组织再生用水凝胶组合物以及利用其制备的支撑体的制作方法

1.本发明涉及一种组织再生用水凝胶组合物以及利用其制备的支撑体，更详细地，由于可在不像以往那样投入在一侧末端或两侧末端存在环氧基或胺基的交联剂的情况下通过自行交联结合来迅速形成三维结构，因而具备提供可实现软组织移植的结构的效果。


背景技术：

2.当前的组织工程的主要目标为通过制作由多种细胞组成的具备功能的人体组织和器官来代替受损的组织和器官。生物打印墨水为有助于能够尽快实现这种组织工程的目标的技术，而生物打印则基于自动化生物打印技术来利用细胞和生物材料制作具备三维结构的组织和器官。自动化计算机生物打印技术逐渐发展成喷墨型工艺(inkjet-based process)、激光型工艺(laser-based process)以及挤出型工艺(extrusion-based process)。这种生物打印的基本工艺如下，在利用从计算机应用设计模型中获取的图像制作模型后，利用包含细胞和物质的生物墨水制作三维结构形态。计算机应用设计模型可使用核磁共振图像及通过计算机化相位扫描形成的三维(3d)医疗图像来制作。其中，含有活细胞的生物材料将被用作生物打印工艺的基本材料。
3.为使含有细胞的三维打印而成的仿生结构体在结构层面和生物学层面发挥其功能，生物墨水应具备印刷适性、细胞适应性、生物降解性、凝胶特性/机械物性以及可调节细胞的生长和分化的特性。
4.即，经生物打印而成的结构物应在再生期间维持所需的模样，应在生物体内再生过程中，按适当的速度分解。当前使用的生物墨水有支架水凝胶(hydrogel)、微载体、去除细胞的细胞外基质(extracellular matrix)等，还以没有支架(scaffold)的状态将细胞集合体用作生物墨水。
5.水凝胶为代表性的商品化生物墨水，其生物相容性优秀，具有与人体组织相似的结构，便于实现细胞以及生理活性物质的胶囊化。代表性的水凝胶生物墨水产品有胶原蛋白(collagen)、明胶(gelatin)、海藻酸钠(alginate)、透明质酸(hyaluronic acid)、聚乙二醇二丙烯酸酯(poly(ethylene glycol)diacrylate，pegda)、甲基丙烯酰化胶原蛋白(collagen methacryloyl，collagenma)、甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacayloyl，gelma)等。
6.挤出型打印为三维生物打印中最普遍使用的方法，已商品化的三维生物打印机大多使用挤出型打印工艺。在挤出型打印中，利用气压或机械力量将注射器内的生物墨水挤出成细丝状并由此制备三维细胞结构体。在挤出型打印中，可使用黏性范围大(30-6x106mpa
·
s)及浓度高的细胞和细胞球状集合体(spheroids)的生物墨水。但是，挤出型打印的清晰度(resolution：200-1000μm)低，由于可能会在挤出过程中向细胞施加剪应力，因而有可能会对细胞的生存力产生影响。因此，用于挤出型打印的生物墨水应具备剪切变稀特性(shear thinning properties)，应在打印后很好地维持所打印出的形态并保护细胞不受剪应力影响。
7.喷墨打印的原理如下，即，利用压电机(piezoelectric)或热量(thermal)来从含有细胞的生物墨水生成小墨滴(10～50μm)并通过喷嘴进行喷射。在喷墨打印工艺期间，生物墨水中的多个细胞将短时间(2μs)暴露于高温中，但不会对细胞存活性产生影响。喷墨打印存在如下的缺点，即，生物墨水应具备低黏性(小于10mpa.s)，应维持低细胞浓度(小于106cells/ml)。
8.对于激光型打印而言，由于不需要喷嘴，因而不存在因喷嘴而堵塞的现象，由于不会经过喷嘴，因而具有生物墨水所包含的多个细胞不受剪应力影响的优点。激光型打印的原理如下，即，通过向由金或钛的吸收层和生物墨水层构成的供墨纸(donor ribbon)射出脉冲激光束来生成及促进墨滴。在激光型打印中，可使用黏性达到1-300mpa.s以及细胞浓度达到108cells/ml的生物墨水，将形成10-100μm的清晰度。由于高能激光可对生物墨水进行短暂的加热，因而导热性能不高的生物墨水可提高墨水中的细胞存活性。
9.当前使用的打印技术的共同点在于，利用生物相容性材料的生物墨水非常重要。
