用于饮料分析的电化学传感器的制作方法

1.本发明一般涉及一种用于测定液体饮料样品中分析物浓度的干性传感器，所述干性传感器能够接收液体样品并将液体的ph值调整到适合测定目标分析物的程度。


背景技术：

2.在饮料生产和储存过程中的各个时间点测定分析物的浓度十分重要。在整个生产和储存过程中，必须仔细监测和控制饮料的组成成分，使最终产品美味诱人，没有微生物污染。为此，需要在工艺的各个阶段对防腐剂、调味剂等浓度进行监测和控制。
3.二氧化硫（so2）是葡萄酒行业中的一种重要防腐剂，必须对其浓度进行严格控制。如果so2的浓度过低，微生物的生长就会使葡萄酒变质。但是如果so2的浓度过高，葡萄酒的口味就会受到影响。
4.迄今为止，最可靠的so2测定方法（曝气氧化法）需要用磷酸对葡萄酒进行酸化处理（将溶解的亚硫酸根离子转化为so2气体），通过酸化溶液使空气起泡（从而留下潜在的干扰物质），将so2气体转移到含有过氧化氢的分离溶液中（将so2氧化成硫酸），最后用已知浓度的氢氧化钠对硫酸进行滴定。这些步骤可以在15分钟内由经过培训的操作人员手动进行，或使用实验室仪器（价值200,000澳元）自动进行。
5.苹果酸、葡萄糖和果糖是葡萄酒的重要调味剂。这些物质的标准测定方法包括以下步骤：将葡萄酒与ph缓冲剂混合，加入一种或多种酶和一种生色化合物，然后测定分光光度计的光吸收率变化。
6.这些标准程序要求将葡萄酒运输到实验室、使用昂贵的专用设备（需要由经过培训的实验室人员进行维护和校准）以及冗长的手动程序。总体结果较精确，但费用昂贵且不方便，而且葡萄酒商几小时后才能知晓结果。
7.用于测定亚硫酸盐的试纸法费用比较低廉，但由于操作人员必须人工读取颜色的强度（例如粉红色系），所以这类方法并不精确。
8.已经开发出实验室电化学法来测定亚硫酸盐（例如caldwell等（1991）《分析师》116:253-256），但是这类方法需要在两次测定的间隙对玻碳电极进行抛光。此手动步骤用时较长，会使每次测定的时间延长几分钟。此外，所述抛光方法需要专门技术，并不适用于薄膜电极。
9.本发明通过使用一次性试纸条传感器，能够快速准确地测定葡萄酒的几项临界参数。本发明并不要求将葡萄酒运输到配备有受训人员的专业化实验室，对设备校准维护也没有要求。另外，传感器工作期间不会产生液体废物。


技术实现要素：

10.本发明涉及用于分析饮料样品（尤其是发酵饮料，如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒或啤酒，或牛奶、酪浆或果汁等）从而测定是否存在目标分析物的方法和传感器。目标分析物包括但不限于游离二氧化硫、总糖、葡萄糖、果糖、苹果酸等。
11.本发明特别提及一种用于测定游离二氧化硫、总糖、葡萄糖、果糖、苹果酸浓度的传感器，但是应理解所述传感器并不限于此种特定用途并且适用于其他分析测定。
12.本发明的实施例涉及一种用于分析液体饮料样品（如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒、啤酒、牛奶、酪浆或果汁等）的干性传感器。在某些实施例中，本文公开的装置和方法包括一个一次性试纸条传感器（以下简称“传感器”）和一个仪表。在某些实施例中，所述传感器为干性传感器，能够将液体样品的ph值调整到适合测定目标分析物的程度。
13.在某些实施例中，本发明进一步包括一个仪表，其中，所述仪表能够将液体样品的温度调整到适合测定分析物的程度。在某些实施例中，所述仪表能够施加一系列电位、测定电流-时间关系、去除背景信号、确定限制性电化学粒种的扩散系数、计算一种或多种分析物的浓度以及在不产生液体废物的情况下向用户提供所需的液体样品信息。
14.在某些实施例中，本发明是一种包括传感器和仪表的系统，其中，所述系统在一系列环境温度、溶液ph值和溶液粘度的范围内工作。
15.在某些实施例中，本发明是一种用于评估液体饮料样品中目标分析物的传感器，其中，所述传感器包括一个第一电极、一个第二电极和一个对向表面。在某些实施例中，所述对向表面可包括第二电极。因此，某些实施例涉及一种对向电极传感器，即彼此相对的第一电极和第二电极。在某些实施例中，所述对向表面为平滑对向表面。例如，在某些实施例中，电极为共面电极。
16.在本发明的实施例中，所述第一电极涂有含电活化粒种的试剂，所述对向表面涂有ph改性剂，所述ph改性剂能够将液体样品的ph值调整到适合测定目标分析物的程度，其中，存在液体饮料样品时，所述传感器检测到氧化还原反应。
17.在某些实施例中，所述对向表面涂有能够改变液体样品ph值的试剂，所述试剂在本文中称为“ph改性剂”。在某些实施例中，期望ph值介于1和3之间，例如so2。在某些实施例中，期望ph值介于4和5、6和9或其他ph值范围之间，当传感器进行测定时，所述期望ph值适合使用期望的化学试剂。
18.在某些实施例中，所述ph改性剂为酸性试剂，如草酸或其他酸，所述其他酸为在传感器的规定工作和储存温度范围内的固体酸。合适的酸示例包括草酸、柠康酸、蜜腊酸、樟脑磺酸以及在传感器的工作和储存范围内具有合适ph值和稳定性的其他酸。在某些实施例中，所述ph改性剂为两种或多种酸的混合物。在某些实施例中，所述ph改性剂为草酸和柠康酸的混合物。
