用药提供选择。
附图说明
34.图1为培养24h后椿乳凝胶对293ft细胞的形态学影响，其中a为空白对照组；b为1000μg/ml椿乳凝胶；c为500μg/ml椿乳凝胶；d为62.5μg/ml椿乳凝胶。
35.图2为培养48h后椿乳凝胶对293ft细胞的形态学影响，其中a为空白对照组；b为1000μg/ml椿乳凝胶；c为500μg/ml椿乳凝胶；d为62.5μg/ml椿乳凝胶。
36.图3为培养72h后椿乳凝胶对293ft细胞的形态学影响，其中a为空白对照组；b为1000μg/ml椿乳凝胶；c为500μg/ml椿乳凝胶；d为62.5μg/ml椿乳凝胶。
37.图4为病毒感染48h后各试验组对293ft细胞增殖的影响，其中a为溶媒对照组/细胞维持液；b为hpv6和hpv11组；c为125μg/ml椿乳凝胶干预；d为100μmol/l阳性药干预。
38.图5为病毒感染72h后各试验组对293ft细胞增殖的影响，其中a为溶媒对照组/细胞维持液；b为hpv6和hpv11组；c为125μg/ml椿乳凝胶干预；d为100μmol/l阳性药干预。
39.图6为pi单染流式细胞仪分析293ft细胞周期，其中a为hpv6和hpv11组；b为溶媒对照组；c为椿乳凝胶低剂量组；d为椿乳凝胶中剂量组；e为椿乳凝胶高剂量组；f为阳性药组。
40.图7为造模后48h模型对照组hpv6和hpv11定植检查情况。
41.图8为末次给药前模型对照组hpv6和hpv11定植检查情况。
42.图9为阴道组织病理切片(he
×
100)，其中a为空白对照组；b为模型对照组；c为鬼臼毒素组；d为椿乳凝胶低剂量组；e为椿乳凝胶中剂量组；f为椿乳凝胶高剂量组。
43.图10为宫颈组织病理切片(he
×
100)，其中a为空白对照组；b为模型对照组；c为鬼臼毒素组；d为椿乳凝胶低剂量组；e为椿乳凝胶中剂量组；f为椿乳凝胶高剂量组。
44.图11为real-time pcr测定cdna的熔体曲线，其中a为hpv6 e6；b为hpv6 e7；c为hpv11 e6；d为hpv11 e7。
45.图12为椿乳凝胶对小鼠宫颈组织hpv6 e6 mrna、hpv6 e7 mrna、hpv11 e6 mrna和hpv11 e7 mrna的影响，其中与空白对照组比较

p≤0.01；与模型对照组比较
*
p≤0.05，
**
p≤0.01。
46.图13为6次重复实验的hpv6和hpv11蛋白灰度条带，其中a为空白对照组；b为模型对照组；c为鬼臼毒素组；d为椿乳凝胶低剂量组；e为椿乳凝胶中剂量组；f为椿乳凝胶高剂量组。
47.图14为椿乳凝胶对小鼠宫颈组织hpv6和hpv11蛋白表达的影响，其中与空白对照组比较

p≤0.01；与模型对照组比较
*
p≤0.05，
**
p≤0.01。
具体实施方式
48.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
49.以下为实施例中所用材料：
50.受试物：椿乳凝胶，批号：20191205；规格：4g/支；剂型：凝胶制剂；性状：棕褐色凝胶；有效期至：至2022.05；由株洲千金药业股份有限公司生产。所述椿乳凝胶依据《国家食品药品监督管理局标准ybz12212009》制备方法制备。
51.阳性对照：鬼臼毒素，批号：m0521b，规格：1g/支，有效期至：至2022.07；由苏州美仑生物科技有限公司生产。
52.细胞机质粒：293ft细胞(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)；pcdna3.1-egfp-hpv6-e6/e7、pcdna3.1-egfp-hpv11-e6/e7(送至通用生物(安徽)系统有限公司合成)；pcmv-hpv6-l1-flag-l2-6*his、pcmv-hpv11-l1-flag-l2-6*his(送至武汉中迈盈科生物科技有限公司合成)。
53.实验动物：spf级雌性balb/c小鼠100只，体重15.6～18.8g，动物购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(京)2019-0010，在屏障环境动物实验室c区饲养，实验动物使用许可证号：syxk(湘)2020-0015。