10.如此一来，在三维支撑体的制作中，使用了用于精密制作组织类似器官及可移植结构体的材料。这种技术可以实现几乎完全模仿真实人体组织的微细组织结构体以及巨大组织结构体的生成。
11.但是，这种搬运细胞的支撑体在其应用度方面存在很多局限性，即，生物墨水在其应用度方面存在很多局限性。为了消除这种生物材料的局限性，即，为了扩宽应用范围，当前需要一种可实现生物打印以及注射注塑的水凝胶复合体。


技术实现要素：

12.技术问题
13.本发明的目的在于，提供如下的组织再生用水凝胶组合物以及利用其制备的支撑体，即，由于可在不投入在一侧末端或两侧末端存在环氧基或胺基的常用交联剂的情况下通过自行交联结合来迅速形成三维结构，因而可提供可实现软组织移植的结构。
14.技术方案
15.本发明的目的可通过提供将包含阴离子多糖、胺化透明质酸以及胶原蛋白作为特征的组织再生用水凝胶组合物来实现。
16.根据本发明的优选的特征，上述组织再生用水凝胶组合物包含1重量百分比至10重量百分比的阴离子多糖、0.1重量百分比至2重量百分比的胺化透明质酸以及0.1重量百分比至3重量百分比的胶原蛋白。
17.根据本发明的更优选的特征，上述阴离子多糖的重均分子量为100kda至500kda，由50重量百分比至70重量百分比的β-d-甘露糖醛酸以及30重量百分比至50重量百分比的α-l-古罗糖醛酸组成。
18.根据本发明的进一步优选的特征，上述胺化透明质酸的重均分子量为100kda至500kda。
19.根据本发明的进一步优选的特征，上述胶原蛋白的重均分子量为100kda至500kda，由去端肽胶原蛋白组成。
20.根据本发明的进一步优选的特征，在上述组织再生用水凝胶组合物中，相对于100重量份的上述组织再生用水凝胶组合物中所包含的阴离子多糖，还包含150重量份至400重
量份的2价阳离子以及0.1重量份至2重量份的甲醇。
21.根据本发明的进一步优选的特征，上述2价阳离子的质量浓度为0.5％至2％，由碱土金属或其化合物组成。
22.根据本发明的进一步优选的特征，上述甲醇的质量浓度为40％至60％。
23.根据本发明的进一步优选的特征，在上述组织再生用水凝胶组合物中，相对于100重量份的上述组织再生用水凝胶组合物，还包含0.1重量份至1重量份的添加剂，上述添加剂由选自由细胞、细胞生长因子、缓冲剂、防腐剂、等渗调节剂、盐、抗氧化剂、渗透压调节剂、乳化剂、润湿剂、甜味剂、香料剂、麻醉剂组成的组中的一种以上组成。
24.根据本发明的进一步优选的特征，上述细胞由选自由干细胞、感觉细胞、脑细胞、生殖细胞、上皮细胞以及免疫细胞组成的组中的一种以上组成。
25.并且，本发明的目的可通过提供将由上述组织再生用水凝胶组合物进行制备作为特征的组织再生用水凝胶支撑体来实现。
26.发明的效果
27.根据本发明的组织再生用水凝胶组合物以及利用其制备的支撑体，由于可在不投入在一侧末端或两侧末端存在环氧基或胺基的常用交联剂的情况下通过自行交联结合来迅速形成三维结构，因而具备提供可实现软组织移植的结构的出色效果。
附图说明
28.图1为拍摄并示出通过本发明的制备例5制备的水凝胶支撑体的照片。
29.图2为示出通过本发明的制备例5进行的水凝胶支撑体的制备过程的简图。
30.图3为测定并示出基于2价阳离子的浓度的压缩强度的图表。
31.图4为拍摄并示出通过本发明的制备例3制备的水凝胶组合物的照片。
32.图5为在对通过制备例3制备的水凝胶组合物进行冷冻干燥后用光学显微镜进行拍摄的照片。
33.图6为在对通过制备例5制备的水凝胶支撑体进行冷冻干燥后用光学显微镜进行拍摄的照片。
具体实施方式
34.以下，对本发明的优选实施例和各种成分的物性进行详细说明，但这仅属于以便于本发明所属技术领域的普通技术人员实施本发明的方式进行的详细说明，并不意味着本发明的技术思想以及范围限定于此。
35.本发明的组织再生用水凝胶组合物包含阴离子多糖、胺化透明质酸以及胶原蛋白，优选地，包含1重量百分比至10重量百分比的阴离子多糖、0.1重量百分比至2重量百分比的胺化透明质酸以及0.1重量百分比至3重量百分比的胶原蛋白。
36.如上所述，通过使用由阴离子多糖、胺化透明质酸以及胶原蛋白组成的水凝胶，来在呈现出能够维持快速交联结合以及打印的结构物的机械特性的同时，还呈现出可向皮肤软组织进行注射注入的特性，从而可消除生物材料的局限性。
