病毒载体生产的效价测定的制作方法

病毒载体生产的效价测定
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月8日提交的美国临时申请号62/884,252的优先权，所述美国临时专利申请以引用的方式整体并入本文。


背景技术：

3.病毒载体介导的基因治疗是一个快速发展的治疗领域。在用作治疗之前，将需要评估治疗性病毒载体的许多方面以确定安全性和功效。
4.因此，仍然需要用于确定重组病毒载体的效价的改进方法。特别地，需要允许改进对由重组病毒载体表达的有效载荷(例如多肽)的效价的确定的方法。


技术实现要素：

5.本说明书尤其包括用于确定重组病毒载体的效价(例如，生物活性)，例如相对效价的方法。与用于确定由重组病毒载体表达的有效载荷(例如，多肽，诸如smn多肽)的效价的现有方法相比，本文所述的方法具有改进的特征。在一些实施方案中，相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞，使用具有降低的至少一种有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的表达的修饰的宿主细胞允许改进本文所述的重组病毒载体的效价测定。在一些实施方案中，与其他类型的宿主细胞(例如，原代细胞和/或非人哺乳动物细胞，例如，小鼠细胞)相比，本文所述的方法中使用的修饰的宿主细胞(例如，人修饰的宿主细胞，例如sh-sy5y kd细胞)更具生理学相关性和/或更易于培养。在一些实施方案中，sh-sy5y kd细胞包含smn基因(例如，smn1或smn2基因)中的敲低(例如，组成型或条件型)，例如，包含或表达针对smn基因(例如，smn1或smn2基因)的抑制性核酸，例如针对smn1的shrna(例如，针对smn1基因的强力霉素诱导型shrna，例如shrna120或shrna 128)。
6.此类改进的特征可以包括但不限于：(i)该方法可在完全不使用辅助功能(例如ad2或ad5辅助病毒)的情况下进行；(ii)与用相同类型或不同类型的未修饰的参考宿主细胞进行转导相比，转导可能需要较低量的重组病毒载体；(iii)该方法具有低标准偏差；(iv)可以约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的准确度确定效价；(v)可以约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的精确度确定效价；(vi)该方法可以表明本文所述的重组病毒载体的稳定性，例如在重组病毒载体的热应激之后；(vii)本文所述的重组病毒载体的效价不受空衣壳存在的影响；以及/或(viii)能够由于选择修饰的宿主细胞系(例如，包含smn基因(例如，smn1或smn2基因)中的敲低(例如组成型或条件型)的sh-sy5y kd细胞，例如，包含或表达针对smn基因(例如，smn1或smn2基因)的抑制性核酸，例如，针对smn1的shrna(例如，针对smn1基因的强力霉素诱导型shrna，例如，shrna120或shrna 128))而实现高信噪比。
7.在一方面，本公开提供了确定编码至少一种smn多肽的重组病毒载体的效价的方法，所述方法包括：(a)用重组病毒载体转导修饰的宿主细胞，其中修饰的宿主细胞包含相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞降低的至少一种smn多肽的表达；(b)使修饰的宿主
细胞与用于检测smn多肽的第一剂接触；(c)使修饰的宿主细胞与包含用于检测第一剂的检测部分的第二剂接触；以及(d)检测螺旋体双子(gem)的存在，从而确定至少一种smn多肽的效价。
8.在一些实施方案中，重组病毒载体包括腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体包括慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，aav载体包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11或其变体。在一些实施方案中，aav载体包括aavhu68。在一些实施方案中，aav载体包含与鸡-β肌动蛋白启动子(cb7)可操作地连接的smn1基因。在一些实施方案中，aav载体包含位于smn1基因的两个itr。在一些实施方案中，aav载体包含兔β-球蛋白polya信号。
9.在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包含smn1基因的条件性敲低或敲除。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包含至少一种用于条件性敲低smn1基因的shrna。在一些实施方案中，至少一种shrna：(i)包括shrna120或shrna 128，并且/或(ii)不靶向或影响本文所述的重组病毒载体。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是人类细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是sh-sy5y细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是sh-sy5y kd细胞。
10.在一些实施方案中，在转导之前，进行以下中的一项或多项：(i)将宿主细胞冷冻和解冻至少一次；(ii)将修饰的宿主细胞至少传代3次；(iii)用强力霉素处理宿主细胞(例如，以诱导smn基因的敲低)；并且/或(iv)以约5.0
×
103至约5.0
×
104个细胞/孔的密度接种宿主细胞。
11.在一些实施方案中，修饰的宿主细胞在24小时内被接种并转导。在一些实施方案中，转导步骤在通过连续稀释获得的约5种不同moi下进行。在一些实施方案中，转导步骤(b)以约6.1
×
105vg/细胞至约4
×
106vg/细胞(例如约6.1
×
105vg/细胞、约9.8
×
105vg/细胞、约1.6
×
106vg/细胞、约2.5
×
106vg/细胞和约4
×
106vg/细胞)的moi进行。在一些实施方案中，信噪比大于或为约2.5。
12.在一些实施方案中，第一剂包含抗smn1抗体或其抗原结合片段或适体。在一些实施方案中，检测部分包含或者是荧光、比色或酶标记。在一些实施方案中，第二剂包含荧光标记的二级抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，通过免疫荧光检测gem的存在。在一些实施方案中，通过成像检测gem的存在。在一些实施方案中，成像包括或者是高内涵成像(hci)。
13.在一些实施方案中，本文所述的方法在不使用或基本上不使用至少一种辅助功能的情况下进行。在一些实施方案中，至少一种辅助功能包括ad2或ad5辅助病毒。
14.在一些实施方案中，与用相同类型或不同类型的未修饰的参考宿主细胞进行转导相比，转导需要较低量的重组病毒载体。在一些实施方案中，本文所述的方法具有低标准偏差。
15.在一些实施方案中，以约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的准确度确定效价。在一些实施方案中，以约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的精确度确定效价。
16.在一些实施方案中，本文所述的方法表明重组病毒载体的稳定性，例如在重组病
毒载体的热应激后。在一些实施方案中，重组病毒载体的效价不受空衣壳存在的影响。在一些实施方案中，重组病毒载体包含多个空病毒衣壳。
17.本文中对出版物、专利或专利申请的任何引用通过全文引入的方式并入。本技术中使用的带有或不带有约/大约的任何数字均意在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
18.本发明的其他特征、目的和优点在下面的详细描述中是显而易见的。然而，应该理解的是，尽管指示了本发明的实施方案，但详细描述仅以示例的方式给出，而不是限制性的。本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将通过详细描述而变得显而易见。
附图说明
19.以下描述的各图共同构成了附图，其仅用于说明目的，而非用于限制。
20.图1显示hela-rc32细胞中gem检测的高可变性。将hela-rc32细胞平铺在96孔板的每个孔中。在共感染前24小时，在50的moi下以raavhu68-smn1(1
×
106至3.1
×
104vg/细胞)和人腺病毒5的滴定曲线接种细胞。细胞被感染2天，然后固定并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
21.图2显示smn1在sh-sy5y shrna120和sh-sy5y shrna 128dox处理的细胞中的敲低。未经处理的细胞被胰蛋白酶化、离心，然后以每6孔板1
×
106个细胞接种或在-70℃下冷冻(t＝0)。在收获前用dox(100μg/ml)处理接种的细胞3天和7天。将收获的细胞在pbs中洗涤，离心并将沉淀在-70℃下冷冻。使用odyssey红外成像系统(li-cor biosciences)根据制造商的方案进行蛋白质印迹法。从免疫印迹量化的数据通过负载对照：微管蛋白进行归一化。
22.图3显示sh-sy5y sh120细胞的细胞传代与形成的gem数量之间的相关性。将第11、15和25代细胞(左图)和第4、7和15代细胞(右图)用dox(100μg/ml)处理3天并冷冻。在感染前24小时，将1
×
104个解冻的细胞平铺在tc处理的96孔板的每个孔中。以raavhu68-smn1(4
×
10
6-6.1
×
105vg/细胞)的滴定曲线感染细胞2天，然后固定并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像检测gem/细胞的数量。
23.图4显示培养中的和“解冻后的”sh-sy5y sh120细胞的比较。将2
×
104个培养中的或“解冻后”的细胞平铺在pdl涂覆的96孔板的每个孔中。在感染前24小时，以raavhu68-smn1(2
×
10
6-6.25
×
104vg/细胞)的滴定曲线平铺细胞。细胞被感染2天，并且然后固定并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
24.图5显示sh-sy5y sh120细胞的最佳细胞密度的确定。将用dox(100μg/ml)预处理的解冻的sh-sy5y sh120细胞以以下密度平铺：(a)2、2.5和3
×
104个细胞/孔，(b)1.5和2
×
104个细胞/孔以及(c)1
×
104个细胞/孔，并用1:2(a和b)或1:1.5(c)连续稀释的raavhu68-smn1感染。将细胞处理2天，然后如td-tdmp-990中所述固定并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
25.图6显示sh-sy5y sh120细胞的感染长度对测定性能的影响。在感染前24小时，以raavhu68-smn1(2
×
10
6-2.1
×
104vg/细胞)的滴定曲线将2
×
104个细胞/孔平铺于tc处理的96孔板中。在感染后48或72小时后固定细胞并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通
过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
26.图7显示用raavhu68-smn1处理sh-sy5y sh120细胞的当天与次日的比较。将1
×
104个细胞/孔平铺在tc处理的96孔板中。在感染前6或24小时，以raavhu68-smn1(4
×
10
6-6.1
×
105vg/细胞)的滴定曲线接种细胞。将细胞温育2天，然后固定并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
27.图8显示用和不用人腺病毒5感染的sh-sy5y sh120细胞。将2
×
104个培养细胞平铺在pdl涂覆的96孔板的每个孔中。在感染前24小时，在50的moi下以raavhu68-smn1(1
×
10
6-3.1
×
104vg/细胞)
±
人腺病毒5的滴定曲线接种细胞。细胞被感染2天，然后固定并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
28.图9显示sh-sy5y kd细胞在4℃和室温下的固定的比较。将用dox(100μg/ml)预处理的sh-sy5y sh120细胞以1
×
104个细胞/孔平铺并用1:1.6连续稀释的raavhu68-smn1感染。将细胞处理2天，然后在4℃或室温下在4％pfa/pbs中固定20分钟，然后针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
29.图10显示封闭缓冲液的比较。将sh-sy5y kd细胞以1
×
104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在第二天用raavhu68-smn1感染2天。将sh-sy5y kd细胞在li-cor封闭试剂或5％ngs/pbs中封闭1小时，然后针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
30.图11显示效价测定是可重复的。将2
×
104个培养的sh-sy5y kd细胞平铺在聚-d-赖氨酸(pdl)涂覆的96孔板的每个孔中。在感染前24小时，以raavhu68-smn1(2
×
10
6-6.25
×
104vg/细胞)的滴定曲线接种细胞。sh-sy5y kd细胞被感染2天，然后固定并针对smn进行染色。使用cx5 cellinsight通过高内涵成像评估gem/细胞的数量。
31.图12显示空粒子对raavhu68-smn1效价的影响。将用dox(100μg/ml)预处理的sh-sy5y sh120细胞以1
×
104个细胞/孔平铺，以1:1和1:3的每孔最终完整:空粒子比感染raavhu68-smn1(4
×
106vg/细胞)和空aavhu68粒子。衣壳的混合是基于aav9衣壳滴度进行的。
32.图13a-b显示在使用cx5 cellinsight进行1:1丙酮:甲醇固定后，在sh-sy5y kd细胞(用shrna120敲低)中gemin 2-smn1染色的示例性图像。合并的图像显示smn1和gemin 2的重叠信号。
33.图14显示smn1抗体特异性检测细菌纯化的smn蛋白。100和200ng纯化的smn蛋白和200ng无关蛋白(rs1)通过sds-page分析并用smn1抗体印迹。mono.：单克隆抗体；poly.：多克隆抗体；i.b.：免疫印迹。
34.图15显示通过蛋白质印迹测试smn1抗体的特异性和敏感性。通过sds-page分析50ng细菌纯化的smn蛋白或50ng hek293t全细胞裂解物，并在4℃下用上表中所述的smn1抗体印迹过夜。n.b.：novus biological；t.f.：thermo-fisher；mono.：单克隆抗体；poly.：多克隆抗体；i.b.：免疫印迹。
35.定义
36.在本技术中，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一”可理解为意指“至少一个”；(ii)术语“或”可理解为意指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是单独呈现还是与一个或多个附加组分或步骤一起呈现；(iv)术语“约”和“大约”可理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员所理解的；并且(v)在提供范围的情况下，包括端点。