54.主要试剂：dmem培养基(hyclone公司，货号af29584966)；胎牛血清(fbs)(sciencell公司，货号m009-6)；lipo-fectamine 2000(invitrogen公司，货号2117484)；opti-mem
tm
(thermo fisher公司，货号31985070)；celltiter-glo发光法细胞活力检测试剂盒(碧云天生物试剂公司，货号c0065m)；细胞周期检测试剂盒(invitrogen公司，货号2117484)；dh5α感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司，货号cb101)；无内毒素质粒大提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号dp117)；ripa裂解液(强)(碧云天，货号p0013b)；high capacity cdna reverse transcription kit(thermo fisher scientific，货号4368814)；rna提取试剂盒(vazyme，货号rc101)；powerup sybr green master mix(thermo fisher scientific，a25742)；sds-page凝胶快速配制试剂盒(碧云天，货号p0012ac)；prestained protein ladder，(10-180kda)(thermo，货号26617)；ecl化
学发光试剂盒(碧云天，货号p0018a)；pvdf膜(merck millipore，货号ipvh00010)；hrp-goat anti-rabbit igg(h l)(abclonal，货号as014)；hrp-goat anti-mouse igg(h l)(abclonal，货号as003)；β-actin antibody(abclonal，货号ac026)；hpv6 e7 antibody(lsbio，货号ls-c144095)；hpv11 e7 antibody(abcam，货号ab100967)；苯甲酸雌二醇注射液(四川金科药业有限责任公司，货号20190312)。
55.主要仪器：电泳仪电源(北京六一，型号dyy-6c/d)；双垂直电泳仪(tanon，型号ve-180)；转印电泳仪(槽)(tanon，型号ve-186)；水平脱色摇床(海门其林贝尔，型号zd-9550)；台式高速大容量冷冻离心机(thermofisher，型号st8r)；酶标仪(molecular devices，型号spectra max i3x)；金属恒温浴(bioer，型号hb-202)；化学发光成像系统(tanon，型号5200multi)；实时荧光定量pcr仪(美国thermo fisher，型号7500)；pcr仪(美国abi，型号9700)；微量核酸检测仪(thermo fisher，型号nanodrop lite)；台式低速离心机(湖南省凯达实业发展有限公司，型号td4)；生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司，型号dm2000)；石蜡切片机(德国leica，型号rm2235)；组织包埋机(德国leica，型号eg1150h c)；全自动脱水机(德国leica，型号asp200s)；生物显微镜(德国leica，型号cx31)；倒置荧光显微镜(德国leica，型号dmi8)；流式细胞仪(bd，型号c6)；co2培养箱(thermo fisher，型号3111)；医用净化工作台(苏州冯氏实验动物设备有限公司，型号cj-1f)。
56.实施例1 hpv6和hpv11假病毒制备
57.一、实验方法
58.1.hpv6和hpv11假病毒构建
59.(1)结构基因表达质粒的构建
60.分别将密码子优化的hpv6和hpv11结构蛋白l1和l2基因合成并克隆至载体pcmv-mcs中，结构基因表达质粒分别命名为pcmv-hpv6-l1-flag-l2-6*his和pcmv-hpv11-l1-flag-l2-6*his。
61.(2)质粒的构建