37.并且，由于可向由上述成分组成的水凝胶组合物添加源自组织的细胞外基质成分或添加特定的细胞分化调节物质，因而还可诱导分化成特定组织。
38.并且，本发明中所使用的“水凝胶”意味着可用作药物传递以及生物组织合成材料的水膨润型高分子。这种水膨润型高分子意味着虽吸水但不溶于水的高分子，即，保有充分的水膨润性的亲水性高分子，由于可与细胞以及生长因子相混合，因而可提供更具生物相容性的支撑体。
39.上述阴离子多糖的含量可达到1重量百分比至10重量百分比，重均分子量为100kda至500kda，由50重量百分比至70重量百分比的β-d-甘露糖醛酸(β-d-mannuronic acid)以及30重量百分比至50重量百分比的α-l-古罗糖醛酸(α-l-guluronic acid)组成，相对于本发明的组织再生用水凝胶组合物的总重量百分比，上述阴离子多糖的含量可达到1重量百分比至10重量百分比，可优选为4重量百分比至10重量百分比。
40.若上述阴离子多糖的含量小于1重量百分比或大于10重量百分比，则将在添加2价阳离子时不会形成蛋盒(egg box)，或者即使局部形成蛋盒，也无法形成非水溶性水凝胶。
41.上述胺化透明质酸的含量为0.1重量百分比至2重量百分比，重均分子量为100kda至500kda，优选地，胺化透明质酸使用透明质酸的羟基氢原子中的至少一部分被具有季铵阳离子基团的基取代的。
42.如上所述的具有季铵阳离子基的透明质酸的含量达到第一水凝胶的0.1重量百分比至2重量百分比，优选为0.5重量百分比至1重量百分比，若上述胺化透明质酸的含量大于2重量百分比，则会因与水凝胶组合物的具备阴离子性的多糖类共存，而借助与胺化透明质酸之间的两者的静电相互作用来形成聚离子复合物并局部沉淀不均匀的非水溶性凝胶，若上述胺化透明质酸的含量小于0.1重量百分比，则会产生无法在溶剂上很好地形成与胶原蛋白之间的β-折叠的问题。
43.上述胶原蛋白的含量为0.1重量百分比至3重量百分比，由重均分子量为100kda至500kda的去端肽胶原蛋白组成，可从去端肽胶原蛋白中选择去端肽i型胶原蛋白、去端肽ii型胶原蛋白、去端肽iii型胶原蛋白中的任意一种乃至一种以上来使用，优选地，使用官能团末端被琥珀酸或硫化键取代的。
44.在组织再生用水凝胶组合物中，上述胶原蛋白的含量为0.1重量百分比至3重量百分比，优选为0.5重量百分比至1.5重量百分比，若上述胶原蛋白的含量大于3重量百分比，将会因溶剂而快速产生转换成β-折叠，将形成局部不均匀，将无法制备均匀的水凝胶组合物以及支撑体，若上述胶原蛋白的含量小于0.1重量百分比，则虽然在水凝胶组合物状态下呈现出均匀的形状，但会在制备支撑体的过程中产生不均匀的纤维化现象。
45.并且，在本发明的组织再生用水凝胶组合物中，相对于100重量份的上述组织再生用水凝胶组合物所包含的阴离子多糖，还可包含150重量份至400重量份的2价阳离子以及0.1重量份至2重量份的甲醇，若以如上所述的方式还包含阳离子，则本发明的组织再生用水凝胶组合物将成为非水溶性。
46.在此情况下，优选地，上述2价阳离子的质量浓度为0.5％至2％，由碱土金属或其化合物组成，更优选地，上述碱土金属由铍、镁、钙、锶、钡以及镭组成。
47.并且，上述甲醇将在使组织再生用水凝胶组合物以如上所述的方式实现非水熔化的过程中起到对水凝胶组合物的结构施加变化的作用，优选地，质量浓度为40％至60％。
48.通过混合上述2价阳离子和甲醇来使水凝胶组合物非水熔化的过程不受特殊限制，但优选地选择适合产品的均匀性以及大量生产的制备方式来使用，更详细地，在制备水
凝胶组合物后喷射2价阳离子，在添加甲醇后在0℃至60℃的温度下施加-0.05mpa的负压，来去除甲醇，从而实现水凝胶组合物的非水熔化，这更为优选。
49.在此情况下，上述温度以及负压的条件并不限定本发明的权利范围，可实现多种变更，上述甲醇去除工序还可利用将透析膜用到其中的工序，而并不限定于温度以及负压的方法。
50.并且，优选地，在本发明的组织再生用水凝胶组合物中，相对于100重量份的上述组织再生用水凝胶组合物，还可包含0.1重量份至1重量份的添加剂，上述添加剂由选自由细胞、细胞生长因子、缓冲剂、防腐剂、等渗调节剂、盐、抗氧化剂、渗透压调节剂、乳化剂、润湿剂、甜味剂、香料剂、麻醉剂组成的组中的一种以上组成。