19.在某些实施例中，所述ph改性剂为碱性试剂，如氢氧化钠或其他碱，所述其他碱为在传感器的规定工作和储存温度范围内的固体碱。合适的碱示例包括氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钾、三（羟甲基）氨基甲烷、n-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸、n-环己基-3-氨基丙烷磺酸、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸、焦磷酸盐和其他碱，在传感器的工作和储存条件下，所述其他碱具有合适的ph值和稳定性。在某些实施例中，所述碱为n-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸和氢氧化钠的混合物。在某些实施例中，使用浓缩缓冲液。在某些实施例中，所述ph改性剂包括合适的缓冲液和合适的碱，或其组合或混合物。
[0020]
在某些实施例中，所述第一电极涂有含电活化粒种的干态试剂。在某些实施例中，所述电活化粒种为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、乙二胺四乙酸铁、吩嗪乙基硫酸盐、1,2-萘醌-4-磺酸或其组合或混合物。在某些实施例中，所述电活化粒种为亚
铁氰化钾。在某些实施例中，所述电活化粒种为铁氰化钾。
[0021]
在某些实施例中，所述目标分析物为葡萄糖、果糖和苹果酸，所述电活化粒种为铁氰化物或乙二胺四乙酸铁。在某些实施例中，所述目标分析物为so2，所述电活化粒种为铁氰化物。
[0022]
在某些实施例中，所述传感器进一步包括酶，例如但不限于苹果酸脱氢酶、谷氨酸草酰乙酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、心肌黄酶或其组合或混合物。在某些实施例中，所述传感器进一步包括果糖脱氢酶。
[0023]
在某些实施例中，所述传感器进一步包括葡萄糖选择酶，例如葡萄糖脱氢酶或葡萄糖氧化酶。在某些实施例中，所述第一电极涂有铁氰化钾，所述传感器进一步包括葡萄糖选择酶，例如gdh-pqq、fad-gdh或god（gdh代表葡萄糖脱氢酶；pqq代表吡咯并喹啉醌；fad代表黄素腺嘌呤二核苷酸，god代表葡萄糖氧化还原酶）。
[0024]
在示例性实施例中，所述目标分析物为so2。在某些实施例中，所述ph改性剂为n-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸和氢氧化钠的混合物，所述电活化粒种为亚铁氰化钾。在某些实施例中，所述so2与电极直接发生反应。
[0025]
在示例性实施例中，所述目标分析物为葡萄糖。在某些实施例中，所述电活化粒种为铁氰化钾。在某些实施例中，所述试剂进一步包括葡萄糖选择酶。在某些实施例中，所述试剂进一步包括fad-gah。在某些实施例中，所述试剂进一步包括god。在某些实施例中，所述ph改性剂包括n-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸。
[0026]
在示例性实施例中，所述目标分析物为果糖。在某些实施例中，所述电活化粒种为铁氰化钾，所述ph改性剂包括n-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸。
[0027]
在示例性实施例中，所述目标分析物为苹果酸。在某些实施例中，所述电活化粒种为乙二胺四乙酸铁、吩嗪乙基硫酸盐和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，所述ph改性剂为n-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸和氢氧化钠的混合物。
[0028]
在某些实施例中，通过构成本发明一部分的系统和/或算法对粘度效应进行校正。因此，在某些实施例中，无需将粘度控制在一定范围内。
[0029]
在某些实施例中，需要控制试纸条的温度，例如通过加热试纸条进行控制。在某些实施例中，仪表通过让电流通过电阻元件来加热试纸条。
[0030]
在某些实施例中，期望的温度约为5℃-45℃。在某些实施例中，期望的温度约为10℃-45℃。在某些实施例中，期望的温度约为15℃-45℃。在某些实施例中，期望的温度约为20℃-45℃。在某些实施例中，期望的温度约为25℃-45℃。在某些实施例中，期望的温度约为30℃-45℃。在某些实施例中，期望的温度约为35℃-45℃。在某些实施例中，期望的温度约为40℃-45℃。
[0031]
本发明的其他实施例涉及本文所公开发明的传感器和试纸条的使用方法。
[0032]
在本发明中，所述传感器与仪表电气连接。在某些实施例中，所述仪表在所述试纸条上施加预先确定的电压或电流，然后测定由此产生的电流或电压。本领域技术人员应了解，这些方法分别称为安培滴定法或恒电流电化学技术。
[0033]
在某些实施例中，施加的脉冲序列包括预先确定时间段内的一系列预先确定电位。