62.合成报告质粒pcdna3.1-egfp-hpv6-e6、pcdna3.1-egfp-hpv6-e7、pcdna3.1-egfp-hpv11-e6、pcdna3.1-egfp-hpv11-e7。下文中pcdna3.1-egfp-hpv6-e6/e7表示pcdna3.1-egfp-hpv6-e6和pcdna3.1-egfp-hpv6-e7，pcdna3.1-egfp-hpv11-e6/e7表示pcdna3.1-egfp-hpv11-e6和pcdna3.1-egfp-hpv11-e7。
63.(3)质粒常规转化与大量提取
64.从-80℃冰箱取出4管dh5α感受态细胞放冰上，待溶解之后，分别向4管感受态细胞悬液中加入0.5～1μl预冷的目的质粒，轻轻地用移液器混匀，用电转仪加到电击杯，2.5kv，5s，然后向每个离心管中加入预热的200μl lb液体培养基，混匀后置于37℃，200rpm摇床震荡培养1h，使菌体复苏。将离心管内容物混匀，吸取已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的lb固体培养基上，37℃培养12～15h。挑取平板上单个菌落接种(或者直接取对应合成质粒的菌液100～200μl)至2ml含相应抗生素的lb液体培养基中培养，再转接到200ml lb液体培养基中进行扩大培养，用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，nanodrop测定质粒纯度与浓度，-20℃保存备用。
65.2.hpv6和hpv11假病毒制备
66.(1)结构基因表达质粒与报告质粒共转染至293ft细胞
67.转染前一天，按1
×
106/ml的密度将293ft细胞铺于6孔板培养板中，37℃培养过夜，待细胞长至60％～70％密度时即可进行转染实验，利用lipo-fectamine 2000将结构基因表达质粒(pcmv-hpv6-l1-flag-l2-6*his和pcmv-hpv11-l1-flag-l2-6*his)分别与报告质粒(pcdna3.1-egfp-hpv6-e6/e7和pcdna3.1-egfp-hpv11-e6/e7)共转染至293ft细胞，同时设置分别转染单个报告质粒为阴性对照组。
①
转染0.5h之前把培养孔板中的dmem完全培养基换成无血清的dmem培养基，对细胞进行饥饿处理，且用量减半；
②
首先将转染试剂lipofectamine 2000，对照组质粒和实验组质粒(pcdna3.1-egfp-hpv6-e6：pcmv-hpv6-l1-flag-l2-6*his＝1：1，pcdna3.1-egfp-hpv6-e7：pcmv-hpv6-l1-flag-l2-6*his＝1：1，cdna3.1-egfp-hpv11-e6：pcmv-hpv11-l1-flag-l2-6*his＝1：1，pcdna3.1-egfp-hpv11-e7：pcmv-hpv11-l1-flag-l2-6*his＝1：1，每组中两种质粒均取1.25μg)分别用opti-mem培养基进行稀释，轻轻吸吹混匀，室温下放置5min；
③
将lipofectamine 2000分别与对照组质粒和实验组质粒混合，在漩涡震动仪上轻轻地颠倒混匀，室温下放置20min左右；
④
将转染混合液加入已换成无血清培养基的培养板中，轻轻混匀，置于培养箱4～6h之后，吸掉无血清的培养基，更换成dmem完全培养基继续培养，48～72h后收获假病毒，进行病毒滴度测定。
68.(2)病毒滴度测定
69.将293ft细胞按1.5
×
104/ml的密度铺于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。将步骤(2)制备得到的hpv6和hpv11假病毒用dmem培养基分别进行10-1
、10-2
、10-3
、10-4
和10-5
倍稀释，取各梯度病毒稀释液100μl加入293ft细胞中，每个稀释梯度8个复孔，将96孔板放入37℃培养箱孵育72h后，置于倒置荧光显微镜下观察，出现一个以上病变细胞定为阳性孔。用reed-muench方法计算细胞培养半数感染量(tcid
50
)，即病毒感染一半细胞时的病毒稀释度。
70.二、实验结果
71.病毒滴度测定结果见表1：
72.表1 hpv6和hpv11假病毒的滴度测定出现cpe孔的统计(n＝8)