37.约或大约：如本文所用，关于数值的术语“约”或“大约”通常被认为包括在数值的任一方向(大于或小于)上落入5％、10％、15％或20％的范围内的数值，除非另有说明或从上下文中明显看出(除非该数值小于0％或超过可能值的100％)。
38.抗体：如本文所用，术语“抗体”是指包含足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的标准免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域所知，天然产生的完整抗体是约150kd的四聚体剂，其包含两个相同的重链多肽(各自为约50kd)和两个相同的轻链多肽(各自为约25kd)，它们相互结合成通常称为“y形”结构的结构。每条重链包含至少四个结构域(每个长度为约110个氨基酸)—氨基末端可变(vh)结构域(位于y结构的末端)，然后是三个恒定结构域：ch1、ch2和羧基末端ch3(位于y的茎的碱基)。称为“开关”的短区连接重链可变区和恒定区。“铰链”将ch2和ch3结构域与抗体的其余部分连接。该铰链区的两个二硫键将完整抗体中的两条重链多肽彼此连接。每条轻链由两个结构域组成——氨基末端可变(vl)结构域，然后是羧基末端恒定(cl)结构域，由另一个“开关”彼此分开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键使重链铰链区彼此连接，从而使二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也是糖基化的，通常在ch2结构域上。天然抗体中的每个结构域都具有以“免疫球蛋白折叠”为特征的结构，该结构由在压缩的反平行β桶中彼此紧靠包装的两个β折叠片(例如，3-、4-或5-链折叠片)形成。每个可变结构域包含三个称为“补体决定区”(cdr1、cdr2和cdr3)的高变环和四个稍微不变的“框架”区(fr1、fr2、fr3和fr4)。当天然抗体折叠时，fr区形成为结构域提供结构框架的β折叠片，并且来自重链和轻链的cdr环区在三维空间中聚集在一起，从而形成位于y结构末端的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的fc区与补体系统的元件结合，并且也与效应细胞上的受体结合，包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域已知，fc区对fc受体的亲和力和/或其他结合属性可以通过糖基化或其他修饰来调节。在一些实施方案中，根据本发明产生和/或利用的抗体包括糖基化的fc结构域，包括具有修饰或工程改造的此类糖基化的fc结构域。出于本发明的目的，在某些实施方案中，包括在天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以被称为和/或用作“抗体”，无论此类多肽是天然产生的(例如，由与抗原反应的生物体产生)，或由重组工程、化学合成或其他人工系统或方法产生。在一些实施方案中，抗体是多克隆的；在一些实施方案中，抗体是单克隆的。在一些实施方案中，抗体具有作为小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特征的恒定区序列。在一些实施方案中，如本领域已知，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。此外，如本文使用的术语“抗体”在适当的实施方案中(除非另有说明或从上下文中显而易见)可以指代任何本领域已知或开发的构建体或形式，用于在替代呈现中利用抗体结构和功能特征。例如，在一些实施方案中，根据本发明使用的抗体是选自但不限于以下的形式：完整的iga、igg、ige或igm抗体；双特异性或多特异性抗体(例如，等)；抗体片段诸如fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fd'片段、fd片段和分离的cdr或其集合；单链fvs；多肽-fc融合体；单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体，诸如ignar或其片段)；骆驼抗体；掩蔽抗体(例如，)；small modular immunopharmaceuticals(“smip
tm”)；单链或串联双链
抗体vhh；vhh；微型抗体；锚蛋白重复蛋白或dart；tcr样抗体；microprotein；以及在一些实施方案中，抗体可能缺乏天然产生时它会具有的共价修饰(例如，聚糖的连接)。在一些实施方案中，抗体可以包含共价修饰(例如，聚糖、有效载荷[例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其他侧基[例如，聚乙二醇等]的连接)。
[0039]
腺相关病毒(aav)：如本文所用，术语“腺相关病毒”和“aav”是指整个或部分的细小病毒科(parvoviridae)和依赖细小病毒属(dependoparvovirus)的病毒颗粒。aav是一种小型复制缺陷型无包膜病毒。aav包括但不限于aav血清型1、aav血清型2、aav血清型3(包括血清型3a和3b)、aav血清型4、aav血清型5、aav血清型6、aav血清型7、aav血清型8、aav血清型9、aav血清型10、aav血清型11、aav血清型12、aav血清型13、蛇aav、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav、山羊aav、虾aav和任何前述的任何变体。野生型aav是复制缺陷型的，并且通常需要辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)共感染细胞以便复制。
[0040]
适体：如本文所用，术语“适体”是指由与特定分子靶标(例如smn多肽)紧密结合的核酸(例如rna、dna)组成的大分子。特定适体可以由线性核苷酸序列描述，并且长度通常为约15-60个核苷酸。不希望受任何理论束缚，预期适体中的核苷酸链形成分子内相互作用，其将分子折叠成复杂的三维形状，并且该三维形状允许适体与靶分子的表面紧密结合。鉴于存在于所有可能的核苷酸序列范围内的分子形状的非常多样性，可获得用于包括蛋白质和小分子在内的多种分子靶标的适体。除了高特异性之外，适体通常对其靶标具有非常高的亲和力(例如，对蛋白质的亲和力在皮摩尔至低纳摩尔范围内)。在许多实施方案中，适体是化学稳定的并且可以煮沸或冷冻而不丧失活性。由于它们是合成分子，适体可以进行各种修饰，这可以针对特定应用优化其功能。例如，可以修饰适体以显著降低其对体内应用中使用的血液中酶降解的敏感性。此外，可以修改适体以改变其生物分布或血浆停留时间。
[0041]
包含：本文描述为“包含”一个或多个命名的要素或步骤的组合物或方法是开放式的，意味着命名的要素或步骤是必要的，但在组合物或方法的范围内可以添加其他要素或步骤。为了避免冗长，还应理解，描述为“包含(comprising)”(或其“包含(comprises)”)一个或多个命名的要素或步骤的任何组合物或方法也描述了相应的、更有限的组合物或方法“基本上由相同的命名的要素或步骤组成”(或其“基本上由相同的命名的要素或步骤组成”)，意味着该组合物或方法包括命名的基本要素或步骤，并且还可以包括不会实质性影响组合物或方法的基本和新颖特征的附加要素或步骤。还应理解，本文描述为“包含一个或多个命名的要素或步骤”或“基本上由其组成”的任何组合物或方法也描述了相应的、更有限的和封闭式的组合物或方法“由命名的要素或步骤组成”(或“由其组成”)，以排出任何其他未命名的要素或步骤。在本文公开的任何组合物或方法中，任何命名的基本要素或步骤的已知或公开的等效物可以替代该要素或步骤。
[0042]
检测部分：如本文所用，术语“检测部分”是指任何可检测的元素、分子、官能团、化合物、片段或部分。在一些实施方案中，单独提供或使用检测部分。在一些实施方案中，提供和/或利用与另一种剂(例如，抗体或其抗原结合片段)结合(例如，连接)的检测部分。检测
部分的实例包括但不限于：各种荧光染料(例如，荧光团(例如，alexa-fluor 488、fluoprobes 488或dylight 488)、荧光素染料、吖啶染料、sybr染料、罗丹明染料、噁嗪染料等)、配体、放射性核素(例如3h、
14
c、
18
f、
19
f、
32
p、
35
s、
135
i、
125
i、
123
i、
64
cu、
187
re、
111
in、
90
y、
99m
tc、
177
lu、
89
zr等)、化学发光剂(例如吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等)、电致化学发光剂(例如磺基标签)、生物发光剂(例如，荧光素)、光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(例如量子点)、金属纳米粒子(例如金、银、铜或铂)、纳米团簇、顺磁性金属离子、酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、比色标记(例如染料或胶体金)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原和可用抗血清或单克隆抗体的蛋白质。
[0043]
确定：本文所述的许多方法包括“确定”步骤。阅读本说明书的本领域普通技术人员将理解，这种“确定”可以利用或通过使用本领域技术人员可用的多种技术中的任一种来完成，包括例如本文明确提及的特定技术。在一些实施方案中，确定涉及物理样品的操作。在一些实施方案中，确定涉及数据或信息的考虑和/或操纵，例如利用适于执行相关分析的计算机或其他处理单元。在一些实施方案中，确定涉及从来源接收相关信息和/或材料。在一些实施方案中，确定涉及将样品或实体的一个或多个特征与可比较的参考进行比较。
[0044]
表达：如本文所用，核酸序列的术语“表达”或“编码”是指以下事件中的一种或多种：(1)从dna序列产生rna模板(例如，通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)将rna翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
[0045]
片段：如本文所用，术语“片段”或“部分”是指包括整体的离散部分但缺少在整个结构中发现的一个或多个部分的结构。在一些实施方案中，片段由此类离散部分组成。在一些实施方案中，片段由在整体中发现的特征结构元件或部分组成或包含所述特征结构元件或部分。在一些实施方案中，核苷酸片段包含在整个核苷酸发现的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个单体单元(例如，核酸)或由其组成。在一些实施方案中，核苷酸片段包含在整个核苷酸中发现的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的单体单元(例如，残基)或由其组成。整个材料或实体在一些实施方案中可以被称为整体的“母体”。
[0046]
基因：如本文所用，术语“基因”是指编码产物(例如，rna产物和/或多肽产物)的dna序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)。在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可以包括编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列。在一些实施方案中，基因可以包括一种或多种调节元件，例如，其可以控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，诱导型表达等)。
[0047]
基因治疗：如本文所用，术语“基因治疗”是指插入或缺失特定基因组dna序列以治疗或预防寻求此类治疗的病症或疾患。在一些实施方案中，基因组dna序列的插入或缺失发生在特定细胞(例如，靶细胞)中。靶细胞可以来自哺乳动物并且/或可以是哺乳动物受试者中的细胞。哺乳动物包括但不限于人、狗、猫、牛、羊、猪、美洲驼等。在一些实施方案中，异源dna被转移至靶细胞。可以将异源dna引入选择的靶细胞中，以使异源dna被表达并产生由其
编码的治疗产物。另外或替代地，异源dna可以某种方式介导编码治疗产物的dna的表达，或者它可以编码以某种方式直接或间接介导治疗产物表达的产物，诸如肽或rna。基因治疗也可用于递送编码基因产物的核酸，该基因产物替代缺陷基因或补充由哺乳动物或引入它的细胞产生的基因产物。编码治疗产物的异源dna可以在引入患病宿主细胞之前进行修饰，以增强或以其他方式改变产物或其表达。基因治疗也可能涉及递送抑制剂或阻遏物或其他基因表达的调节剂。基因治疗可以包括体内或体外技术。在一些实施方案中，基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码所关注多肽的核酸引入哺乳动物细胞或靶组织。非病毒载体递送系统包括dna质粒、裸核酸和与递送载体复合的核酸，诸如泊洛沙姆或脂质体。病毒载体递送系统包括dna和rna病毒，它们在递送至细胞后具有附加体或整合的基因组。对于基因治疗程序的回顾，参见anderson,science 256:808-813(1992)；miller,nature 357:455-460(1992)；feuerbach等人,kidney international 49:1791-1794(1996)；urnov等人,nature reviews genetics 11,636
–
646(2010)；以及collins等人,proceedings biologicial sciences/the royal society,282(1821):pii 20143003(2015)，其每一篇均通过引用整体并入本文。
[0048]
辅助功能：如本文所用，术语“辅助功能”是指允许重组病毒载体(例如，aav)被宿主细胞复制和包装的功能。辅助功能可以多种形式中的任一种提供，包括但不限于作为辅助病毒或辅助病毒基因，其有助于重组病毒载体(例如，aav)复制和包装。辅助病毒基因包括但不限于腺病毒辅助基因，诸如e1a、e1b、e2a、e4和va。辅助病毒包括但不限于腺病毒、疱疹病毒、痘病毒如牛痘病毒和杆状病毒。腺病毒包括许多不同的亚组，尽管最常使用亚组c的5型腺病毒(ad5)。人类、非人类哺乳动物和鸟类来源的许多腺病毒是已知的，并且可从诸如atcc的保藏处获得。也可从诸如atcc的保藏处获得的疱疹科病毒包括例如单纯疱疹病毒(hsv)、埃-巴二氏病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)和伪狂犬病病毒(prv)。可从保藏处获得的杆状病毒包括苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(autographa californica nuclear polyhedrosis virus)。
[0049]
宿主细胞：如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入外源dna(重组或其他方式)的细胞。本领域技术人员在阅读本公开内容后将理解，此类术语不仅指特定受试者细胞，还指此类细胞的后代。在接续传代中由于突变或环境影响而可能发生某些修饰，因此此类后代可能实际上并不等同于亲代细胞，但其仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括选自适用于表达外源dna(例如，重组核酸序列)的任何生命界的原核和真核细胞。