[0034]
在某些实施例中，采用了脉冲伏安法。在某些实施例中，所述仪表将电位从约0 v
缓慢升至约1 v，并在斜坡顶端施加矩形波或正弦脉冲。在某些实施例中，施加脉冲的振幅约为1 mv-100 mv，频率约为1 hz-1000 hz。在某些实施例中，采用直流计时电位法，仪表施加约50 mv-约900 mv的恒定电位，并持续约0.1秒-约1000秒。
[0035]
在某些实施例中，所述仪表能够将液体样品的温度调整到适合测定的程度。在某些实施例中，所述仪表计算、记录、显示和/或传输反应结果。例如，在某些实施例中，测定了电流-时间关系。在某些实施例中，所述仪表测定电流-时间关系。在某些实施例中，针对背景信号对测量值进行校正，提高了读数精度（减小了误差）。在某些实施例中，所述仪表去除了背景信号。在某些实施例中，所述仪表确定了限制性电化学粒种的扩散系数。在某些实施例中，所述仪表计算了一种或多种分析物的浓度。在某些实施例中，所述仪表计算了目标分析物的浓度。在某些实施例中，所述仪表向使用者展示信息。
附图说明
[0036]
图1是带对向电极的示例性传感器的示意图。
[0037]
图2是图1所示示例性试纸条的分解图。
[0038]
图3是显示了示例性传感器测得的游离二氧化硫与澳大利亚葡萄酒研究所通过thermo gallery参考分析仪获得的参考结果对比的图表，n=471种葡萄酒。
[0039]
图4a是显示了使用表1数据的糖与扩散系数（d）对比关系以及与二次曲线拟合后的绘制图。
[0040]
图4b是显示了糖（蔗糖 果糖 葡萄糖）总浓度的绘制图。
[0041]
图5是显示了两（2）种加入各种浓度葡萄糖的葡萄酒的葡萄糖浓度的绘制图。
[0042]
图6是显示了加入各种浓度葡萄糖并在试纸条上进行测试的12种红葡萄酒和12种白葡萄酒的绘制图。
[0043]
图7是显示了加入各种浓度果糖并在试纸条上进行测试的白葡萄酒的绘制图。
[0044]
图8是显示了加入各种浓度苹果酸并在试纸条上进行测试的3种红葡萄酒的绘制图。
具体实施方式
[0045]
本发明采用了电化学传感器，使用与生产onetouch
® verio
®
葡萄糖传感器（由lifescan推出）和xprecia stridetm血液凝固传感器（由siemens healthineers推出）所采用的方法类似的方法可以大规模生产所述电化学传感器。
[0046]
本文中使用的术语“ph改性试剂”或“ph改性剂”系指当混合到水溶液中时改变溶液中存在的质子和氢氧离子浓度的试剂。例如，ph改性剂是一种能够向液体样品释放出质子（以降低ph值）或从液体样品接收质子（以提高ph值）的试剂。示例性ph改性剂包括但不限于酸（如草酸、柠康酸、蜜腊酸、樟脑磺酸以及在传感器的工作和储存条件下具有合适ph值和稳定性的其他酸）和碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钾、三（羟甲基）氨基甲烷、n-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙烷磺酸、n-环己基-3-氨基丙烷磺酸、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸、焦磷酸盐以及在传感器的工作和储存条件下具有合适ph值和稳定性的其他碱。
[0047]
本文中使用的术语“电活化粒种”系指一种能够接收电子或向电极释放电子的粒种。在电活化粒种与电极、分析物、酶、酶辅助因子（辅酶）或二次介体之间可能发生电子转
移。本文中使用的示例性电活化粒种包括但不限于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、乙二胺四乙酸铁、吩嗪乙基硫酸盐、1,2-萘醌-4-磺酸或其组合或混合物。以下详细探讨了本发明的示例性实施例。虽然探讨了具体示例性实施例，但是应理解其目的仅限于说明。相关领域技术人员应认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以使用其他组件和配置。对“一个实施例”、“实施例”、“示例实施例”、“各个实施例”等的引用可能表示以这种方式描述的本发明的实施例可包括特定特征、结构或特性，但并非每一个实施例都必然包括所述特定特征、结构或特性。进一步地，重复使用短语“在一个实施例中”或“在示例性实施例中”不一定指相同的实施例（虽然有可能指相同的实施例）。
[0048]
本发明涉及一种传感器，所述传感器包括至少两个电极（例如，在测定过程中可作为工作电极、反电极或同时作为工作电极和反电极使用的电极）；无、一种或多种酶；无、一种或多种电化学介体；以及无、一种或多种电活化粒种，所述电活化粒种能够通过在传感器电极处放弃或接收电子来接通电化学电路。在某些实施例中，一个或多个电极上涂有一种或多种试剂。如下文所述，通过向传感器中加入样品，即可使用这些传感器。通过电极处的氧化还原反应，即可检测到电活化粒种。
[0049]
本发明用途广泛，例如，用于测定发酵饮料（如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒或啤酒）或饮料（如牛奶、酪浆或果汁等）中的防腐剂和调味剂（如游离二氧化硫、总糖、葡萄糖、果糖、苹果酸等）的方法。