[0073][0074]
根据公式可得：
[0075]
logtcid
50
＝log(高于50％的死亡百分数的稀释度) (pd*稀释倍数)
[0076]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
＝-2.8
[0077]
查反对数表：10-2.8＝tcid
50
终点稀释比例＝1：630.95
[0078]
即测定hpv6和11假病毒中，每0.1ml接种量含有630个tcid
50
单位。
[0079]
100倍tcid
50
的hpv6和hpv11假病毒液：把hpv6和hpv11假病毒原液用dmem培养基按照1：6.3倍稀释即得。
[0080]
实施例2椿乳凝胶对293ft细胞形态学及增殖的影响
[0081]
一、实验方法
[0082]
将293ft细胞按1.5
×
104/ml的密度铺于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。待细胞长成单层细胞后，用0.9％的nacl溶液洗涤细胞2～3次，将供试品(椿乳凝胶)母液(40mg/ml)用含10％fbs的dmem培养基分别稀释6个浓度(1000、500、250、125、62.5和31.25μg/ml)；阳性药(鬼臼素)设置6个浓度(100、50、25、12.5、6.25和3.125μmol/l)，取每组药物100μl加入96孔板中，同时设置空白对照组，每组设3个复孔，置于37℃，5％co2的培养箱中培养，分别于24h、48h、72h后在倒置荧光显微镜下观察细胞的形态，采用celltiter-glo发光法测定72h后的细胞活性，并计算供试品和阳性药的ic
50
及tc0(ic
20
)。
[0083]
二、实验结果
[0084]
如表2所示，供试品对293ft细胞的ic
50
为333.80μg/ml，tc0为129.20μg/ml，与阳性药在(100～3.125μmol/l)浓度范围内对293ft细胞的毒性差异不大，试验浓度范围内未检测到阳性药对293ft细胞的ic
50
和tc0。图1～图3表示加入椿乳凝胶溶液(浓度1000～31.25μg/ml，部分图片)处理24～72h后对293ft细胞形态的影响，空白对照组细胞形态呈圆形，菱角分明。与空白对照组比较，椿乳凝胶干预组中细胞形态出现明显变化，以细胞脱落，皱缩为主，提示药物干预后细胞增殖受到一定的抑制作用。
[0085]
表2椿乳凝胶和鬼臼毒素对293ft细胞的毒性结果
[0086][0087]
实施例3椿乳凝胶对hpv6和hpv11假病毒感染力的影响
[0088]
一、实验方法
[0089]
将293ft细胞按1.5
×
104/ml的密度铺于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜至形成单层细胞。待细胞长满约80％左右时弃培养液加入实施例1制备得到的100倍tcid
50
的hpv6和hpv11假病毒液100μl/孔。继续培养2h后更换为100μl/孔的不同浓度的含药培养基(根据细胞毒性设置浓度)，含药培养基的配置方法见实施例2，其中椿乳凝胶稀释6个浓度(125、62.5、31.25、15.62、7.81和3.90μg/ml)，阳性药稀释6个浓度(100、50、25、12.5、6.25和3.125μmol/l)，同时设置溶媒对照组：单纯加入dmem培养基，每组8个复孔，置于37℃，5％co2培养箱中孵育24～72h后，在倒置荧光显微镜下观察并记录实验组与对照组的细胞病变情况。
[0090]
二、实验结果
[0091]
病毒感染48h后，细胞出现明显的病变现象，如图4所示，与溶媒对照组比较，hpv6和hpv11组与椿乳凝胶干预组的细胞出现不同程度的细胞病变。椿乳凝胶干预后细胞病变程度明显减少，表明椿乳凝胶有一定抑制病毒增殖的能力；如图5所示，至培养72h后，椿乳凝胶抑制病毒的效果呈现降低的趋势，由图可知hpv6和hpv11组与椿乳凝胶干预组出现细
胞病变的差异性不大，阳性药在72h表现出一定抑制病毒增殖的能力。可知，为了保持椿乳凝胶抗病毒的能力，需连续给药增强药效。综上所述，椿乳凝胶对hpv6和hpv11病毒的增殖有一定的抑制作用。
[0092]