51.在此情况下，上述细胞由选自由干细胞、感觉细胞、脑细胞、生殖细胞、上皮细胞以及免疫细胞组成的组中的一种以上组成。
52.并且，例如，上述麻醉剂可以为氨基酰胺(aminoamide)局部麻醉或氨基酯(aminoester)局部麻醉等局部麻醉剂。局部麻醉剂的例有利多卡因(lidocaine)、氨布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米洛卡因(amylocaine)、奥布卡因(benoxinate)、苯佐卡因(bensocaine)、贝托卡因(betoxycaine)、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布大卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、丁胺卡因(butethamine)、丁托西卡因(butoxycaine)、卡铁卡因(carticaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、可卡乙碱(cocaethylene)、环美卡因(cyclomethycaine)、地布卡因(dibucaine)、奎尼卡因(dimethisoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、地哌冬(diperodon)、双环胺(dicyclomine)、去水芽子碱(ecgonidine)、爱抗宁(ecgonine)、氯乙烷(ethyl chloride)、依替卡因(etidocaine)、β-优卡因(β-eucaine)、尤普罗辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(formocaine)、海克卡因(hexylcaine)、羟丁卡因(hydroxytetracaine)、对胺苯甲酸异丁酯(isobutyl p-aminobenzoate)、甲磺酸亮氨卡因(leucinocaine mesylate)、左沙屈尔(levoxadrol)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、甲丙胺卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷(methyl chloride)、麦替卡因(myrtecaine)、纳依卡因(naepaine)、奥他卡因(octacaine)、俄妥卡因(orthocaine)、奥昔卡因(oxethazaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、芬那卡因(phenacaine)、苯酚(phenol)、皮珀罗卡因(piperocaine)、哌啶卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、普拉莫辛(pramoxine)、丙胺卡因(prilocaine)、普鲁卡因(procaine)、普鲁派奴卡因(propanocaine)、丙美卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假可卡因(pseudococaine)、吡咯卡因(pyrrocaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、水杨醇(salicyl alcohol)、丁卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、佐拉敏(zolamine)、它们的组合物以及它们的盐，但并不限定于此。氨基酯(aminoester)局部麻醉剂的例有普鲁卡因(procaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、可卡因(cocaine)、环美卡因(cyclomethycaine)、二甲卡因(拉罗卡因)(dimethocaine(larocaine))、丙氧卡因(propoxycaine)、普鲁卡因(奴佛卡因)(procaine(novocaine))、丙美卡因(proparacaine)、丁卡因(阿美索卡因)(tetracaine(amethocaine))，但并不限定于此。氨基酰胺(aminoamide)的局部麻醉剂的非限定性例包括阿替卡因(articaine)、布比卡因