[0050]
在本发明的实施例中，如本领域所知，所述电极由溅镀有薄薄一层惰性导电材料的聚（对苯二甲酸乙二醇酯）（pet）基板组成。也可使用其他基板材料，但是由于pet在传感器工作和储存条件下十分稳定并且具有较低的热膨胀系数，因此特别优选采用pet。合适的惰性导电材料示例包括铂、钯、铱、氧化铟、氧化锡、氧化铟和氧化锡的混合物、碳和金。在某些实施例中，金用作惰性导电材料。在某些实施例中，为了延长传感器的保质期，所述惰性导电材料涂有亲水性硫醇。第6,652,734号美国专利“保质期改进的传感器”中提供了亲水性涂层的示例，所述美国专利的公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0051]
在某些实施例中，本文公开的传感器包括对向电极，即电极彼此面对。在其他实施例中，所述传感器包括共面电极。对向电极的优点在于，电极配置便于确定限制性电化学介体的扩散系数，从而校正不同测定中粘度和/或温度变化对传感器响应的部分影响。第wo 99/09404号国际出版物“自动分析方法和装置”对这项技术进行了说明，所述国际出版物的公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0052]
在使用共面电极的实施例中，有利的情况是，所述传感器进一步包括一个与放置共面电极的表面相对的表面。放置共面电极的表面以下称为共面电极表面，对向表面以下称为平滑对向表面。有利的情况是，在试验过程中，所述平滑对向表面的定位使得平滑对向表面上可涂覆并溶解到试验溶液中的任何试剂可以通过扩散作用穿过共面电极表面上方的溶液层深度来实现混合。只需使平滑对向表面与共面电极表面保持适当距离即可。共面电极表面与平滑对向表面之间适当距离范围的示例为5微米-500微米，更优选为20微米-200微米，最优选为50微米-150微米。
[0053]
在某些实施例中，第一电极包括干态试剂，所述干态试剂包括电活化粒种和一种或多种附加试剂，例如与目标分析物发生选择性反应的酶。例如，在某些实施例中，可采用葡萄糖选择酶和铁氰化钾来测定葡萄糖（例如，参见第9,632,054号美国专利“用于高精度
分析物测量的系统和方法”，所述美国专利通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分）。
[0054]
在某些实施例中，所述第二电极或平滑对向表面可选用酸性或碱性的干态试剂。如本领域所知，所述酸性或碱性试剂可以是强酸或强碱（例如分别为草酸或氢氧化钠），或者包含一种在期望ph值范围内具有缓冲能力的化合物。这些干态试剂需要在传感器的规定工作和储存温度范围内呈固态。此试剂旨在改变液体样品的ph值，使液体样品的ph值保持在测定过程中期望发生反应的合适范围内。例如，很多酶在接近中性ph值时活性最高，而在很多饮料（如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒、啤酒、牛奶、酪浆或果汁等）中处于低ph值条件时活性较低。
[0055]
在某些实施例中，所述两个电极或所述共面电极表面和平滑对向表面通过一层带粘合面的双面胶带（在本文中称为双面粘胶带）隔开，从双面粘胶带上剪掉一段，限定传感器中的至少一个区域，使液体样品通过或容纳液体样品，或者在添加液体样品时从传感器中排出气体。在某些实施例中，所述粘合层可由热熔胶或压敏粘合剂组成。由于热熔胶在环境温度下粘性较小，而且在传感器生产过程中热熔胶不太可能转移到切削刀具的表面，因此前者（即热熔胶）有优势。
[0056]
在某些实施例中，双面粘胶带中的孔道将已经干燥的试剂覆盖到电极和/或平滑对向表面上。在某些实施例中，双面粘胶带的侧壁、电极表面和/或平滑对向表面限定了最终将添加待分析液体（例如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒、啤酒、牛奶、酪浆或果汁等）的腔室。
[0057]
在某些实施例中，本文公开的传感器包括对向电极，即电极彼此面对。在其他实施例中，所述传感器包括共面电极。对向电极的优点在于，电极配置便于确定限制性电化学介体的扩散系数，从而校正不同测定中粘度和/或温度变化对传感器响应的部分影响。第wo 99/09404号国际出版物“自动分析方法和装置”对这项技术进行了说明，所述国际出版物的公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0058]
在某些实施例中，第一电极包括与特定的目标分析物发生反应的干态试剂。例如，在某些实施例中，可采用葡萄糖选择酶和铁氰化钾来测定葡萄糖（例如，参见第9,632,054号美国专利“用于高精度分析物测量的系统和方法”，所述美国专利通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分）。
[0059]