实施例4椿乳凝胶对293ft细胞周期的影响
[0093]
一、实验方法
[0094]
将293ft细胞按1.5
×
106/孔的密度铺于6孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜，待细胞长至80％左右时，用0.9％的nacl溶液洗涤细胞2～3次，加入实施例1制备得到的100倍tcid
50
的hpv6和hpv11假病毒液100μl/孔。继续培养2h后更换为100μl/孔的不同浓度的含药培养基(根据细胞毒性设置浓度)，含药培养基的配置方法见实施例2，其中椿乳凝胶稀释3个浓度(低剂量：32.3μg/ml，中剂量：64.6μg/ml，高剂量：129.20μg/ml)阳性药稀释浓度(3.12μmol/l)，同时设置病毒对照组(hpv6和hpv11组)和溶媒对照组。将细胞培养板置于37℃，5％co2的培养箱中孵育48h后，1000rpm离心3min收集细胞，用预冷生理盐水洗涤两次后，离心；加入pi 10μl至终浓度20μg/ml(用190μl binding buffer(1
×
)稀释)，锡箔纸包住，4℃避光染色30min，离心；加入200μl binding buffer(1
×
)清洗，离心；加入200μl生理盐水重悬细胞，用流式细胞仪进行细胞周期数据的收集和分析(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106)。
[0095]
二、实验结果
[0096]
pi单染流式细胞仪分析293ft细胞周期中各期细胞的变化，结果见图6。hpv6和hpv11感染48h后(图6，a)细胞中g0/g1期细胞比例显著低于溶媒对照组(图6，b)，s期细胞比例高于溶媒对照组，g2/m细胞比例与溶媒对照组相比无显著差异。椿乳凝胶低剂量(32.3μg/ml)、中剂量(64.6μg/ml)和高剂量(129.20μg/ml)组293ft细胞周期(图6c、d和e)，g0/g1期细胞比例显著高于hpv6和hpv11组，s期细胞比例低于hpv6和hpv11组，g2/m细胞比例低于hpv6和hpv11组。椿乳凝胶组g0/g1期细胞比例低于溶媒对照组，与阳性药组(图6f)相比g0/g1期细胞比例无显著差异。
[0097]
本发明对椿乳凝胶体外抗低危型hpv病毒的药效学进行研究。体外试验结果表明，椿乳凝胶(1000～31.25μg/ml)处理293ft细胞24～72h后，与溶媒对照组相比椿乳凝胶干预组中细胞形态出现明显变化，细胞增殖受到一定的抑制，其对293ft细胞的ic50为333.80μg/ml；在抗病毒试验中结果中显示：椿乳凝胶溶液在试验浓度范围内可以降低hpv6和hpv11假病毒的感染力，抑制hpv6和hpv11病毒增殖。细胞周期结果表明：椿乳凝胶处理后可明显调节hpv6和hpv11假病毒感染诱导的细胞周期分布，并使感染细胞的细胞周期分布接近正常。综上所述，椿乳凝胶对低危型hpv感染后的细胞起到一定的治疗作用。
[0098]
实施例5椿乳凝胶对hpv6和hpv11假病毒感染balb/c小鼠模型的影响
[0099]
hpv e6和hpve7是hpv的两条癌基因片段，导致遗传基因损伤，造成感染细胞发生细胞周期失控，产生抗凋亡，最终导致细胞异常增殖和肿瘤的发生，而hpv e6mrna和hpve7 mrna是病毒癌基因转录产物，它们的表达导致宿主细胞恶性转化。因此本发明对椿乳凝胶体内抗低危型hpv病毒的药效学进行研究。体内试验采用含hpv6基因组、hpv11基因组的293ft细胞提取的低危型hpv病毒感染balb/c小鼠模型，通过检测宫颈组织病毒滴度、hpv6 e6mrna、hpv6e7mrna、hpv11 e6mrna、hpv11e7 mrna、hpv6蛋白表达和hpv11蛋白表达，评价椿乳凝胶体内抗hpv6和hpv11的药效作用。
[0100]
一、实验方法
[0101]
1.分组与给药
[0102]
选用检疫合格spf级雌性balb/c小鼠100只，每只动物皮下注射0.1μg/只苯甲酸雌二醇，每天1次，连续3天，第3天下午取25μl实施例1制备得到的100倍tcid
50