[0050]“改善”、“增加”、“抑制”或“减少”：如本文所用，术语“改善”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等效形式表示相对于基线或其他参考测量的值。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或包括在特定系统中(例如，在例如培养基的单个样品中)在不存在(例如，之前和/或之后)特定剂或处理，或在存在适当的可比参考剂的其他可比条件下的测量。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或包括在已知或预期在相关剂或处理的存在下以特定方式响应的可比较系统中的测量。
[0051]
可操作地连接：如本文所用，术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。在一些实施方案中，调节元件“可操作地连接”至功能元件。在一些此类实施方案中，可操作地连接的调节元件以此类方式结合，即在与调
节元件相容的条件下实现功能元件的表达和/或活性。在一些实施方案中，“可操作地连接”的调节元件与所关注编码元件相邻(例如，共价连接)；在一些实施方案中，调节元件以反式作用或以其他方式作用于所关注功能元件。
[0052]
有效载荷：如本文所用，术语“有效载荷”是指希望被引入细胞、组织、器官、生物体和/或包含细胞的系统中的所关注核酸序列(例如，包含编码靶有效载荷诸如靶多肽的序列)。有效载荷可以是具有治疗目的的异源蛋白质，例如，酶或抗体。有效载荷可以是具有治疗目的的异源核酸，例如，crispr/cas指导rna。本领域技术人员将认识到有效载荷可以选自任何所关注异源蛋白质或核酸。
[0053]
多肽：如本文所用，术语“多肽”通常具有本领域公认的至少三个氨基酸的聚合物的含义。本领域普通技术人员将理解，术语“多肽”旨在是在足够通用以不仅涵盖具有本文所述的完整序列的多肽，而且涵盖代表此类完整多肽的功能片段(例如，保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域普通技术人员理解蛋白质序列通常耐受一些取代而不破坏活性。因此，保留活性并与相同类别的另一种多肽共有至少约30-40％总体序列同一性，通常大于约50％、60％、70％或80％，并且通常还包括至少一个更高同一性的区域，通常在一个或多个高度保守区域中大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％，通常包含至少3-4个并且通常最多20个或更多个氨基酸的任何多肽包含在本文所用的相关术语“多肽”内。多肽可以包含l-氨基酸、d-氨基酸或两者，并且可以包含本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括，例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。
[0054]
重组：如本文所用，术语“重组”旨在指通过重组方式设计、工程化、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；从重组的组合人多肽文库中分离的多肽；从动物(例如，小鼠、兔、绵羊、鱼等)分离的多肽，该动物是转基因的或已被操纵以表达编码和/或指导所述多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域表达的一种或多种基因或基因组分；和/或通过任何其他方式制备、表达、产生或分离的多肽，该方式涉及将选定的核酸序列元件彼此剪接或连接，化学合成选定的序列元件，和/或以其他方式产生编码和/或指导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域表达的核酸。在一些实施方案中，在自然界中发现一种或多种此类选定的序列元件。在一些实施方案中，在计算机上设计一种或多种此类选定的序列元件。在一些实施方案中，一种或多种此类选定的序列元件由已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)产生，所述已知序列元件例如来自天然或合成来源，例如在所关注来源生物体(例如，人、小鼠等)的种系中。
[0055]
参考：如本文所用，描述相对于其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将所关注剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，参考或对照基本上与所关注测试或确定同时进行测试和/或确定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。通常，如本领域技术人员所理解的，在与评估条件或情况相当的条件或情况下确定或表征参考或对照。本领域技术人员将理解，存在足够的相似性以证明对特定可能的参考或对照的依赖和/或比较是合理。
[0056]
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出所关注特征或性质的总体或接近
总体程度或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文用于捕捉许多生物和化学现象固有的潜在不完整性。
[0057]
转导：如本文所用，术语“转导”是指重组病毒载体进入一种或多种特定细胞类型并将包含在重组病毒载体中的dna转移到细胞中的能力。转导可以通过测量细胞或细胞群中由重组病毒dna表达的重组病毒dna或rna的量，和/或通过评估含有由dna表达的重组病毒dna或rna的群体中的细胞数目来评估。转导效率是来自起始量的重组病毒载体(例如体内注射或体外施用于细胞的起始量的载体)的转导水平的量度，并且可以是定量的或定性的，和/或参考特定对照，例如原型重组病毒载体。例如，如果候选重组病毒载体转导的细胞数量是对照载体的两倍，并且/或者用候选重组病毒载体转导的每个细胞的重组病毒dna的量是用对照载体转导的两倍，其中每种载体的起始量相同(例如，注射到受试者或施用于细胞的每种载体的量相同)，则可以说候选重组病毒载体的转导效率是对照载体的转导效率的200％，或者是对照载体的转导效率的两倍。
[0058]
载体：如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。作为非限制性实例，一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以连接到病毒基因组中。另一类载体为“质粒”，其是指其中可连接额外dna区段的环状双链dna环。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与其可操作地连接的基因表达。本文将此类载体称为“表达载体”。
[0059]
标准技术可用于重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常实现的或本文所述的进行。前述技术和程序通常可以根据本领域公知的常规方法进行，并且如在本说明书中通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。参见，例如，sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual(第2版,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.(1989))，其以全文引用的方式并入本文。
具体实施方式
[0060]
本公开尤其提供一种用于确定重组病毒载体的效价(例如，生物活性)的基于细胞的定量体外测定。本公开部分基于发现用于确定编码至少一种有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的重组病毒载体(例如，aav载体)的效价(例如，相对效价)的测定的发现，所述测定是定量的和准确的。特别是，本文所述的效价测定相对于现有方法得到改进，所述现有方法耗时长、繁琐且失败率相对较高。因此，本公开尤其提供用于确定重组病毒载体效价的改进方法和组合物，所述重组病毒载体可用于基因治疗的组合物中并用基因治疗方法治疗疾病和病症(例如脊髓性肌萎缩)。
[0061]
不希望受理论束缚，据信，在一些实施方案中，(i)相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞具有降低的至少一种有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的表达的修饰的宿主细胞；和/或(ii)检测螺旋体双子(gem)的存在，允许改进本文所述的重组病毒载体的效价测定。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的人修饰的宿主细胞(例如，包含smn基
因(例如，smn1或smn2基因)中的敲低(例如，组成型或条件型)的神经母细胞瘤细胞系，例如sh-sy5y kd细胞)相比于其他类型的宿主细胞(例如，原代细胞和/或非人哺乳动物细胞，例如，小鼠细胞)在生理学上更相关和/或更易于培养。在一些实施方案中，sh-sy5y kd细胞包含smn基因(例如，smn1或smn2基因)中的敲低(例如，组成型或条件型)，例如，包含或表达针对smn基因(例如，smn1或smn2基因)的抑制性核酸，例如针对smn1的shrna(例如，针对smn1基因的强力霉素诱导型shrna，例如shrna120或shrna 128)。
[0062]
重组病毒载体
[0063]
本公开尤其提供重组病毒载体(例如，腺相关病毒(aav)载体)。重组病毒载体已广泛用于将基因插入哺乳动物细胞(例如人类细胞)中。许多形式的载体可用于递送本文所述的有效载荷(例如，至少一种smn多肽)。表达载体的非限制性实例包括病毒载体(例如，适用于基因治疗的载体)、质粒载体、噬菌体载体、粘粒、噬菌粒和人工染色体。
[0064]
病毒载体的非限制性实例包括但不限于腺相关病毒(aav)、逆转录病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒或劳氏肉瘤病毒)、腺病毒、sv40型病毒、多瘤病毒、埃-巴二氏病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或脊髓灰质炎病毒。
[0065]
在一些实施方案中，重组病毒载体包括或者是逆转录病毒载体。逆转录病毒是属于逆转录病毒科的包膜病毒。用于生产复制缺陷型逆转录病毒的方案是本领域已知的(参见，例如，kriegler,m.,gene transfer and expression,a laboratory manual,w.h.freeman co.,new york(1990)和murry,e.j.,methods in molecular biology,第7卷,humana press,inc.,cliffton,n.j.(1991))。然后可以分离重组病毒并将其体内或体外递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的，例如参见美国专利号5,994,136、6,165,782和6,428,953。在一些实施方案中，逆转录病毒包括或者是逆转录病毒科的慢病毒。在一些实施方案中，慢病毒包括或者是人类免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、猴免疫缺陷病毒(s1v)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血(eia)或绵羊髓鞘脱落病毒。
[0066]
在一些实施方案中，重组病毒载体包括或者是腺病毒载体。腺病毒载体可以来自任何来源、任何亚组、任何亚型、亚型的混合物或任何血清型。例如，腺病毒可以属于亚组a(例如血清型12、18和31)、亚组b(例如血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50)、亚组c(例如，血清型1、2、5和6)、亚组d(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-48)、亚组e(例如血清型4)、亚组f(例如血清型40和41)、未分类的血清型(例如血清型49和51)或任何其他腺病毒血清型。腺病毒血清型1至51可获自美国典型培养物保藏中心(atcc,manassas,va.)。非c组腺病毒，甚至非人腺病毒可用于制备复制缺陷型腺病毒载体。非c组腺病毒载体、生产非c组腺病毒载体的方法和使用非c组腺病毒载体的方法公开于例如美国专利号5,801,030、5,837,511和5,849,561以及国际专利申请wo 97/12986和wo 98/53087中，所述专利中的每一者通过引用整体并入本文。腺病毒载体的其他实例可以发现于美国公开号20150093831、20140248305、20120283318、20100008889、20090175897和20090088398中，所述专利中的每一者通过引用整体并入本文。
[0067]
重组病毒载体也可以基于甲病毒。甲病毒包括辛德毕斯(sindbis)(和veev)病毒、奥拉病毒(aura virus)、巴班肯病毒(babanki virus)、巴马森林病毒(barmah forest virus)、比巴鲁病毒(bebaru virus)、卡巴斯欧病毒(cabassou virus)、基孔肯雅病毒
(chikungunya virus)、东方马脑炎病毒、沼泽地病毒(everglades virus)、摩根堡病毒(fort morgan virus)、盖塔病毒(getah virus)、高地j病毒(highlands j virus)、孜拉加奇病毒(kyzylagach virus)、马亚罗病毒(mayaro virus)、米池病毒(me tri virus)、米德尔堡病毒(middelburg virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(mosso das pedras virus)、穆坎布病毒(mucambo virus)、恩杜穆病毒(ndumu virus)、欧尼恩病毒(o'nyong-nyong virus)、那皮舒纳病毒(pixuna virus)、里奥内格罗病毒(rio negro virus)、罗斯河病毒(ross river virus)、鲑鱼胰腺病病毒、西门利启森林病毒(semliki forest virus)、南方象海豹病毒、图那特病毒(tonate virus)、特罗卡拉病毒(trocara virus)、乌纳病毒(una virus)、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和瓦塔罗阿病毒(whataroa virus)。通常，此类病毒的基因组编码可在宿主细胞质中翻译的非结构蛋白(例如复制子)和结构蛋白(例如衣壳和包膜)。罗斯河病毒、辛德比斯病毒、西门利启森林病毒(sfv)和委内瑞拉马脑炎病毒(veev)都已被用于开发用于转基因递送的病毒转移载体。假型病毒可以通过将甲病毒包膜糖蛋白和逆转录病毒衣壳组合而形成。甲病毒载体的实例可以发现于美国公开号20150050243、20090305344和20060177819中；载体及其制备方法以全文引用的方式并入本文
[0068]