在某些实施例中，所述第二电极可选用酸性或碱性的干态试剂。如本领域所知，所述酸性或碱性试剂可以是强酸或强碱（例如分别为草酸或氢氧化钠），或者包含在期望ph值范围内具有缓冲能力的化合物。这些干态试剂需要在传感器的规定工作和储存温度范围内呈固态。此试剂旨在改变液体样品的ph值，使液体样品的ph值保持在测定过程中期望发生反应的合适范围内。例如，很多酶在接近中性ph值时活性最高，而在很多饮料（如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒、啤酒、牛奶、酪浆或果汁等）中处于低ph值条件时活性较低。
[0060]
可通过各种因素确定本文所述各种试剂的最佳位置，包括优化测定时间以及特定组分在特定ph值下的不稳定性。例如，在某些实施例中，根据每个组分在高或低ph值下的不稳定性，使用ph改性剂对本文所述试剂的组分进行干燥处理，或者在对此组分进行干燥处理时远离所述ph改性剂（或与所述ph改性剂相对）。此外，在某些实施例中，可以直接在工作电极上对缓慢扩散的反应物进行干燥处理，以及在反电极/参考电极（或平滑对向表面）上对快速扩散的反应物进行干燥处理，以优化测定时间。
[0061]
在某些实施例中，所述两个电极通过一层带粘合面的双面胶带（在本文中称为双面粘胶带）隔开，从双面粘胶带上剪掉一段，限定传感器中的至少一个区域，使液体样品通过或容纳液体样品，或者在添加液体样品时从传感器中排出气体。在某些实施例中，所述粘合层可由热熔胶或压敏粘合剂组成。由于热熔胶在环境温度下粘性较小，而且在传感器生产过程中热熔胶不太可能转移到切削刀具的表面，因此前者（即热熔胶）有优势。
[0062]
在某些实施例中，双面粘胶带中的孔道将已经干燥的试剂覆盖到电极上。在某些实施例中，双面粘胶带的侧壁和电极表面限定了最终将添加待分析液体（例如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒、啤酒、牛奶、酪浆或果汁等）的腔室。
[0063]
在某些实施例中，有利的做法是控制试纸条的温度。环境温度变化很大（例如5-45℃），从而影响电化学响应。其次，在较窄的温度范围内，某些反应（例如酶催化反应）的效率最高：如果温度过低，则反应过慢；但是如果温度过高，则酶会变性失效。在某些实施例中，最佳做法是将试纸条加热至特定温度，而不是试图将试纸条冷却至设定温度：这是因为加热组件的成本较低，并且与冷却组件相比，加热组件达到期望温度所需的能量较少。
[0064]
图1显示了用相对电极制成的传感器的示例，图2对其进行了更详细的描述。
[0065]
图1显示了传感器的示意图。将一滴液体样品（如葡萄酒、烈酒、康普茶、克非尔酒、啤酒、牛奶、酪浆或果汁等）置于凹口（1）上。表面张力使液体沿着毛细填充孔道（2）向上流动，进入反应/检测室（3），由于存在“截流孔”（4），液体不再继续流动。由此使得限定体积的液体与在反应/检测室（3）中经过干燥处理的试剂发生反应。在极少数情况下，如果液体通过截流孔，则液体流入“溢流区”（5）。这种机制可防止传感器中的液体污染仪表。利用一部分传感器（6）层上的切口，可使仪表与上电极接触。利用两个叉齿（7），可使仪表与下电极接触。
[0066]
第6,939,312号美国专利“组织液及全血样品的采样及分析方法和装置”对确保液体沿填充孔道移动并进入反应/检测室所需的表面能考虑因素进行了说明，所述美国专利通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0067]
图2显示了传感器中五个层的分解图。在某些实施例中，第一（最低）层（8）是“亲水底层”，其制作方法是用水溶性热熔胶（adhesives research公司，jlf-19dec19-1或jlf-19dec19-2eastman kodak）涂覆pet。
[0068]
在某些实施例中，第二层是用金溅镀pet制成的电极。所述电极具有穿孔状部分，形成“凹口”（9）、“填充孔道”（10）、“截流孔”（11）和“间隙”（12）。利用所述间隙两侧的两个叉齿（13），可使仪表与所述电极连接。在某些实施例中，所述电极涂有亲水性硫醇层。在某些实施例中，填充孔道与截流孔之间的电极区域进一步涂有一种或多种试剂，这些试剂可与目标分析物发生反应。
[0069]
在某些实施例中，第三层是双面粘胶带，在几个功能部位（包括“凹口”（14）、“填充孔道”（15）、“反应/检测室”（16）、“截流孔”（17）、“溢流区”（18）和“间隙”（20））形成切口，使电极与恒电位仪连接，例如手持式仪表（下文将对此进一步说明）。双面粘胶带（19）在间隙两侧的两个臂将两个电极分开，使其无法相互触碰，避免电路短路。
[0070]
在某些实施例中，第四层是用金溅镀pet制成的电极。所述电极具有穿孔状部分，形成“凹口”（21）和“截流孔”（22）。在某些实施例中，所述电极涂有亲水性硫醇层，并进一步涂有ph改性粒种，如草酸、氢氧化钠或磷酸钾。在某些实施例中，将所述ph改性粒种涂在与“反应/检测室”相对应的区域，或与“填充孔道”相对应的区域。后一种方法的优势将在下文描述抗氧化剂校正时变得显而易见。
[0071]
第五（最高）层是“顶层”（23），在某些实施例中，顶层由涂有胶粘剂的pet制成。在某些实施例中，第五层可选包括条形码带，条形码带可包含分析物的身份、生产批号、有效期、校准参数等信息。