的hpv6和hpv11假病毒液与15μl 4％cmc的混合物灌入小鼠阴道内进行感染，另取16只空白对照组小鼠灌入40μl 4％cmc进行处理；假病毒感染48h之后，乙醚轻微麻醉小鼠，取50μl的15mg/mld-luciferase灌入小鼠阴道内促使小鼠阴道上皮细胞内的luc发光，3min后利用小动物体内可见光成像系统(ivis，caliper life science)检测小鼠体内荧光素酶的表达情况。选取阴道红肿明显的模型balb/c小鼠80只，按体重随机分为模型对照组、鬼臼毒素组、椿乳凝胶低、中和高剂量组，每组16只。各组动物每天阴道给药1次，连续20天。
[0103]
2.剂量设计
[0104]
椿乳凝胶临床拟用剂量为每日1支(4g)，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为4g/日*0.0026≈0.01g/日；根据前期试验，本次实验将等效剂量的1倍、2倍和4倍设置为椿乳凝胶低、中和高剂量组，即0.01、0.02和0.04g/日。鬼臼毒素浓度为5mg/ml，根据小鼠阴道最大载容量为0.2ml，故设置鬼臼毒素剂量为1mg/只。详见表3。
[0105]
表3分组与剂量设计
[0106][0107]
3.检测指标
[0108]
(1)阴道外观评分
[0109]
观察小鼠的行为活动以及外阴情况，分别于给药后10、20天对阴道口进行评分，其中阴道口红肿评分标准：无(0分)、轻度(1分)、中度(2分)和重度(3分)；阴道口脓性分泌物评分标准：无(0分)、少量(1分)、中量(2分)和多量(3分)。
[0110]
(2)ph值检测
[0111]
分别于给药后10、20天采用无菌棉签进行阴道分泌物的取样。取材部位为小鼠的宫颈口或宫颈后穹窿，分泌物使用一次性无菌阴道拭子采集，圆周滚动3次，采用0.1级精密ph试纸检测阴道分泌物的ph值。
[0112]
(3)组织病理检查
[0113]
末次给药后随机选取8只动物颈椎脱臼安乐死，解剖取阴道、子宫组织进行he染色法观察小鼠阴道、子宫及子宫颈病理组织变化。评分标准：nsl，计为“0”分； ，计为“1”分；
，计为“2”分； ，计为“3”分。
[0114]
(4)宫颈组织病毒滴度检测
[0115]
取一定量的组织匀浆，离心取上清液，在96孔板中接种293t细胞，第2天用完全培养基按(1～10-9
)10个梯度稀释病毒液，每孔加入100μl稀释后的病毒液，每个梯度设置3个重复；48h后观察细胞中gfp的表达，若10-8
梯度孔中分别有2、3和4个细胞gfp( )，则取平均值，此病毒滴度为3
×
108tu/ml。采用血凝抑制试验检测宫颈悬液的血凝抑制滴度(以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为血凝抑制滴度)，以log2(最大稀释倍数)，反映宫颈中病毒效价。
[0116]
(5)hpv6 e6mrna、hpv6e7mrna、hpv11 e6mrna和hpv11 e7mrna检测
[0117]
各组宫颈组织中hpv6 e6mrna、hpv6e7mrna、hpv11 e6mrna和hpv11 e7mrna检测提取各组总rna，逆转录为cdna，进行pcr反应，根据genbank里的基因数据，使用primer premier6和oligo7软件设计引物序列。内参为β-actin。设定对照基因表达量为100，以目的基因占对照基因相对百分含量代表目的基因表达量。引物序列如下所示：
[0118]
hpv6 e6引物序列(5’to3’)：
[0119]
forward primer(seq id no:1)：tgt ttc agg acc cac agg ag，
[0120]
reverse primer(seq id no:2)：tca cgt cgc agt aac tgt tg；
[0121]
hpv6 e7引物序列(5’to 3’)：
[0122]
forward primer(seq id no:3)：cag ctc aga gga gga gga tg，
[0123]
reverse primer(seq id no:4)：aac cga agc gta gag tca ca；
[0124]
hpv11 e6引物序列(5’to 3’)：
[0125]
forward primer(seq id no:5)：cac tat aga ggc cag tgc ca，