(bupivacaine)、辛可卡因(地布卡因)(cinchocaine(dibucaine))、依替卡因(etidocaine)、左布比卡因(levobupivacaine)、利多卡因(利诺卡因)(lidocaine(lignocaine))、甲哌卡因(mepivacaine)、皮珀罗卡因(piperocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、三甲卡因(trimecaine)或它们的组合。
53.若包含由如上所述的成分组成的添加剂，则本发明的水凝胶组合物能够以改善皮肤状态、消除皱纹、改善面部或身体轮廓的目的进行使用。不仅如此，可有用地用作真皮填充剂。
54.以下，通过实施例对本发明的组织再生用水凝胶组合物的制备方法以及利用通过其制备方法制备的水凝胶组合物制备支撑体的方法和各个物性进行说明。
55.《制备例1》注射注入用水凝胶组合物的制备
56.在常温条件下，混合7重量百分比的重均分子量为100kda至500kda的阴离子多糖(以50:50混合β-d-甘露糖醛酸和α-l-古罗糖醛酸)，之后混合0.7重量百分比的重均分子量为100kda至500kda的胺化透明质酸来制备混合物，在将上述混合物的ph维持在6.0之后，混合1重量百分比的重均分子量为100kda至500kda的去端肽i型胶原蛋白，从而制备了注射注入用水凝胶组合物。
57.《制备例2》制备包含添加剂的注射注入用水凝胶组合物
58.在100重量份的通过上述制备例1制备的注射注入用水凝胶组合物中混合0.5重量份的添加剂(混合有缓冲剂、渗透压调节剂、乳化剂、利多卡因)来制备了包含添加剂的注射注入用水凝胶组合物。
59.《制备例3》制备注射注入用非水溶性水凝胶组合物
60.在常温条件下，在通过上述制备例1制备的水凝胶组合物中混合质量浓度为1％的氯化钙并按100rpm的速度进行搅拌来产生反应，之后投入质量浓度为60％的甲醇，之后在常温条件下按500rpm的速度进行搅拌，在结束搅拌后，通过透析膜或旋转式真空蒸发器去除残留甲醇，从而制备了注射注入用非水溶性水凝胶组合物。
61.《制备例4》制备包含添加剂的注射注入用非水溶性水凝胶组合物
62.在常温条件下，在通过上述制备例2制备的水凝胶组合物中混合质量浓度为1％的氯化钙并按100rpm的速度进行搅拌来产生反应，之后投入质量浓度为60％的甲醇，之后在常温条件下按500rpm的速度进行搅拌，在结束搅拌后，通过透析膜或旋转式真空蒸发器去除残留甲醇，从而制备了注射注入用非水溶性水凝胶组合物。
63.《制备例5》制备三维打印用水凝胶支撑体
64.在常温下，混合7重量百分比的第一溶液(在常温下，以50:50混合重均分子量为100kda至500k的β-d-甘露糖醛酸和α-l-古罗糖醛酸来制备)和质量浓度为1％的氯化钙并按100rpm的速度进行搅拌来产生反应且干燥后制备支撑体，将所制备的支撑体浸渍于第二溶液(在使重均分子量为100kda至500kda的胺化透明质酸的ph维持在6.0之后，混合1重量百分比的重均分子量为100kda至500kda的去端肽i型胶原蛋白来制备)来使第二溶液渗透到支撑体的内部，之后将渗透进第二溶液的支撑体浸渍于质量浓度为60％的甲醇并进行真空干燥，从而制备了三维打印用水凝胶支撑体。
65.《制备例6》制备包含添加剂的三维打印用水凝胶支撑体
66.以与上述制备例5相同的方式进行，但第一溶液如下制备，即，在常温下以50:50混
合重均分子量为100kda至500k的β-d-甘露糖醛酸和α-l-古罗糖醛酸而成的混合物中混合0.5重量份的添加剂(混合缓冲剂、渗透压调节剂、乳化剂、利多卡因)而制成，从而制备了包含添加剂的三维打印用水凝胶支撑体。
67.《实施例1》基于2价阳离子的浓度进行制备
68.测定基于2价阳离子的浓度的固体状态的变化，并将其显示在表1。
69.表1
[0070][0071]