[0072]
将这五个层全部层压在一起时，即构成图1所示的完整传感器。在某些实施例中，将传感器左侧的两个“叉齿”插入仪表（恒电位仪）中。在某些实施例中，所述仪表将传感器加热至所需温度。将待分析液体置于传感器右侧的“凹口”上。液体沿填充孔道（借助亲水底层）移动并进入检测室，但不进入截流孔。液体使试剂溶解并调整到适当的ph值，然后与试剂发生反应。所述仪表在上下电极之间施加电压脉冲序列。然后，利用算法对由此产生的电流-时间瞬变关系进行分析。所述分析包括：测定限制性电化学粒种的扩散系数、测量背景电流、从总电流中去除背景电流、校正电流除以扩散系数、使用校准参数将信号转换为最终值（如特定分析物的浓度）。
[0073]
以下示例对传感器的特定实施例进行了说明。
[0074]
示例。
[0075]
示例1.二氧化硫传感器。
[0076]
利用旋转转换过程，在双面粘胶带（胶带两侧各有一张离型纸）上吻切“反应/检测室”和“溢流区”。
[0077]
使用8号不锈钢钝头移液针，以800微升/分钟的速度移取80 mm亚铁氰化钾 1 mg/ml pluronic f87的溶液。亚铁氰化物的功能是“接通电路”，使so2从试纸条一侧的阴极接收电子时，亚铁氰化物向试纸条另一侧的阳极释放电子。
[0078]
在电极上沉淀亚铁氰化物溶液流，并且电极以10米/分钟的持续速度移动。在红外灯泡下对液体进行干燥处理。由此形成了下电极。将双面粘胶带层压到下电极上，使反应/检测室与经干燥处理的试剂重叠。使用凸模和凹模组，在双层层压材料上冲切填充孔道。同时冲切“间隙”（图2中标记为12）。
[0079]
如上所述，在上电极上沉淀4.5 m柠康酸 110 mm草酸 1 mg/ml pluronic f87的溶液，并进行干燥处理。在这种情况下，在与“反应/检测室”相对应的区域上对酸进行干燥处理。然而，在某些实施例中，可在与“填充孔道”相对应的区域上对酸进行干燥处理。将上电极层压到双面粘胶带上，使上电极正对下电极。使用凸模和凹模组，在三层层压材料上同时冲切凹口和截流孔。
[0080]
在下电极下方对亲水底层进行层压，并在上电极上方对顶层进行层压。将五层层压材料切成单个试纸条。由此试纸条制作完成。
[0081]
最终试纸条尺寸为8 mm宽、30 mm长。底部工作电极的面积为0.1128平方厘米，电极之间相距95微米。对于本领域技术人员显而易见的是，其他尺寸和几何形状也属于本发明的范围。
[0082]
澳大利亚葡萄酒研究所使用二氧化硫试纸条对各种葡萄酒进行了试验。使用仪表进行试验，仪表可将传感器加热至32℃。将一滴葡萄酒(≥ 6微升）装载到传感器的凹口区域上。样品测定后，施加指定的电压序列。此电压序列由5秒种等待和位于线性斜坡电压（每周期增加4 mv）顶部的方波脉冲序列（40 mv峰谷，38.5 hz）组成。实际上，在每个周期开始
时，电位增加44 mv，保持13毫秒恒定不变，然后下降40 mv，再保持13毫秒恒定不变。此脉冲序列大致基于caldwell等人（1991）在《分析师》116:253-256中使用的脉冲序列。用方波代替正弦波，这是因为在价格低廉的恒电位仪中更容易产生方波。脉冲序列之后是7秒等待，最后是600 mv电位秒。
[0083]
由于通过用于制造传感器的各个切割和冲压工艺明确限定下电极的面积，因此下电极为工作电极。
[0084]
每1毫秒测量一次电流。每次电位增加44 mv，电流就上升至峰值，然后下降至稳定水平。同样，每次电位下降40 mv，电流就下降至波谷值，然后增加至稳定水平。目标参数是指较高的稳定电流和（先前）较低的稳定电流之间的差异。此差异称为“三角形稳定电流”，附图中绘制了此差异与电位的对比关系（见图5）。
[0085]
根据thermo gallery参考分析仪，从已试验的253种红葡萄酒和218种白葡萄酒中获得数据，对这些数据进行检查，结果表明，距三角形稳定电流约600 mv处的峰值高度与游离二氧化硫的浓度相关。通过进行背景去除，使信号细化，其中背景去除涉及使用二氧化硫峰谷以外420 mv和100 mv的三角形稳定电流来去除拟合指数。
[0086]
这种方法可以从总信号中去除每种葡萄酒中的背景信号。其差异产生的信号仅来自亚硫酸盐。由于每种葡萄酒可能具有不同浓度的背景（干扰物质）电活化粒种，如花青素、多酚和单宁，因此这种方法十分有利。
[0087]
针对红葡萄酒和白葡萄酒，对由此产生的二氧化硫信号分别进行校准。图3根据澳大利亚葡萄酒研究所试验的全部471种葡萄酒的thermo gallery参考分析仪结果绘制了已校准的测量值。
[0088]
可将短亚硫酸盐试验与caldwell等人发表的10-12分钟试验进行对比。还可将本发明所述的快速试验与15分钟曝气氧化测定（亚硫酸盐测定的金标准）进行对比。
[0089]
同时还评估了干扰所产生的影响。由于每种葡萄酒的糖浓度不同（最高可达200 g/l），扩散系数受到影响，从而进一步影响电流。
[0090]