[0126]
reverse primer(seq id no:6)：ctt gtg ttt ctc tgc gtc gt；
[0127]
hpv11 e7引物序列(5’to 3’)：
[0128]
forward primer(seq id no:7)：cga acc aca acg tca cac aa，
[0129]
reverse primer(seq id no:8)：aga aac agc tgc tgg aat gc
[0130]
(6)hpv6e6、hpv6e7、hpv11 e6和hpv11 e7的蛋白表达
[0131]
留取样本用bca法测定蛋白浓度，制备分离胶、浓缩胶，上样，电泳。将电泳后凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，ecl显色曝光。实验重复6次。目的蛋白相对表达量＝目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。
[0132]
(7)统计学方法
[0133]
本发明实验数据按照四舍五入的修约规则进行有效数字修约，并按照sop规定进行统计学分析，统计学意义的水平设定为p≤0.05。统计所用软件为spss22.0。计量资料采用均数
±
标准差表示，用leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-way anova)和post hoc lsd进行统计分析；如果符合正态性但方差不齐，采用tamhane进行统计分析；如果不符合正态性，则用kruskal-wallis进行统计分析。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p≤0.05)，则用dunnett’s test(非参数方法)或mann-whitney检验进行比较分析。
[0134]
二、实验结果
[0135]
1.一般观察结果(定植检查)
[0136]
如图7和8所示，造模后48h通过小动物活体成像系统对hpv6和hpv11定植进行检查，结果显示模型对照组荧光强度高，且末次给药前模型对照组荧光强度仍然较高，提示hpv6和hpv11在阴道体内定植较好。笼旁观察显示，给药后各组动物一般情况(自主活动、摄食摄水等)均未见异常，且阴道外观无明显分泌物和红肿。
[0137]
2.对阴道ph的影响
[0138]
如表4所示，与空白对照组比较，给药第10、20天模型对照组阴道ph值明显升高(p≤0.01)；与模型对照组比较，给药第10天鬼臼毒素组、椿乳凝胶低剂量组阴道ph值均明显降低(p≤0.05或p≤0.01)，给药第20天鬼臼毒素组、椿乳凝胶低、中及高剂量组阴道ph值均明显降低(p≤0.05)。给药第10天椿乳凝胶低和高剂量组阴道ph值低于鬼臼毒素组，更接近空白对照组的阴道ph值。给药第20天椿乳凝胶中剂量组阴道ph值与空白对照组一致。给药第20天椿乳凝胶低、中及高剂量组阴道ph值均低于对应给药第10天阴道ph值，随着给药时间的增长，阴道ph值下降；而鬼臼毒素组给药第10天和第20天阴道ph值没有变化。椿乳凝胶低和高剂量组对阴道ph值的恢复优于鬼臼毒素组。
[0139]
表4椿乳凝胶对阴道ph值的影响(n＝8)
[0140][0141][0142]
注：与空白对照组比较

p≤0.01；与模型对照组比较
*
p≤0.05，
**
p≤0.01。
[0143]
3.组织病理学检查
[0144]
(1)镜下观察
[0145]
如图9、10所示，空白对照组仅个别动物阴道及宫颈组织镜下可见黏膜上皮细胞坏死，并伴有少量炎症细胞浸润；模型对照组宫颈及阴道上皮细胞坏死，部分动物出现上皮细胞增生，上皮层及黏膜固有层炎症细胞浸润；鬼臼毒素组、椿乳凝胶低、中及高剂量组阴道及宫颈组织镜下均可见黏膜上皮细胞变性坏死，伴有少量炎性细胞浸润。小鼠造模后经阴道给予不同受试物，阴道组织病变程度变化不明显，宫颈组织病变有不同程度的减轻。连续给药20天后，各组动物子宫组织镜下观察未见上皮细胞增生、坏死，也未见炎症细胞浸润。
[0146]
(2)对组织病变评分的影响
[0147]