在一些实施方案中，重组病毒载体是aav载体。aav系统在本领域中通常是众所周知的(参见，例如，kelleher和vos,biotechniques,17(6):1110-17(1994)；cotten等人,p.n.a.s.u.s.a.,89(13):6094-98(1992)；curiel,nat immun,13(2-3):141-64(1994)；muzyczka,curr top microbiol immunol,158:97-129(1992)；以及asokan a等人,mol.ther.,20(4):699-708(2012)，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文)。用于生成和使用aav载体的方法描述于例如美国专利号5,139,941和4,797,368中，所述专利中的每一者通过引用整体并入本文。
[0069]
通常，用于本文所述的方法和组合物中的aav载体可以属于任何aav血清型。已经对几种aav血清型进行表征，包括aav1、aav2、aav3(例如，aav3b)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11，以及其变体和/或杂交体。例如，在一些实施方案中，aav载体是aav2/5、aav2/6、aav2/8或aav2/9载体(例如，具有aav2 itr的aav6、aav8或aav9血清型)。在一些实施方案中，aav9变体包括在例如wo 2016/049230、美国专利号8,927,514、us 2015/0344911和美国专利号8,734,809中描述的那些aav9变体，所述专利中的每一者通过引用整体并入本文。
[0070]
在一些实施方案中，aav血清型可以具有或包含aav9序列中的突变，如n pulicherla等人(molecular therapy 19(6):1070-1078(2011)，其通过引用整体并入本文)所述，诸如但不限于aav9.68、aav9.9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.84。在某些实施方案中，aav9变体包括aavhu68或其变体，如例如wo 2018/160585中所描述，所述专利通过引用整体并入本文。其他aav载体描述于例如，sharma等人,brain res bull.2010年2月15日；81(2-3):273中，所述文献特此以全文引用的方式并入。
[0071]
在一些实施方案中，aav载体包括或者是天然存在的aav。在一些实施方案中，aav载体是修饰的aav(即天然存在的aav的变体)。在一些实施方案中，aav载体可以通过定向进化产生，例如，通过dna改组、肽插入或随机诱变，以便将修饰引入aav序列从而改善基因治
疗的一种或多种特性，例如通过中和抗体避免或减少免疫应答或识别，和/或用于更有效和/或靶向的转导(asuri等人,molecular therapy 20.2(2012):329-338)。使用定向进化来工程改造aav载体的方法可以发现于例如美国专利号8,632,764中。在一些实施方案中，修饰的aav被修饰以包括特定的向性。
[0072]
aav载体的aav序列通常包含顺式作用的5'和3'反向末端重复序列(参见，例如，b.j.carter,"handbook of parvoviruses",p.tijsser编,crc press,第155-168页(1990)，其通过引用整体并入本文)。itr序列的长度为约145bp。在一些实施方案中，编码itr的基本上完整的序列都用于aav载体中，尽管可以允许对这些序列进行某种程度的微小修饰。修饰这些itr序列的能力是本领域技术人员已知的。(参见，例如，sambrook等人,"molecular cloning.a laboratory manual",第2版,cold spring harbor laboratory,new york(1989)；以及k.fisher等人,j virol,70:520 532(1996)，其各自通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，本公开的aav载体是含有有效载荷的“顺式作用”质粒，其中选定的有效载荷序列和相关的调控元件侧接5'和3'aav itr序列。aav itr序列可以获自任何已知的aav，包括已知的哺乳动物aav类型和/或本文所述的那些aav。
[0073]
在一些实施方案中，aav载体可以是双重或三重aav载体，例如，用于递送大有效载荷(例如，大于约5kb的有效载荷)和/或解决与施用单一aav载体相关的安全性问题。在一些实施方案中，双重aav载体可以包括两个单独的aav载体，每个载体包括所关注的大有效载荷的完整序列的片段，并且当重组时，所述片段形成所关注的大有效载荷的完整序列或其功能部分。在一些实施方案中，三重aav载体可以包括三个单独的aav载体，每个载体包括所关注的大有效载荷序列的片段，并且当重组时，所述片段形成所关注的大有效载荷的完整序列或功能部分其中。
[0074]
可将多个aav(例如，双重或三重aav载体)递送至同一细胞并共转导至同一细胞中，其中两个或三个有效载荷的片段重组在一起并生成整个所关注的大有效载荷的单一mrna转录物。在一些实施方案中，分段的有效载荷包括非重叠序列。在一些实施方案中，分段的有效载荷包括指定的重叠序列。在一些实施方案中，双重或三重转染的多个aav载体可以是相同类型的aav载体(例如，相同血清型和/或相同构建体)。在一些实施方案中，双重或三重的多个aav载体可以是不同类型的aav载体(例如，不同血清型或构建体)。
[0075]
根据本公开有用的示例性aav载体包括单链(ss)或自身互补(sc)aav核酸载体。在一些实施方案中，aav载体包括单链(ss)或自身互补(sc)aav核酸载体。在一些实施方案中，aav载体包含本文所述的表达构建体和一个或多个包含位于表达构建体的侧翼的反向末端重复(itr)序列(例如，野生型itr序列或工程化的itr序列)的区域。在一些实施方案中，aav载体被病毒衣壳包裹。在一些实施方案中，病毒衣壳包含60个衣壳蛋白亚基。在一些实施方案中，病毒衣壳包含vpl、vp2和vp3。在一些实施方案中，vpl、vp2和vp3亚基分别以大约1:1:10的比例存在于衣壳中。
[0076]
在一些实施方案中，本公开的aav载体的itr序列可以来源于任何aav血清型(例如，aav1、aav2、aav3(例如，aav3b)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11，以及其变体和/或杂交体)，或者可以来源于一种以上的血清型。在一些实施方案中，itr序列来源于一种或多种其他血清型。itr序列和含有itr序列的质粒是本领域已知的并且是可商购的(参见，例如，可购自vector biolabs,philadelphia,pa；cellbiolabs,san diego,ca；
agilent technologies,santa clara,ca；以及addgene,cambridge,ma；并描述于kessler等人pnas.1996年11月26日；93(24):14082-7；machida.methods in molecular medicine
tm
.viral vectors for gene therapy methods and protocols.10.1385/1-59259-304-6:201humana press inc.2003.第10章.targeted integration by adeno-associated virus；以及美国专利号5,139,941和5,962,313中的产品和服务；所述文献中的每一者通过引用整体并入本文)。
[0077]
在一些实施方案中，aav载体可以包含或基于选自以下任何血清型及其变体的血清型，包括但不限于：aav9.68、aav1、aav10、aav106.1/hu.37、aav11、aav114.3/hu.40、aav 12、aav127.2/hu.41、aav127.5/hu.42、aav128.1/hu.43、aav128.3/hu.44、aav130.4/hu.48、aav145.1/hu.53、aav145.5/hu.54、aav145.6/hu.55、aav16.12/hu.11、aav16.3、aav16.8/hu.10、aav161.10/hu.60、aav161.6/hu.61、aavl-7/rh.48、aavl-8/rh.49、aav2、aav2.5t、aav2-15/rh.62、aav223.1、aav223.2、aav223.4、aav223.5、aav223.6、aav223.7、aav2-3/rh.61、aav24.1、aav2-4/rh.50、aav2-5/rh.51、aav27.3、aav29.3/bb.l、aav29.5/bb.2、aav2g9、aav-2-pre-mirna-101、aav3、aav3.1/hu.6、aav3.1/hu.9、aav3-1 l/rh.53、aav3-3、aav33.12/hu.l7、aav33.4/hu.l5、aav33.8/hu.l6、aav3-9/rh.52、aav3a、aav3b、aav4、aav4-19/rh.55、aav42.12、aav42-10、aav42-11、aav42-12、aav42-13、aav42-15、aav42-lb、aav42-2、aav42-3a、aav42-3b、aav42-4、aav42-5a、aav42-5b、aav42-6b、aav42-8、aav42-aa、aav43-1、aav43-12、aav43-20、aav43-21、aav43-23、aav43-25、aav43-5、aav4-4、aav44.1、aav44.2、aav44.5、aav46.2/hu.28、aav46.6/hu.29、aav4-8/r 11.64、aav4-8/rh.64、aav4-9/rh.54、aav5、aav52.1/hu.20、aav52/hu.l9、aav5-22/rh.58、aav5-3/rh.57、aav54.1/hu.21、aav54.2/hu.22、aav54.4r/hu.27、aav54.5/hu.23、aav54.7/hu.24、aav58.2/hu.25、aav6、aav6.1、aav6.1.2、aav6.2、aav7、aav7.2、aav7.3/hu.7、aav8、aav-8b、aav-8h、aav9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.84、aav9.9、aava3.3、aava3.4、aava3.5、aav a3.7、aav-b、aavcl、aavc2、aavc5、aavch.5、aavch.5rl、aavcy.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.5rl、aavcy.5r2、aavcy.5r3、aavcy.5r4、aavcy.6、aav-dj、aav-dj8、aavf3、aavf5、aav-h、aavh-l/hu.l、aavh2、aavh-5/hu.3、aavh6、aavhel.l、aavher1.14、aavherl.16、aavherl.18、aavher1.23、aavherl.35、aavherl.36、aavherl.5、aavherl.7、aavherl.8、aavher2.16、aavher2.29、aavher2.30、aavher2.31、aavher2.36、aavher2.4、aavher3.1、aavhu.l、aavhu.10、aavhu.11、aavhu.12、aavhu.13、aavhu.14/9、aavhu.15、aavhu.l6、aavhu.l7、aavhu.l8、aavhu.19、aavhu.2、aavhu.20、aavhu.21、aavhu.22、aavhu.23.2、aavhu.24、aavhu.25、aavhu.27、aavhu.28、aavhu.29、aavhu.29r、aavhu.3、aavhu.31、aavhu.32、aavhu.34、aavhu.35、aavhu.37、aavhu.39、aavhu.4、aavhu.40、aavhu.41、aavhu.42、aavhu.43、aavhu.44、aavhu.44rl、aavhu.44r2、aavhu.44r3、aavhu.45、aavhu.46、aavhu.47、aavhu.48、aavhu.48rl、aavhu.48r2、aavhu.48r3、aavhu.49、aavhu.5、aavhu.51、aavhu.52、aavhu.53、aavhu.54、aavhu.55、aavhu.56、aavhu.57、aavhu.58、aavhu.6、aavhu.60、aavhu.61、aavhu.63、aavhu.64、aavhu.66、aavhu.67、aavhu.7、aavhu.8、aavhu.9、aavhu.t 19、aavlg-10/rh.40、aavlg-4/rh.38、aavlg-9/hu.39、aavlg-9/hu.39、aav-lk01、aav-lk02、aavlk03、aav-lk03、aav-lk04、aav-lk05、aav-lk06、aav-lk07、aav-lk08、aav-lk09、
aav-lk10、aav-lk11、aav-lk12、aav-lk13、aav-lk14、aav-lk15、aav-lk17、aav-lk18、aav-lk19、aavn721-8/rh.43、aav-paec、aav-paecl l、aav-paec12、aav-paec2、aav-paec4、aav-paec6、aav-paec7、aav-paec 8、aavpi.l、aavpi.2、aavpi.3、aavrh.10、aavrh.12、aavrh.13、aavrh.13r、aavrh.14、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.2、aavrh.20、aavrh.21、aavrh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.2r、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37、aavrh.37r2、aavrh.38、aavrh.39、aavrh.40、aavrh.43、aavrh.44、aavrh.45、aavrh.46、aavrh.47、aavrh.48、aavrh.48、aavrh.48.1、aavrh.48.1.2、aavrh.48.2、aavrh.49、aavrh.50、aavrh.51、aavrh.52、aavrh.53、aavrh.54、aavrh.55、aavrh.56、aavrh.57、aavrh.58、aavrh.59、aavrh.60、aavrh.61、aavrh.62、aavrh.64、aavrh.64rl、aavrh.64r2、aavrh.65、aavrh.67、aavrh.68、aavrh.69、aavrh.70、aavrh.72、aavrh.73、aavrh.74、aavrh.8、aavrh.8r、aavrh8r、aavrh8r a586r突变体、aavrh8r r533a突变体、baav、b p61 aav、b p62 aav、b p63 aav、牛aav、山羊aav、日本aav10、真实型aav(ttaav)、upenn aav 10、aav-lk 16、aaav、aav shuffle 100-1、aav shuffle 100-2、aav shuffle 100-3、aav shuffle 100-7、aav shuffle 10-2、aav shuffle 10-6、aav shuffle 10-8、aav sm 100-10、aav sm 100-3、aav sm 10-1、aav sm 10-2和/或aav sm 10-8。
[0078]