通过在算法中使用实测扩散系数，减少了因糖浓度变化而引起的误差。在脉冲伏安序列结束时，仪表等待7秒钟（所有粒种均随机化处理，这样就不存在浓度梯度），然后施加连续600 mv脉冲并持续3秒钟。根据第wo 99/09404号国际出版物中公开的方法，从本质上分析电流-时间瞬态关系，所述国际出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0091]
1）确定获得的最大电流（施加600 mv恒定脉冲后不久）以及最小电流（mini；在600 mv脉冲即将结束时）。
[0092]
2）选取介于1.05*mini和1.43*mini之间的600 mv瞬态部分。这个部分与衰减范围相对应，衰减通过单个指数函数（加上偏移量）进行良好拟合。
[0093]
3）生成ln(i(t)/mini-1)与时间的关系图。
[0094]
4）计算关系图的斜率。
[0095]
5）d =
ꢀ‑ꢀ
斜率 * 0.0095
2 / (4π2)，其中0.0095是两个电极之间的距离（cm）值。d的单位是cm2s-1
。
[0096]
6）d乘以106得到更易处理的数值。
[0097]
7）将前一个原始信号（脉冲伏安法中的峰电流）除以d。
[0098]
8）由此形成校准过程所需的新原始信号。
[0099]
实测so2的精度提高情况如表1所示。当葡萄酒中加入220 g/l糖时，so2的测量误差接近-30%（参见表1第四列的粗体数字）。然而，一旦根据实测扩散系数进行读数校正，最坏情况误差仅为11%。
[0100]
示例2.总糖传感器。
[0101]
使用表1中的数据绘制糖浓度与d的关系图，并对各点做二次曲线拟合（参见图4a）。
[0102]
如图4b所示，鉴于d的测量值和拟合方程，所述仪表能够预测糖（蔗糖 果糖 葡萄糖）的总浓度。
[0103]
总糖类似于葡萄酒商在常规情况下测量的“白利糖度值”（基于密度或折射率）。
[0104]
示例3.含gdh-pqq的葡萄糖传感器。
[0105]
通过对上述亚硫酸盐传感器方法做出改动来制作葡萄糖传感器。葡萄糖测定化学和算法来源于第7,291,256号美国专利“介体稳定的试剂组合物及其用以电化学分析物测定的方法”，或第8,404,102号美国专利“用于快速电化学分析的方法和仪器”，或第8,916,040号美国专利“测量样品中分析物的系统和方法”，或第9,632,054号美国专利“用于高精度分析物测量的系统和方法”，所述美国专利公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0106]
使用900 mm铁氰化钾和20 mg/ml fad-gdh（gdh代表葡萄糖脱氢酶；fad代表黄素腺嘌呤二核苷酸）将下电极条带化。为了将葡萄酒的ph值调整至更适合于gdh的范围，使用200 mm氢氧化钠将上电极条带化。
[0107]
采用以下电压脉冲序列。施加 20 mv电压一（1）秒（上电极为阳极的情况下），施加 300 mv电压三（3）秒，最后施加-300 mv电压一（1）秒。每十（10）毫秒测量一次电流，并在五十（50）毫秒周期求平均值。
[0108]
在两种葡萄酒中加入各种浓度的葡萄糖，并在试纸条上进行试验。结果如图5所示。
[0109]
在本示例中，在与“反应/检测室”相对应的区域上对氢氧化钠进行干燥处理。然而，在某些实施例中，可以在与“填充孔道”相对应的区域上对氢氧化钠进行干燥处理。后一种方法的优势在于，可使用第8,163,162号美国专利“在存在干扰物的情况下用于分析样品的方法和仪器”所述的发明进行抗氧化剂校正，所述美国专利通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0110]
示例4.含god的葡萄糖传感器。
[0111]
通过对上述亚硫酸盐传感器方法做出改动来制作葡萄糖传感器。葡萄糖测定化学和算法来源于第7,291,256号美国专利“介体稳定的试剂组合物及其用以电化学分析物测定的方法”，或第8,404,102号美国专利“用于快速电化学分析的方法和仪器”，或第8,916,040号美国专利“测量样品中分析物的系统和方法”，或第9,632,054号美国专利“用于高精度分析物测量的系统和方法”，所述美国专利公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
[0112]
使用试剂对下电极进行条带化，所述试剂包含0.498 g/l pluronic p103（basf）、0.258 g/l pluronic f87（basf）、0.300 g/l柠康酸、10.00 g/l柠康酸二钾和15.36 g/l蔗
糖，溶于水形成试剂缓冲液。其中添加29.63 g/100g的试剂缓冲液铁氰化钾和112 mg/100g的黑曲霉葡萄糖氧化还原酶（god）试剂缓冲液。为了将葡萄酒的ph值调整至更适合于god催化的葡萄糖氧化的范围，使用100 mm三（羟甲基）氨基甲烷碱，将上电极条带化。
[0113]
采用以下电压脉冲序列。施加 20 mv电压一（1）秒（上电极为阳极的情况下），施加 300 mv电压三（3）秒，最后施加-300 mv电压十（10）秒。每十（10）毫秒测量一次电流。使用以下算法，将电流转换为葡萄糖浓度：[葡萄糖] = ((-i(5)/100)^r