在上述表1中示出了基于2价阳离子的浓度以及β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸混合物的浓度的状态变化，当上述β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度达到在第一水凝胶中占4重量百分比时，若钙离子的质量浓度达到1.0％至1.5％，则形成了图4所示的状态。
[0072]
并且，当上述β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度达到在水凝胶组合物中占6重量百分比时，若钙离子的质量浓度达到0.5至1.0％，则形成了图4所示的状态，若钙离子的质量浓度达到1.5％，则形成了图1所示的坚硬的凝胶。
[0073]
并且，当上述β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度达到在水凝胶组合物中占8重量百分比时，若钙离子的质量浓度达到0.5％，则形成了图4所示的状态，若钙离子的浓度达到1.0％，则形成了图1所示的坚硬的凝胶。
[0074]
并且，当上述β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度达到在水凝胶组合物中占10重量百分比时，若钙离子的质量浓度达到0.5％，则形成了图4所示的状态。
[0075]
如上述表1所示，根据β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度以及2价阳离子的浓度来以注射注入用以及三维打印用支撑体区分适用范围。在此情况下，上述钙离子的投入量与β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的投入比为3:7。
[0076]
《实施例2》基于2价阳离子的浓度的形态变化
[0077]
在上述实施例1中，相对于水凝胶组合物，使得β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度达到4重量百分比、6重量百分比、8重量百分比、10重量百分比，测定了基于2价阳离子的浓度的形态变化。
[0078]
表2
[0079][0080][0081]
如上述表2所示，虽然根据β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度以及2价阳离子的浓度，凝胶的拉伸强度大部分增加，但在混合物的浓度增加的同时，若2价阳离子的浓度变高，则β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的内部羧基和2价阳离子急剧产生蛋盒，因而会产生不稳定的凝胶化。
[0082]
《实施例3》β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸、胺化透明质酸以及胶原蛋白混合物的形态变化
[0083]
表3
[0084][0085]
如上述表3所示，与上述表2相同，虽然根据β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的混合物的浓度以及2价阳离子的浓度，凝胶的拉伸强度大部分增加，但在混合物的浓度增加的同时，若2价阳离子的浓度变高，则β-d-甘露糖醛酸、α-l-古罗糖醛酸的内部羧基和2价阳离子急剧产生蛋盒，因而会产生不稳定的凝胶化。即，不受基于2价阳离子的浓度的蛋盒化的影响。
[0086]
《实验例1》制备例3中的水凝胶细胞毒性实验
[0087]
按10wt％将通过上述制备例3制备的水凝胶组合物溶解于pbs，在该混合物添加1
×
106/10μl的纤维原细胞(fibroblast)。将混合有细胞的溶液在deme培养基(10％的胎牛
血清(fbs)、1％的抗生素(antibiotic))培养3天，之后利用活/死细胞试剂盒(live and dead kit)实施了细胞毒性实验。
[0088]
观察结果，3天后细胞存活率平均呈现出96％以上。
[0089]
《实验例2》制备例5中的水凝胶支撑体的细胞毒性实验
[0090]
按10wt％将通过上述制备例5制备的水凝胶支撑体溶解于pbs，在该混合物添加1
×
106/10μl的纤维原细胞。将混合有细胞的溶液在deme培养基(10％的胎牛血清、1％的抗生素)培养3天，之后利用活/死细胞试剂盒实施了细胞毒性实验。
[0091]
观察结果，3天后细胞存活率平均呈现出98％以上。