在一些实施方案中，aav血清型可以是aavdj或其变体，诸如aavdj8(或aav-dj8)，如grimm等人(journal of virology 82(12):5887-5911(2008))或美国专利号7,588,772中所述，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，aav血清型可以包含或具有如例如美国专利号us 6,156,303中描述的序列或其衍生物，所述专利通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，aav血清型可以是或包含如国际申请公开号wo2015121501中描述的序列或其变体，所述专利通过引用整体并入本文，诸如但不限于真实型aav(ttaav)(wo2015121501的seq id no:2)、“upenn aav10”(wo2015121501的seq id no:8)、“japanese aav10”(wo2015121501的seq id no:9)。
[0079]
在一些实施方案中，aav血清型可以来自任何数量的物种。例如，在一些实施方案中，aav可以是禽类aav(aaav)。在一些实施方案中，aav血清型可以是或包含如美国专利号9,238,800中描述的序列，该专利通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，aav血清型可以是牛aav(baav)。baav血清型可以是或包含如美国专利号9,193,769中描述的序列，该专利通过引用整体并入本文。baav血清型可以是或具有如美国专利号7,427,396中所述的序列，该专利通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，aav可以是山羊aav。山羊aav血清型可以是或包含如美国专利号7427396中所述的序列，该专利通过引用整体并入本文。aav血清型也可以是上述任何一种的变体或杂交体。
[0080]
在一些实施方案中，aav可以是由在氨基酸390-627(vp1编号)中具有突变的aav9衣壳文库产生的血清型，如pulicherla等人(molecular therapy 19(6):1070-1078(2011)所述，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，血清型和对应的核苷酸以及氨基酸取代可以是但不限于aav9.1(g1594c；d532h)、aav6.2(t1418a和t1436x；v473d和i479k)、aav9.3(t1238a；f413y)、aav9.4(t1250c和a1617t；f417s)、aav9.5(a1235g、a1314t、a1642g、c1760t；q412r、t548a、a587v)、aav9.6(t1231a；f411i)、aav9.9(g1203a、g1785t；w595c)、aav9.10(a1500g、t1676c；m559t)、aav9.11(a1425t、a1702c、a1769t；t568p、
q590l)、aav9.13(a1369c、a1720t；n457h、t574s)、aav9.14(t1340a、t1362c、t1560c、g1713a；l447h)、aav9.16(a1775t；q592l)、aav9.24(t1507c、t1521g；w503r)、aav9.26(a1337g、a1769c；y446c、q590p)、aav9.33(a1667c；d556a)、aav9.34(a1534g、c1794t；n512d)、aav9.35(a1289t、t1450a、c1494t、a1515t、c1794a、g1816a；q430l、y484n、n98k、v606i)、aav9.40(a1694t、e565v)、aav9.41(a1348t、t1362c；t450s)、aav9.44(a1684c、a1701t、a1737g；n562h、k567n)、aav9.45(a1492t、c1804t；n498y、l602f)、aav9.46(g1441c、t1525c、t1549g；g481r、w509r、l517v)、9.47(g1241a、g1358a、a1669g、c1745t；s414n、g453d、k557e、t582i)、aav9.48(c1445t、a1736t；p482l、q579l)、aav9.50(a1638t、c1683t、t1805a；q546h、l602h)、aav9.53(g1301a、a1405c、c1664t、g1811t；r134q、s469r、a555v、g604v)、aav9.54(ci 531a、t1609a；l511i、l537m)、aav9.55(t1605a；f535l)、aav9.58(c1475t、c1579a；t492i、h527n)、aav.59(t1336c；y446h)、aav9.61(a1493t；n498i)、aav9.64(c1531a、a1617t；l511i)、aav9.65(c1335t、t1530c、c1568a；a523d)、aav9.68(c1510a；p504t)、aav9.80(g1441a,；g481r)、aav9.83(c1402a、a1500t；p468t、e500d)、aav9.87(t1464c、t1468c；s490p)、aav9.90(a1196t；y399f)、aav9.91(t1316g、a1583t、c1782g、t1806c；l439r、k528i)、aav9.93(a1273g、a1421g、a1638c、c1712t、g1732a、a1744t、a1832t；s425g、q474r、q546h、p571l、g578r、t582s、d611v)、aav9.94(a1675t；m559l)和aav9.95(t1605a；f535l)。
[0081]
在一些实施方案中，aav载体包含包括修饰的衣壳蛋白(例如，包含修饰的vp3区的衣壳蛋白)的衣壳。产生修饰的衣壳蛋白的方法是本领域已知的(参见，例如，us20130310443，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，aav载体包含修饰的衣壳蛋白，该衣壳蛋白在对应于野生型衣壳蛋白中表面暴露的氨基酸(例如，表面暴露的酪氨酸)的位置包含至少一个非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，aav载体包含修饰的衣壳蛋白，该衣壳蛋白在对应于野生型衣壳蛋白中表面暴露的酪氨酸氨基酸的位置包含非酪氨酸氨基酸(例如，苯丙氨酸)，在对应于野生型衣壳蛋白中表面暴露的苏氨酸氨基酸的位置包含非苏氨酸氨基酸(例如，缬氨酸)，在对应于野生型衣壳蛋白中表面暴露的赖氨酸氨基酸的位置包含非赖氨酸氨基酸(例如，谷氨酸)，在对应于野生型衣壳蛋白中表面暴露的丝氨酸氨基酸的位置包含非丝氨酸氨基酸(例如，缬氨酸)，或其组合。在一些实施方案中，aav载体包含衣壳，该衣壳包括具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代的修饰的衣壳蛋白。
[0082]
在一些实施方案中，aav载体包含一个或多个区域，该区域包含促进所关注基因的编码序列表达的序列，例如，可操作地连接到编码序列的表达控制序列。表达控制序列的非限制性实例包括启动子、绝缘子、沉默子、响应元件、内含子、增强子、起始位点、终止信号和poly(a)尾。本文考虑了此类控制序列的任何组合(例如，启动子和/或增强子)。在一些实施方案中，表达构建体包括其他调节元件，诸如wpre。
[0083]
aav载体可以包括常规控制元件，其以允许在用本文所述的载体转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接到编码本文所述的任何多肽或有效载荷的核酸。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的rna加工信号，例如剪接和多腺苷酸化(polya)信号(例如，兔β-球蛋白polya信号)；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(例如，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编
码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以包含在本文所述的载体中。组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地具有rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地具有cmv增强子)、sv40启动子和二氢叶酸还原酶启动子。
[0084]
诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素(诸如温度)或特定生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中)的存在来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于invitrogen、clontech和ariad。已经描述了许多其他系统并且可以由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(mt)启动子、地塞米松(dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统、蜕皮激素昆虫启动子、四环素抑制系统、四环素诱导型系统、ru486诱导型系统和雷帕霉素型诱导系统。其他可能有用的诱导型启动子类型受特定生理状态调节，诸如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。
[0085]
在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在某些情况下，组织特异性调节序列结合组织特异性转录因子，这些转录因子以组织特异性方式诱导转录。此类组织特异性调节序列(例如，启动子、增强子等)在本领域中是众所周知的。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白启动子(cb7)、cbh启动子、pol ii启动子或pol iii启动子。
[0086]
在一些实施方案中，启动子是组织或细胞特异性启动子。例如，神经元特异性启动子可以包括但不限于人突触蛋白i(syn)启动子(例如，如li等人,proc natl acad sci usa 1993；90:1460-1464中所述，其通过引用整体并入本文)、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子(例如，如mayford等人,proc natl acad sci usa 1996；93:13250-13255中所述，其通过引用整体并入本文)、大鼠微管蛋白αi(tal)启动子(例如，如gloster等人,j neurosci 1994；14:7319-7330中所述，其通过引用整体并入本文)、大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子(例如，如forss-petter等人,neuron 1990；5:187-197中所述，其通过引用整体并入本文)以及人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子(例如，如sasahara等人,cell 1991；64:217-227中所述，其通过引用整体并入本文)。
[0087]
在另一个实施方案中，可以使用编码本文所述的任何有效载荷的核酸的天然启动子或其片段。在一些实施方案中，其他天然表达控制元件，诸如增强子元件、多腺苷酸化位点或kozak共有序列，也可用于模拟天然表达。
[0088]
在一些实施方案中，本文所述的aav载体中的有效载荷可以具有任何长度，例如，长度在2和10,000个核苷酸之间或它们之间的任何整数值。在一些实施方案中，编码有效载荷的核酸序列包含至少20个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸、至少500个核苷酸、至少550个核苷酸、至少600个核苷酸、至少650个核苷酸、至少700个核苷酸、至少750个核苷酸、至少800个核苷酸、至少850个核苷酸、至少880个核苷酸、至少900个核苷酸、至少950个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少1100个核苷酸、至少1200个核苷酸、至少1300个核苷酸、至少1400个核苷酸、至少1500个核苷酸、至少1600个核苷酸、至少1700个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2500个核苷酸、至少3000个核苷酸、至少4000个核苷酸、至少5000个核苷酸、至少6000
个核苷酸、至少7000个核苷酸、至少8000个核苷酸、至少9000个核苷酸。在一些实施方案中，编码有效载荷的核酸序列包含50至25,000个核苷酸长度、100至20,000个核苷酸长度、500至10,000个核苷酸长度、1,000至8,000个核苷酸长度和/或长2,000至5,000个核苷酸长度。
[0089]
在一些实施方案中，所述方法包括优化本文所述的重组病毒载体的感染复数(moi)以用于转导。在一些实施方案中，选择产生线性范围的测定结果的moi。在一些实施方案中，测定多个moi是通过连续稀释实现的。在一些实施方案中，在通过连续稀释获得的不同moi(例如，约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10moi)下用重组病毒载体转导宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)。在一些实施方案中，使用约1.2倍、约1.4倍、约1.6倍、约1.8倍、约2倍、约2.2倍、约2.4倍、约2.2倍、约2.4倍或约3倍连续稀释或其组合。在一些实施方案中，通过连续稀释测试约5种不同的moi。
[0090]
在一些实施方案中，将病毒载体以约6.1
×
105vg/细胞至约4.0
×
106vg/细胞，例如约6.1
×
105vg/细胞、约6.2
×
105vg/细胞、约6.3
×
105vg/细胞、约6.4
×
105vg/细胞、约6.5
×
105vg/细胞、约7.0
×
105vg/细胞、约7.5
×
105vg/细胞、约8.0
×
105vg/细胞、约8.5
×
105vg/细胞、约9.0
×
105vg/细胞、约9.5
×
105vg/细胞、约9.8
×
105vg/细胞、约1.0
×
106vg/细胞、约1.5
×
106vg/细胞、约1.6
×
106vg/细胞、约2.0
×
106vg/细胞、约2.5
×
106vg/细胞、约3.0
×
106vg/细胞、约3.5
×
106vg/细胞或约4.0
×
106vg/细胞的moi添加到细胞培养物中。
[0091]
在一些实施方案中，将病毒载体以约6.1
×
105vg/细胞 /-50％、6.1
×
105vg/细胞 /-40％、6.1
×
105vg/细胞 /-30％、6.1
×
105vg/细胞 /-20％、6.1
×
105vg/细胞 /-10％、6.1
×
105vg/细胞 /-5％或6.1
×
105vg/细胞 /-1％的moi添加到细胞培养物中。
[0092]
在一些实施方案中，将病毒载体以约9.8
×
105vg/细胞 /-50％、9.8
×
105vg/细胞 /-40％、9.8
×
105vg/细胞 /-30％、9.8
×
105vg/细胞 /-20％、9.8
×
105vg/细胞 /-10％、9.8
×
105vg/细胞 /-5％或9.8
×