ꢀ–ꢀ
a.ippmin/100)-截距)/斜率式中，[葡萄糖]是实测葡萄糖浓度，i(5)是在传感器上施加-300 mv电压后5秒的电流，ippmin是在传感器上施加 300 mv电压期间记录的最小电流，r、a、截距和斜率是所选的可调参数，用于优化[葡萄糖]与已知葡萄糖浓度之间的一致性，在校准实验期间使用参考仪器测定已知葡萄糖浓度（[参考葡萄糖]）。截距和斜率分别是通过对（[参考葡萄糖]，[葡萄糖]）数据对应用线性最小二乘回归测定的y轴截距和斜率。在此算法中，包含i(5)的项给定了样品中葡萄糖的量度，以及样品特定的非葡萄糖相关传感器信号。包含ippmin的项仅为样品特定的非葡萄糖相关传感器信号的量度。将这两项去除即为传感器信号非葡萄糖部分的校正方法。
[0114]
在12种红葡萄酒和12种白葡萄酒中加入各种浓度葡萄糖并在试纸条上进行测试。结果如图6所示。
[0115]
示例5.果糖传感器。
[0116]
可以借鉴adachi等人（《生物电化学》（2019）12:1-9）提出的化学法来制作果糖传感器，所述公开通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。来自葡萄糖酸杆菌（sigma）的d-果糖脱氢酶可以接收来自果糖的电子并将其传递给铁氰化钾，从而提供一种简便的果糖电化学测定法。
[0117]
在白葡萄酒中加入各种浓度的果糖，并在试纸条上进行试验，其中所述试纸条在下电极上用750 mm铁进行条带化。在32
°
c下，在试纸条上对10 ul的各种[果糖]加标葡萄酒 2 ul 300 mm tris碱 2 ul 1000 u/ml fdh进行测试。
[0118]
采用以下电压脉冲序列。施加 20 mv电压一（1）秒（上电极为阳极的情况下），施加 300 mv电压三（3）秒，最后施加-300 mv电压一百（100）秒。每十（10）毫秒测量一次电流。使用以下算法，将电流转换为果糖浓度：[果糖] = ((-i(20)^a)-截距)/斜率式中，[果糖]是实测果糖浓度，i(20)是在传感器上施加-300 mv电压后20秒的电流，ippmin是在传感器上施加 300 mv电压期间记录的最小电流，a、截距和斜率是所选的可调参数，用于优化[果糖]与加标果糖浓度（[加标果糖]）之间的一致性。结果如图7所示。
[0119]
示例6.苹果酸传感器苹果酸脱氢酶可催化以下反应：苹果酸 nad

ꢀ→ꢀ
草酰乙酸盐 nadh很难在电极处直接拾取nadh，二次介体（如铁氰化物或心肌黄酶）用于将电子从nadh引导至二次介体（如feedta），或直接引导至阳极。
[0120]
通过催化草酰乙酸盐经转氨作用生成天冬氨酸这一过程，谷氨酸草酰乙酸转氨酶（got，又名天冬氨酸转氨酶，ast）和谷氨酸的添加可以促进nadh的形成。
[0121]
通过对上述传感器方法做出改动来制作苹果酸传感器。
[0122]
使用试剂对下电极进行条带化，所述试剂包含200 mm feedta、200 mm烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1.00 g/l pluronic f87（basf）（溶于水）。使用试剂对上电极进行条带化，所述试剂包含1.00 g/l pluronic f87（basf）、2000 u/ml苹果酸脱氢酶（toyobo，mad-211）、200 u/ml心肌黄酶（sigma，d5540）、50 mm[三（羟甲基）甲氨基]丙烷磺酸、37.5 mm氢氧化钠和50 mm蔗糖，溶于水形成试剂缓冲液。
[0123]
采用以下电压脉冲序列。施加0 mv电压一（1）秒，施加 300 mv电压三（3）秒（上电极为阳极的情况下），施加-300 mv电压一百八十（180）秒，施加0 mv电压十（10）秒，最后施加-300 mv电压七（7）秒。每五十（50）毫秒测量一次电流。使用以下算法，将电流转换为苹果酸浓度。
[0124]
[苹果酸] = ((-i(60)^a)-截距)/斜率式中，[苹果酸]是实测苹果酸浓度，i(60)是在传感器上施加0 mv初始电压后60秒的电流，a、截距和斜率是所选的可调参数，用于优化[苹果酸]与已知苹果酸浓度之间的一致性，在校准实验期间使用参考仪器测定所述已知苹果酸浓度（[参考苹果酸]）。在此算法中，包含i(60)的项给定了样品中苹果酸的量度，以及样品特定的非苹果酸相关传感器信号。
[0125]
使用1 m taps缓冲液 750 mm naoh将添加各种浓度苹果酸的3种红葡萄酒稀释10倍，并在试纸条上进行测试。结果如图8所示。
[0126]
对于本领域技术人员显而易见的是，本发明可用于测定饮料中的许多其他电解质。
[0127]
虽然已经参考本发明的某些实施例对本发明进行了特别显示和描述，但是本领域技术人员应理解，这些实施例仅为示例性，而非限制性，并且在不脱离本发明精神和范围的情况下，可以在形式和细节上做出各种变更。因此，本发明的广度和范围不应受到上述任何示例性实施例的限制，而应仅根据权利要求及其等同变换进行定义。除非另有明确说明，否则本文中使用的任何标题仅用于组织目的，而非旨在赋予本文件任何划分或含义。