如表5所示，与空白对照组比较，模型对照组宫颈组织病变评分明显升高(p≤0.01)，阴道组织病变评分有增加趋势，但无统计学差异；与模型对照组比较，鬼臼毒素组、椿乳凝胶中及高剂量组宫颈组织病变评分均明显降低(p≤0.05或p≤0.01)。鬼臼毒素组、椿乳凝胶低、中及高剂量组阴道组织病变评分与模型对照组比较，均无统计学差异。
[0148]
表5椿乳凝胶对组织病变评分的影响(n＝8)
[0149][0150][0151]
注：与空白对照组比较

p≤0.01；与模型对照组比较
*
p≤0.05，
**
p≤0.01。
[0152]
(3)对宫颈组织病毒滴度的影响
[0153]
如表6所示，与空白对照组比较，模型对照组宫颈组织病毒滴度明显升高(p≤0.01)；与模型对照组比较，鬼臼毒素组、椿乳凝胶低、中及高剂量组宫颈组织病毒滴度均明显降低(p≤0.01)。与鬼臼毒素组比较，椿乳凝胶高剂量组宫颈组织病毒滴度明显降低(p≤0.01)。
[0154]
表6椿乳凝胶对宫颈组织病毒滴度的影响(n＝8)
[0155][0156]
注：与空白对照组比较

p≤0.01；与模型对照组比较
**
p≤0.01；与鬼臼毒素组比较
&&
p≤0.01。
[0157]
(4)对hpv6 e6 mrna、hpv6 e7 mrna、hpv11 e6 mrna和hpv11 e7 mrna表达的影响
[0158]
如图11、图12所示，空白对照组组织中未检测到hpv6 e6 mrna、hpv6 e7 mrna、hpv11 e6 mrna和hpv11 e7 mrna；模型对照组宫颈组织hpv6 e6 mrna、hpv6 e7 mrna、hpv11 e6 mrna和hpv11 e7 mrna均明显增加(p≤0.01)；与模型对照组比较，鬼臼毒素组hpv6 e6mrna、hpv6 e7mrna和hpv11 e7mrna均明显降低(p≤0.05或p≤0.01)，椿乳凝胶低剂量组hpv6 e7 mrna和hpv11 e7 mrna均明显降低(p≤0.05)，椿乳凝胶中及高剂量组hpv6 e6mrna、hpv6 e7mrna和hpv11 e7mrna均明显降低(p≤0.05或p≤0.01)。椿乳凝胶低、中及高剂量组hpv11 e7 mrna低于鬼臼毒素组，椿乳凝胶中和高剂量组hpv11 e6 mrna低于鬼臼毒素组。
[0159]
(5)对hpv6和hpv11蛋白表达量的影响
[0160]
6次重复实验的结果如图13及图14所示，图13为6次bca法测定蛋白浓度的实验图，图14为蛋白表达量统计平均值，与空白对照组比较，模型对照组hpv6和hpv11蛋白表达量均明显增加(p≤0.01)；与模型对照组比较，鬼臼毒素组hpv6和hpv11蛋白表达量均明显降低(p≤0.01)，椿乳凝胶低、中及高剂量组hpv11蛋白表达量均明显降低(p≤0.05或p≤0.01)，椿乳凝胶中及高剂量组hpv6蛋白表达量均明显降低(p≤0.05或p≤0.01)。
[0161]
体内试验结果表明，hpv6和hpv11经小鼠阴道感染建立低危型人乳头状瘤病毒模型，经小动物活体成像给药前及给药末期均显示高度荧光量，提示hpv6和hpv11病毒在小鼠阴道内定植成功，且病理结果显示宫颈组织粘膜上皮细胞坏死及增生，伴有炎性细胞浸润。造模后48h给予椿乳凝胶后，椿乳凝胶给药组阴道ph值及宫颈组织病毒滴度均明显降低，且hpv6 e6mrna、hpv6 e7mrna、hpv11 e6mrna和hpv11e7mrna及hpv6和hpv11的蛋白表达均明显降低，同时宫颈组织病变程度明显减轻。
[0162]
综上所述，椿乳凝胶在(31.25～1000μg/ml)浓度范围内对293ft细胞增殖有一定的抑制作用，其对细胞的ic50为333.80μg/ml。椿乳凝胶能有效降低低危型hpv的感染力，在一定程度上治疗低危型hpv的感染。椿乳凝胶能明显降低阴道ph值及宫颈组织病毒滴度，且明显降低hpv6 e6mrna、hpv6 e7mrna、hpv11 e6mrna和hpv11e7mrna及hpv6和hpv11的蛋白表达，提示椿乳凝胶对hpv6和hpv11感染小鼠建立的低危型人乳头状瘤病毒模型具有明显治疗作用，且体内外结果一致。
[0163]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。