105vg/细胞 /-1％的moi添加到细胞培养物中。
[0093]
在一些实施方案中，将病毒载体以约1.6
×
106vg/细胞 /-50％、1.6
×
106vg/细胞 /-40％、1.6
×
106vg/细胞 /-30％、1.6
×
106vg/细胞 /-20％、1.6
×
106vg/细胞 /-10％、1.6
×
106vg/细胞 /-5％或1.6
×
106vg/细胞 /-1％的moi添加到细胞培养物中。
[0094]
在一些实施方案中，将病毒载体以约2.5
×
106vg/细胞 /-50％、2.5
×
106vg/细胞 /-40％、2.5
×
106vg/细胞 /-30％、2.5
×
106vg/细胞 /-20％、2.5
×
106vg/细胞 /-10％、2.5
×
106vg/细胞 /-5％或2.5
×
106vg/细胞 /-1％的moi添加到细胞培养物中。
[0095]
在一些实施方案中，将病毒载体以约4
×
106vg/细胞 /-50％、4
×
106vg/细胞 /-40％、4
×
106vg/细胞 /-30％、4
×
106vg/细胞 /-20％、4
×
106vg/细胞 /-10％、4
×
106vg/细胞 /-5％或4
×
106vg/细胞 /-1％的moi添加到细胞培养物中。
[0096]
在一些实施方案中，选择产生线性范围的效价测定结果的moi。在其他实施方案中，选择产生非线性范围的效价测定结果的moi。在一些实施方案中，效价测定的信噪比为约2.5或大于2.5，例如约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10或更大的信噪比。在一些实施方案中，约2.5或更大的信噪比允许使用非线性范围的效价测定结果。
[0097]
aav载体的生产
[0098]
获得aav载体的方法是本领域已知的。通常，方法包括培养含有编码aav衣壳蛋白
york；davis等人(1986)basic methods in molecular biology,elsevier；以及chu等人(1981)gene 13:197)。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，诸如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞。
[0104]
在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作aav辅助构建体、aav小基因质粒、辅助功能载体和/或与重组aav生产相关的其他转移dna的受体。该术语包括已转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源dna序列转染的细胞。应该理解由于天然、偶然或有意突变，单个亲本细胞的子代可不必在形态或在基因组或总dna互补序列上与原始亲本完全相同。
[0105]
用于产生和分离适用于递送给受试者的aav病毒载体的额外方法描述于例如美国专利号7,790,449；美国专利号7,282,199；wo 2003/042397；wo 2005/033321、wo 2006/110689；以及美国专利号7,588,772中，所述专利中的每一者都通过引用整体并入本文。
[0106]
在一些实施方案中，将生产细胞系用编码侧接itr的有效载荷的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染。在另一个系统中，将稳定提供rep和cap的包装细胞系用编码侧接itr的有效载荷的构建体瞬时转染。在这些系统中的每一者中，响应于辅助腺病毒或疱疹病毒的感染产生aav病毒体，并将raav与污染病毒分离。其他系统不需要感染辅助病毒来回收aav。在一些实施方案中，辅助功能(例如，腺病毒e1、e2a、va和e4或疱疹病毒ul5、ul8、ul52和ul29，以及疱疹病毒聚合酶)也由系统以反式形式提供。在此类系统中，可以通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可以对细胞进行工程改造以稳定地包含编码辅助功能的基因，其表达可以是控制在转录或转录后水平。
[0107]
在一些实施方案中，通过用基于杆状病毒的载体感染将侧接itr和rep/cap基因的有效载荷引入昆虫宿主细胞。此类生产系统在本领域中是已知的(参见例如zhang等人,2009,human gene therapy 20:922-929，其通过引用整体并入本文)。制造和使用这些和其他aav生产系统的方法也描述在美国专利号5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；以及7,439,065中，所述专利中的每一者都通过引用整体并入本文。
[0108]
用于产生重组载体的上述方法并不意味着限制，并且其他合适的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。
[0109]
有效载荷
[0110]
所关注的示例性有效载荷是smn(例如，人smn)。人smn是在细胞质和细胞核中普遍表达和发现的38kda多功能蛋白，其在细胞核中集中在反映smn作用机制的称为螺旋体双子(gem)的不同结构中。在中枢神经系统(cns)的神经元细胞中发现了特别高水平的smn表达。在细胞质中，smn通过与称为gemins(gemins 2-8)的蛋白质相互作用形成smn复合物而在剪接体组装中发挥关键作用。一旦形成，smn复合物通过将sm蛋白和小核rna(snrna)结合在一起来形成小核核糖核蛋白(snrnp)是至关重要的，这对于前mrna加工成细胞核中的mrna是必不可少的。
[0111]
在一些实施方案中，用于产生重组病毒载体的有效载荷包含一种或多种编码至少一种smn多肽的核酸。在一些实施方案中，至少一种smn多肽包括或者是人smn多肽。
[0112]
在一些实施方案中，有效载荷包含smn基因(例如，smn1或smn2基因)或其片段。在一些实施方案中，smn基因(例如，smn1或smn2基因)包含人smn1或smn2基因。在一些实施方
案中，smn基因(例如，smn1或smn2基因)是密码子优化的。在一些实施方案中，smn1基因(例如，密码子优化的smn1基因)包含如在wo 2018/160585中公开的核酸序列(例如，wo 2018/160585的seq id no:1)。smnl的示例性人核酸(genbank登录号nm_000344.4)、人氨基酸序列和人密码子优化的核酸序列示于表1中。
[0113]
表1.人smn-1核酸和氨基酸序列。
[0114]
[0115][0116]
宿主细胞
[0117]
本公开内容尤其提供了用于用本文所述的至少一种病毒载体转导的宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)。宿主细胞包括用至少一种本文所述的载体转染的原始细胞的子代细胞。由于天然、偶然或故意突变，亲代细胞的子代细胞可能在形态学或基因组内容上与亲代细胞基本上不同。
[0118]
本公开认识到细胞对病毒载体的许可性不同。此外，本公开认识到，细胞转录和翻译由病毒载体编码的蛋白质的能力不同。因此，不希望受任何特定理论的束缚，本公开认识到用于本文所述的效价测定的宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)必须高度允许病毒载体。因此，根据各种实施方案，如本文所述的测定利用对编码所关注有效载荷的病毒载体许可的细胞。
[0119]
在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞不是非人哺乳动物细胞(例如，小鼠细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是永生化细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是肿瘤或骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞不是原代细胞。在一些实施方案中，宿主细胞来源于神经元组织。在一些实施方案中，宿主细胞来源于肾组织。在一些实施方案中，宿主细胞来源于肝组织。在一些实施方案中，宿主细胞来源于眼组织。
[0120]
在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是神经母细胞瘤细胞(例如，sh-sy5y、b35、imr-32或sk-n-as细胞)、hela细胞(例如，hela-rc32细胞)、肾细胞(例如，huh7、hek293、293ebna、msr 293、mdck、hak、vero细胞、cv1或bhk细胞)、cho细胞(例如，cho kl、dxb-11cho或veggie-cho细胞)、cos细胞(例如，cos-7细胞)、肝细胞(例如，hepg2细胞)、视网膜细胞(例如，rpe1、r28或mu-ph1细胞)、成纤维细胞(例如，nih/3t3细胞)，或来源于前述细胞的细胞系或变体。在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是神经母细胞瘤细胞(例如，sh-sy5y细胞)。
[0121]
在一些实施方案中，宿主细胞包括或者是修饰的宿主细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞缺乏或减少了所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的表达。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括本文所述的宿主细胞(例如，哺乳动物，例如，本文所述的人宿主细胞；或例如，神经元(例如，神经母细胞瘤)，例如哺乳动物神经元(例如，神经母细胞瘤)，例如本文描述的人神经元(例如，神经母细胞瘤)宿主细胞)，其还包含smn基因(例如，smn1或smn2基因)中的敲低(例如，组成型或条件型)。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包含针对smn基因(例如，smn1或smn2基因)的抑制性核酸(例如，shrna)。在某些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是sh-sy5y细胞(例如，sh-sy5y kd细胞)。在一些实施方案中，sh-sy5y kd细胞包含smn基因(例如，smn1或smn2基因)中的敲低(例如，组成型或条件型)，例如，包含或表达针对smn基因(例如，smn1或smn2基因)的抑制性核酸，例如针对smn1的shrna(例如，针对smn1的强力霉素诱导型shrna，例如shrna120或shrna 128)，例如jangi等人的proc natl acad sci.114(12):e2347-e2356,2017中描述的shrna，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，将sh-sy5y细胞用表达针对smn1基因的shrna(例如，针对smn1基因的强力霉素诱导型shrna，例如shrna120或shrna 128)的至少一种慢病毒载体转
导，例如，如jangi等人proc natl acad sci.114(12):e2347-e2356,2017中所述。在一些实施方案中，针对smn1的抑制性核酸(例如，shrna)不靶向或影响本文所述的重组病毒载体(例如，抑制性核酸，例如，shrna，不靶向本文所述的重组病毒载体的有效载荷(例如，密码子优化的smn1基因))。在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞或修饰的宿主细胞不包括(例如，不是)原代细胞。在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞或修饰的宿主细胞包括(例如，是)细胞系，例如永生化/连续细胞系。
[0122]
缺乏所关注有效载荷或具有降低的所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的表达的修饰的宿主细胞可以通过任何合适的方式获得，包括所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的敲除或敲低(例如，条件敲除或敲低)。例如，修饰的宿主细胞可以包括使用shrna、sirna、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)转录激活因子样效应物核酸酶(talen)和/或锌指核酸内切酶(zfn)敲低所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包含针对所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的抑制性核酸。在一些实施方案中，抑制性核酸包括shrna、sirna或mirna。在一些实施方案中，宿主细胞包含用于敲低所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的至少一种shrna。在一些实施方案中，shrna包括shrna120或shrna 128。在一些实施方案中，抑制性核酸(例如，shrna)不靶向本文所述的重组病毒载体。在一些实施方案中，抑制性核酸(例如，shrna)不靶向本文所述的重组病毒载体的有效载荷(例如，密码子优化的smn1基因)。
[0123]
在一些实施方案中，在相对短的时间段内，例如在约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11,小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23或约24小时的时间段内接种并转导宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)。
[0124]
在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括降低的所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的表达水平，例如相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞表达水平降低约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约65倍、约70倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍、约96倍、约97倍、约98倍、约99倍或更多。
[0125]
在一些实施方案中，在转染之前，将宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)传代多次，例如在约10次和约30次之间。在一些实施方案中，将宿主细胞传代至少10次，例如至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次、至少21次、至少22次、至少23次、至少24次、至少25次、至少26次、至少27次、至少28次、至少29次、至少30次或更多次。在一些实施方案中，在转染之前，宿主细胞经受至少一个冻融循环，例如至少两个、三个、四个或更多个冻融循环。
[0126]
在一些实施方案中，在用本文所述的重组病毒载体转导之前，将宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)接种到基质(例如，细胞培养容器)上。宿主细胞可以在细胞培养容器中培养。细胞培养容器可以包括细胞培养皿、板或烧瓶。示例性细胞培养容器包括35mm、60mm、100mm或150mm培养皿、多孔板(例如，6孔、12孔、24孔、48孔或96孔板)或烧瓶(例如t型烧瓶，例如t-25、t-75或t-160烧瓶)或振荡烧瓶。在一些实施方案中，细胞培养容器包括或者是玻璃底测
定板。
[0127]
在一些实施方案中，以一定密度接种宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)。在一些实施方案中，以约5.0
×
103至约5.0
×
104个细胞/孔的密度接种宿主细胞。在一些实施方案中，以约5.0
×
103、约5.5
×
103、约6.0
×
103、约6.5
×
103、约7.0
×
103、约7.5
×
103、约8.0
×
103、约8.5
×
103、约9.0
×
103、约9.5
×
103、约1.0
×
104、约1.5
×
104、约2.0
×
104、约2.5
×
104、约3.0
×
104、约3.5
×
104、约4.0
×
104、约4.5
×
104或约5.0
×
104个细胞/孔的密度接种宿主细胞。在某些实施方案中，以约5.0
×
103的密度接种宿主细胞。
[0128]
确定重组病毒载体的效价
[0129]
在一些实施方案中，本文所述的重组病毒载体的效价(例如，生物活性)由所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的表达水平确定。在一些实施方案中，效价测定包括：(i)用本文所述的编码所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的重组病毒载体转导宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)；(ii)使宿主细胞与第一剂(例如，任选地包含检测部分)接触以检测所关注有效载荷；(iii)使宿主细胞与第二剂(例如，任选地包含检测部分)接触以检测第一剂；以及(iv)检测螺旋体双子(gem)的存在。在一些实施方案中，宿主细胞(例如，人宿主细胞，例如，神经母细胞瘤细胞系，例如，sh-sy5y细胞(例如，sh-sy5y kd细胞)被修饰以相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞降低所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的表达。
[0130]
在一些实施方案中，测定用于确定由重组病毒载体编码的多肽(例如，至少一种smn多肽)的效价。在一些实施方案中，重组病毒载体的效价通过荧光测定来确定。在一些实施方案中，重组病毒载体的效价通过比色测定法来确定。在一些实施方案中，重组病毒载体的效价通过酶测定法来确定。在一些实施方案中，效价测定包括用于检测gem的成像(例如荧光成像，例如高内涵成像(hci))。在一些实施方案中，如本文所指的效价是指相对效价，例如，相对于参考标准。
[0131]
smn多肽的检测
[0132]
在一些实施方案中，用第一剂以及第二剂检测所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)。在一些实施方案中，第一剂被标记。在一些实施方案中，第二剂被标记。
[0133]
在一些实施方案中，第一剂包含结合至所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)的抗体或其抗原结合片段。示例性抗smn抗体或其片段是本领域已知的并且是可商购的(参见，例如，可购自novus biologicals,littletown,co；thermo fisher scientific；waltham,ma；以及gentex,irvine,ca的产品)。在一些实施方案中，第一剂包含适体。在一些实施方案中，适体包括rna、dna或其组合。在一些实施方案中，适体紧密结合至所关注有效载荷(例如，至少一种smn多肽)。
[0134]
在一些实施方案中，第一剂包含检测部分。在一些实施方案中，第一剂与检测部分共价或非共价结合。在一些实施方案中，第二剂包含检测部分。在一些实施方案中，第二剂与检测部分共价或非共价结合。在一些实施方案中，第一剂和第二剂包含检测部分。在一些实施方案中，第一剂和第二剂与检测部分共价或非共价结合。
[0135]
检测部分可以包括可检测的任何元素、分子、官能团、化合物、片段或部分。在一些
实施方案中，检测部分包括或者是荧光染料(例如，荧光素染料、吖啶染料、sybr染料、罗丹明染料或噁嗪染料)、放射性核素(例如，3h、
14
c、
18
f、
19
f、
32
p、
35
s、
135
i、
125
i、
123
i、
64
cu、
187
re、
111
in、
90
y、
99m
tc、
177
lu或
89
zr)、化学发光剂(例如，吖啶酯或稳定的二氧杂环丁烷)、电致化学发光剂(例如，磺基标签)、生物发光剂(例如，萤光素)、无机荧光半导体纳米晶体(例如，量子点)、金属纳米粒子(例如，金、银、铜或铂)、纳米团簇、顺磁性金属离子、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、比色标记(例如染料或胶体金)或任何上述物质的衍生物。在一些实施方案中，检测部分包括或者是荧光染料或其衍生物。在一些实施方案中，检测部分包括或是荧光团(例如，alexa-fluor 488、fluoprobes 488或dylight 488)。
[0136]
螺旋体双子(gem)的检测
[0137]
人smn多肽在细胞质和细胞核中普遍表达和发现。在细胞核中，smn集中在称为螺旋体双子(gem)的不同结构中。在一些实施方案中，gem的存在通过目视检查来检测，例如，作为核内明亮、致密的gem结构的结果。
[0138]
在一些实施方案中，通过成像检测gem的存在。在一些实施方案中，成像包括荧光成像(例如，高内涵成像(hci))。例如，hci描述了使用自动显微镜、多参数图像处理和可视化工具从细胞群中提取定量数据的一组分析方法。hci可用于定量报告参数，例如但不限于单个细胞或细胞结构中靶标的空间分布。在一些实施方案中，hci包括以高通量形式对样品进行荧光成像。在一些实施方案中，使用hci检测gem的存在。在一些实施方案中，hci在亚细胞水平(例如，细胞核中gem的存在)下检测宿主细胞(例如，包含或具有降低的至少一种smn多肽的表达的修饰的宿主细胞，例如本文所述的sh-sy5y kd细胞)中的变化。
[0139]
在一些实施方案中，通过测定gem的标记物(例如，gemins 2-8多肽中的一种或多种)来检测gem的存在。在一些实施方案中，gem的标记物指示与gem的共定位。在一些实施方案中，gem的标记物包括gemin 1多肽、gemin 2多肽、gemin 3多肽、gemin 4多肽、gemin 5多肽、gemin 6多肽、gemin 7多肽和/或gemin 8多肽。在一些实施方案中，通过成像分析gem的标记物。在一些实施方案中，通过荧光成像(例如，高内涵成像(hci))测定gem的标记物。
[0140]
在一些实施方案中，本文所述的效价测定表明重组病毒载体(例如，包含编码smn多肽的有效载荷)的稳定性。在一些实施方案中，在重组病毒载体的热应激后确定效价。在一些实施方案中，重组病毒载体在特定温度(例如，引起热应激)下经受特定时间长度。在一些实施方案中，重组病毒载体经受约40℃至约80℃的温度，例如约40℃、约45℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃或约80℃)。在一些实施方案中，将重组病毒载体在特定温度(例如，引起热应激)下保持1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟或更长时间。
[0141]
在一些实施方案中，重组病毒载体(例如，包含编码smn多肽的有效载荷)的效价在空衣壳的存在下不会降低。在一些实施方案中，重组病毒载体包含多个空病毒衣壳。在一些实施方案中，重组病毒载体包含多个空病毒衣壳(例如，空aav衣壳)，例如，空衣壳与包含重组病毒载体的衣壳的比率为约2:1至约1:10，例如约1:1至约1:3。在一些实施方案中，重组病毒载体制剂(例如，aav制剂)包含30％或更少的空衣壳，例如，40％、25％、20％、15％、10％、7.5％、5％、2.5％、1％或更少的空衣壳。
[0142]
在一些实施方案中，重组病毒载体的相对效价例如通过在线性回归数据拟合后针对例如参考标准的标准曲线的平行线分析(pla)来确定。在一些实施方案中，相对于参考标
准，重组病毒载体的相对效价为至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更高。可以使用任何合适的参考标准。如本文所用，“参考标准”是指包含重组病毒载体(例如，编码smn多肽)的组合物，所述重组病毒载体的浓度和/或效价是已知的。
[0143]
在一些实施方案中，本文所述的测定以高精确度确定效价。在一些实施方案中，以约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的准确度确定效价。在一些实施方案中，以约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的精确度确定效价。
[0144]
用途
[0145]
本公开尤其提供了将基因治疗递送至细胞或组织的方法。特别地，本公开提供了用组合物(例如，药物组合物)治疗受试者的方法，所述组合物包含用本文描述的方法测定效价的多种重组病毒载体(例如，aav载体)。
[0146]
在一些实施方案中，本发明的方法和试剂盒可用于评估和/或监测基因治疗。在一些实施方案中，基因治疗包括施用组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包含已经用本文描述的方法测定的多种重组病毒载体(例如，aav载体)。在一些实施方案中，用于评估和/或监测基因治疗的样品可以在基因治疗开始之前获得。在一些实施方案中，在第一次基因治疗处理或剂量后获得样品。在一些实施方案中，在基因治疗结束后获得样品。在一些实施方案中，在进行基因治疗之前、期间或之后的特定时间点、间隔或任何其他时间度量获得样品。
[0147]
在一些实施方案中，将包含用本文所述的方法测定效价的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，药物组合物)施用给于患有疾病、病症或疾患或处于疾病、病症或疾患的风险的受试者。在一些实施方案中，将包含本文所述的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，药物组合物)与一种或多种额外的治疗剂组合施用于受试者。在一些实施方案中，使包含本文所述的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，药物组合物)与器官、组织或细胞体外接触。可以将器官、组织或细胞引入受试者体内，并且可保护其免受原本会由接受者的免疫系统引起的损伤。
[0148]
在一些实施方案中，疾病或病症包括或者是运动神经元疾病或病症，例如影响运动神经元的一种或多种功能的疾病或病症。在一些实施方案中，中枢神经系统(cns)运动神经元中的蛋白质缺乏或功能障碍引起运动神经元疾病或病症。在一些实施方案中，运动神经元位于脑组织中。在一些实施方案中，运动神经元位于脊髓组织中。示例性运动神经元疾病和病症包括但不限于脊髓性肌萎缩(sma)、肌萎缩侧索硬化(als)、原发性侧索硬化(pls)、假性延髓麻痹、遗传性痉挛性截瘫、进行性肌萎缩(pma)、进行性延髓麻痹(pbp)和远端型遗传性运动神经病。
[0149]
考虑用于递送包含本文所述的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，药物组合物)的脑区包括但不限于运动皮质和/或脑干。在一些实施方案中，将包含如本文所述的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，药物组合物)递送至脊髓。在一些实施方案中，将包含如本文所述的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，
药物组合物)递送至下运动神经元。在一些实施方案中，将包含如本文所述的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，药物组合物)递送至神经细胞、神经胶质细胞和/或施万细胞。在一些实施方案中，神经胶质细胞包括或者是小神经胶质细胞、少突神经胶质细胞或星形胶质细胞。
[0150]
在一些实施方案中，将包含如本文所述的多种重组病毒载体(例如，aav载体)的组合物(例如，药物组合物)施用于患有sma或处于sma的风险的受试者。在一些实施方案中，受试者表现出脊髓运动神经元变性和/或骨骼肌萎缩。在一些实施方案中，受试者表现出包括肌肉无力、身体残疾和/或死亡风险增加的一种或多种症状。
[0151]
sma是在儿童期导致死亡的最常见的遗传性进行性遗传性神经肌肉疾病之一，在美国的发病率为1/10,000。在一些实施方案中，受试者是儿童。在一些实施方案中，受试者是青少年。sma具有广泛的发病年龄、严重程度、进展速率以及亚型之间和亚型内的变异性。分类为四种亚型，1至4型sma，其中1型是与最严重的预后和两岁内死亡相关的最严重的类型。在一些实施方案中，sma包括或为1型sma、2型sma、3型sma、4型sma或其组合。在一些实施方案中，受试者包含smn1基因的纯合突变。在一些实施方案中，例如相对于具有野生型smn1基因的受试者，受试者具有降低的smn多肽表达。
[0152]
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，包括genbank登录号，均通过引用整体并入。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的而不是旨在限制。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但本文描述适合的方法和材料。
[0153]
以下实施例进一步说明本公开。提供实施例仅用于说明目的。不应以任何方式解释为限制本发明的范围或内容。
[0154]
实施例
[0155]
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行和使用本发明的完整公开和描述，并且它们不意图限制发明人所认为的本发明范围，也不意图代表以下实验为所进行的所有或仅有的实验。
[0156]
实施例1：效价测定开发
[0157]
本实施例证实了稳健的效价测定的开发。该实施例描述了确定由aavhu68病毒载体编码的smn蛋白效价的关键试剂和过程。
[0158]
1.1用抗smn抗体检测smn蛋白
[0159]
抗体特异性对于高内涵成像(hci)测定的性能至关重要。通过蛋白质印迹测试了五种不同的市售抗体(表2)对大肠杆菌(e.coli)(origene)中生产的市售纯化的smn蛋白的特异性。如图14中的蛋白质印迹所示，这五种抗体(基于制造商的建议在不同稀释度下测试)识别纯化的smn蛋白(100和200ng)，但不识别用作阴性对照的rs1蛋白。
[0160]
表2.选择用于smn1效价测定开发的smn1抗体。
[0161][0162]
针对表达高水平内源smn蛋白的hek293全细胞裂解物(50ng)进一步评估抗体的特异性。如图15所示，购自genetex和thermo-fisher的抗体似乎可以检测细菌纯化的和内源的smn蛋白。此外，三种genetex抗体的灵敏度相比于单克隆novus biological smn1抗体更高，后者在hek293细胞裂解物中无法检测到低至50ng的纯化的smn1蛋白或内源smn蛋白(图2)。
[0163]
1.2细胞系选择
[0164]
下一步是确定使用哪种类型的细胞。细胞系需要易于培养、易于感染并尽可能与目标疾病的作用机制相关。测试的细胞系包括hela-rc32和sh-sy5y。由于smn的高内源性表达，使用hela-rc32细胞系具有挑战性，hci检测到的背景信号高，从而增加结果的可变性，如图1所示。
[0165]
人类神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y以前被用作代表sma的细胞培养模型，以评估体外急性smn损失的影响。神经元sh-sy5y细胞系与smn的作用机制相关，并对aav9载体是允许的。针对smn条件性地敲低sh-sy5y细胞(sh-sy5y kd细胞，例如，如jangi等人proc natl acad sci.114(12):e2347-e2356,2017中所述)显示，通过hci检测到的smn背景显著降低，从而导致测定可变性。
[0166]
为了确认条件性smn敲低的效率，将工程化的sh-sy5y细胞系、sh-sy5y shrna120和sh-sy5y shrna 128细胞(表达两种不同shrna序列的两种smn kd细胞系)接种并用dox处理3天和7天。然而，7天的dox处理不会用于进一步发育，因为细胞看起来不健康。通过蛋白质印迹评估的smn表达(图2)显示与第0天(未处理的细胞)相比，在dox处理3天后sh-sy5y shrna120和sh-sy5y shrna 128细胞中的smn内源蛋白显著降低。总之，smn表达被两种shrna有效地敲低。
[0167]
1.3感染参数的优化
[0168]
确定sh-sy5y sh120细胞的最佳传代
[0169]
为了研究细胞传代对gem形成的影响，将不同传代的工程化的sh-sy5y sh120细胞用强力霉素处理3天并冷冻。如图3的详细描述中所述进行测定。使用来自较早传代的细胞获得的数据与第11、15和25代细胞相比具有较低的信号和斜率(未测试更高的传代)。因此，该测定中仅使用第11至25代之间的细胞。
[0170]
平铺培养中的sh-sy5y sh120细胞对冷冻状态的细胞
[0171]
细胞通常是基于细胞的生物测定中最易变且不可预测的组分，并且培养中的细胞倾向于具有更高的可变性。比较培养中保持的细胞和从冷冻状态解冻和平铺的细胞(“解冻后的”细胞)的性能。在sh-sy5y sh120细胞中未观察到显著差异(图4)。虽然“解冻后的”细胞需要维持充足的细胞库，并评估在raavhu68-smn1感染后形成gem的每个细胞库，但该方
法对分析人员更方便，减少了测定时间，使细胞同步，并消除由于传代引起的变异性。因此，在测定中使用“解冻后的”细胞。
[0172]
96孔板中接种密度的优化
[0173]
为了确定用于效价测定的最佳细胞密度，将sh-sy5y sh120细胞以每孔6种不同的细胞密度平铺在96孔板中。研究了在不同raavhu68-smn1 moi下每个细胞形成的gem数量。以2
×
104个细胞/孔进行的方法开发过程中的初步实验用作这些实验中的参考。如图5所示，对于给定的moi，所有测试的细胞密度都获得了良好的信号。基于这些结果，1
×
104个细胞/孔的较低细胞密度用于测定开发以节省载体材料。
[0174]
感染时间的优化
[0175]
优化用raavhu68-smn1感染sh-sy5y sh120细胞以确定感染细胞3天是否会产生更好的曲线或信背比。如下图6所示，感染后温育细胞3天不会增加每个细胞形成的gem数量，但会延长测定的长度。感染细胞2天用于进一步发育。
[0176]
为了进一步简化测定，比较了当天和次日的感染方案。与第二天感染的细胞相比，由当天平铺和感染的细胞形成的gem数量更高，而测定的动态范围保持相似(图7)。此外，在当天接种和感染细胞也缩短了实验时间，并允许每周进行三次测定而不是两次。因此，当天感染用于进一步的开发工作。
[0177]
不需要raavhu68-smn1与腺病毒5的共感染
[0178]
人腺病毒5(ad5)用作由生产细胞系生产raavhu68-smn1的辅助病毒。这种方法不仅产生raavhu68-smn1，还会产生腺病毒颗粒，需要额外的纯化步骤来消除不需要的辅助病毒。然而，一些样品在纯化后可能含有残留的ad5。为了确定ad5是否可能影响效价测定的结果，在存在或不存在人腺病毒5的情况下共感染sh-sy5y sh120细胞(图8)。在50moi下存在ad5时未观察到显著差异。
[0179]
1.4免疫染色优化
[0180]
一级抗体和二级抗体的优化
[0181]
为了改善sh-sy5y kd细胞中的gem染色和检测，使用两种浓度的三种不同二级抗体(alexa-fluor 488山羊抗小鼠、alexa-fluor 488igg1山羊抗小鼠和alexa-fluor 555山羊抗小鼠；1:500和1:1,000)来测试两种浓度的一级抗体(1:250和1:500)。染色后，每个细胞检测到的gem数量相似，与使用的一级/二级抗体组合无关。总之，在测定开发过程中，以1:500的稀释度使用一级和二级抗体，并将其以相同浓度组合用于测定。
[0182]
细胞固定
[0183]
细胞固定的质量决定免疫荧光的质量，从而决定效价测定的结果。固定温度是影响固定效率、图像质量并影响细胞形态(起泡、液泡形成等)的重要参数。对于raavhu68-smn1的不同moi，每个细胞检测到的gem数量在4℃或室温下在4％pfa/pbs中固定的细胞之间是相当的(图9)。因此，细胞在室温下被固定，因为它更方便用户。
[0184]
封闭缓冲液
[0185]
封闭缓冲液对于防止抗体的非特异性结合至关重要，这提高了免疫染色的质量。如果封闭是部分的或不充分的，抗体可能会结合至与特异性抗体-抗原反应性无关的各种位点。将用li-cor缓冲液的封闭与自制的5％正常山羊血清(ngs)/pbs进行比较。对于raavhu68-smn1的不同moi，每个细胞检测到的gem数量在li-cor封闭试剂或5％ngs/pbs中
温育的细胞之间是相当的(图10)。因此，细胞在5％ngs/pbs封闭试剂中温育，因为该组合物已被完全表征并控制。
[0186]
1.5数据采集和分析
[0187]
以1
×
104个细胞/孔的相对较低的细胞密度平铺神经母细胞瘤sh-sy5y kd细胞系。因此，采集的图像数量从20个视野/孔增加到30个视野/孔，以进行更具代表性的分析。
[0188]
用于检测和定量gem的参数对于测定的质量和可靠性至关重要。分析的两个主要参数是定量区域和gem定量方法。由于smn复合物的形成发生在细胞质中，gem定量的区域包括细胞核和细胞核外的8个像素。将分析限制在细胞核外的4个像素或仅细胞核按比例减少gem/细胞的数量，但不会影响测定的结果。
[0189]“局部最大值”方法是用于确定gem的数量的峰值检测方法，该方法可识别斑点检测区域内的像素强度的峰值。基于该方法，可以在一个斑点区域内检测到多个峰(一个峰＝一个对象)，从而增加每个细胞检测到的对象数量。实施了一种“盒子”方法，所述方法将斑点识别为可以计数和测量大小、形状和强度的区域。通过使用该方法，每个细胞检测到的对象数量减少，但被认为更能代表gem/细胞的数量。此外，如所预期的，在dox处理的细胞中未检测到gem。总之，通过使用“盒子”方法分析，对细胞核及细胞核外的8个像素的gem进行定量。
[0190]
许多生物反应符合s形曲线。测试大范围的raavhu68-smn1 moi(6.25
×
104至8
×
106vg/细胞)以达到每个细胞形成的gem数量的上限。然而，曲线的上渐近线并未始终达到。因此，曲线的线性部分(6
×
105至4
×
106vg/细胞)用于平行线分析。
[0191]
1.6效价测定的再现性
[0192]
为了评估再现性，由两名不同的分析人员在不同的日子进行三次测定，并对结果进行比较。如图11所示，三个实验是相似的，这通过代表平均结果的曲线上的低标准偏差进一步证明。
[0193]
1.7研究测定的稳定性指示特性
[0194]
为了确定gem形成效价测定是否具有稳定性指示，使raavhu68-smn1材料在不同温度下经受不同时间段的热应激(表3)。确定热应激后样品的基因组滴度。在根据新确定的基因组滴度调节其在测定中的浓度后，仅测试基因组滴度损失较小的样品的效价。表3中呈现的结果表明，与基因组滴度损失无关的效价显著下降。总之，gem形成测定具有稳定性指示，并且可用于sar和稳定性研究。
[0195]
表3.对raavhu68-smn1热应激样品的效价测定结果。
[0196][0197]
1.8空衣壳对效价测定的影响
[0198]
aav材料包含一小部分空aav粒子，其在纯化过程中无法消除并且可能会影响完整
粒子的转导效率(例如，raavhu68-smn1的参考标准含有5.6％的空粒子)。为了确定空粒子对病毒载体效价的影响，将含有固定量的完整粒子的raavhu68-smn1材料与空衣壳制剂掺杂，以实现两者之间的1:1和1:3比率。用helper、rep/cap和smn1质粒瞬时转染hek293悬浮细胞后获得空粒子，在cimq柱上与完整衣壳分离，中和，浓缩并在含0.01％pluronic-f68的哈佛缓冲液中进行缓冲液更换。还确定了raavhu68-smn1和空衣壳材料中的衣壳滴度和残留杂质水平，用于计算完整:空比和基质评估(表4)。在空制剂中发现高水平的hek hcp并且可能潜在地影响完整粒子的传染性。然而，空粒子材料对raavhu68-smn1效价没有影响(图12)并且本身不产生任何活性。
[0199]
表4.对完整粒子材料和空粒子材料进行的不同测试的结果(na＝不适用)。
[0200][0201]
结论
[0202]
为aav-smn重组病毒载体(如raavhu68-smn1)开发的基于细胞的效价测定依赖于通过高内涵成像对gem进行准确检测和定量。该测定使用sh-sy5y kd神经母细胞瘤细胞系伴有条件性敲低smn1基因，这降低smn蛋白的背景表达。使用该细胞系使测定与作用机制更加相关，并提高了测定性能。此外，该测定是合格的，并且在50-150％相对效价的线性范围内证明了99.6％的准确度和9.2％的精确度。
[0203]
示例性测定条件如下：
[0204]
·
细胞模型：用强力霉素预处理的smn kd人神经母细胞瘤sh-sy5yshrna120。
[0205]
·
细胞接种密度：1x104个细胞/孔。直接从冷冻状态平铺。
[0206]
·
对于标准品、样品和对照，一式三份运行起始moi为4
×
106vg/细胞和1.6倍系列稀释液的5点曲线。
[0207]
·
辅助病毒(ad5)不是必需的。
[0208]
总之，该测定可用于测量含有smn编码基因(例如，raavhu68-smn1)活性的病毒载体的相对效价，用于smn(例如，smn1)原料药和药物产品的释放、表征和稳定性研究。
[0209]
实施例2：gemin 2和smn1共定位
[0210]
以下实施例表明，当宿主细胞用1:1的丙酮:甲醇混合物固定时，可以通过免疫荧光显现gemin 2。为了改善染色和检测到的gem数量，用aavhu68-smn1感染sh-sy5y kd细胞(用shrna120敲低)。本实验的目的是通过cellinsight cx5高内涵成像(hci)证明gemin 2和smn蛋白在sh-sy5y kd细胞的gem中共定位。
[0211]
第0天：平铺细胞
[0212]
1.将用强力霉素预处理的冷冻sh-sy5y kd细胞在37℃的水浴中解冻2分钟，然后再悬浮在温暖的培养基中(42.3％dmem 42.3％ham's f-12营养混合物 15％fbs)。
[0213]
2.将细胞离心(在250g下离心5分钟)，然后再悬浮在5ml培养基中并计数
[0214]
3.对于20ml总细胞体积中的1x106个细胞，然后以1x104个细胞/200μl或5x104个细胞/ml平铺细胞。对于91％活细胞(0.9x106个细胞；5ml细胞在13ml培养基中)，将强力霉素添加到0.18x106个活细胞/ml中。
[0215]
4.然后向每个孔中添加200μl。
[0216]
5.每个板都在通风橱中放置20分钟。
[0217]
6.每个板在37℃和5％co2下温育过夜。
[0218]
第1天：细胞感染
[0219]
1.将培养基在37℃的水浴中加热20分钟。
[0220]
2.解冻aavhu68-smn1(4.27e13 gc/ml)。
[0221]
3.如下所述在2ml低蛋白结合深孔板中进行稀释(表5)，然后在每个孔中上下混合6-7次。
[0222]
表5.aav材料的稀释。
[0223] 最终滴度(gc/细胞)aav材料稀释a2
×
1065μl的aav-smn1 1595μl的培养基
[0224]
4.然后从含有细胞的所有孔中取出培养基，将150μl完全培养基添加到未感染的细胞和150μl的aavhu68-smn1中。
[0225]
5.将板在37℃和5％co2下温育48小时。
[0226]
第3天：细胞染色
[0227]
1.用多通道移液管从板中吸出培养基并直接倒入漂白剂中。
[0228]
2.在-20℃下在100μl的甲醇:丙酮(刚刚制成)的1:1混合物中固定15分钟。
[0229]
3.吸出固定剂并倾倒在化学通风橱的瓶子中。
[0230]
4.用dpbs洗涤2x300μl。
[0231]
5.添加300μl的licor pbs封闭缓冲液(在if方案最初开始时将其从冰箱中取出)，并且然后在室温下在belly dancer上缓慢摇动1.5小时(速度约2)。
[0232]
6.将封闭缓冲液倒入水槽中，并将多余的缓冲板朝下放在纸巾上。
[0233]
7.在licor缓冲液中以1:250稀释smn1抗体(gtx101047(兔))和gemin2(小鼠)抗体。
[0234]
8.每孔添加100μl的一级抗体(smn1和/或gemin2)，并在室温下在belly dancer上缓慢摇动(速度约2)，持续2小时。
[0235]
9.用3x300μl的dpbs 0.1％tween-20洗涤并在belly dancer上缓慢摇动(速度约2)，共15分钟(3*5分钟)。
[0236]
10.所有以下步骤均在黑暗中进行(用铝箔纸覆盖板)以保护二级荧光抗体免受光照。
[0237]
11.在licor封闭缓冲液中以1:500稀释alexa-fluor 594山羊抗小鼠、alexa-fluor 488山羊抗兔抗体。
[0238]
12.每孔添加100μl相应的二级抗体，并在室温下在belly dancer上缓慢摇动(速度约2)，持续1小时。
[0239]
13.用3x300μl的dpbs 0.1％tween-20洗涤并在belly dancer上缓慢摇动(速度约
2)，持续共15分钟。(3*5分钟)。
[0240]
14.在室温下在20分钟内添加200μl的稀释于dpbs中的dapi(1:6,000)，无需搅拌。
[0241]
15.去除dapi并添加200μl的pbs。
[0242]
16.在4℃下保存在铝箔纸中。
[0243]
第4天：成像
[0244]
使用cellinsight cx5 hci平台采集图像。
[0245]
结果：
[0246]
gemin 2(红色)染色较弱，这取决于获取图片所需的高曝光时间(约0.5s)，但确定了gemin 2在细胞中的位置。smn1(绿色)染色良好，曝光时间短，约为0.2s。极少数gemin 2阳性结构定位于细胞质中(每张图片约1个，上图中的红色箭头)。在用aavhu68-smn1感染细胞后，可以看到更多的smn1和gemin 2阳性结构。hci获取的图像显示smn1和gemin 2的重叠信号(图13a-b)。
[0247]
总之，这些结果表明smn1和gemin 2的共定位，并且在用aavhu68-smn1感染宿主细胞后观察到的smn1结构是gem。
[0248]
等效方案和范围
[0249]
本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。本发明的范围不旨在限于上述说明，而是如以下权利要求所述。