一种降低阿霉素心脏毒性的抗肿瘤药物

1.本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，尤其是涉及一种降低阿霉素心脏毒性的抗肿瘤药物。


背景技术：

2.恶性肿瘤是严重威胁人类健康及生命的疾病之一，2020年全球新增恶性肿瘤及死亡病例分别达到了1930万例和1000万例。目前化疗是治疗癌症的主要手段之一，但缺乏特异性的化疗药物，在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞造成损伤，对机体产生诸多不良反应，如免疫抑制，神经毒性、心脏毒性，骨髓抑制等，这些严重的不良反应不仅影响药物的疗效，还导致患者的生存质量下降。
3.随着中药的研究深入，越来越多的研究表明中药中的某些成分具有抗肿瘤活性，与化疗药物联用可以增强化疗药物的疗效并降低毒性、细胞耐药性的发生率。
4.银杏叶提取物是从银杏叶中提取的一种天然药物，主要活性成分包括黄酮类、萜烯内酯类，具有抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统等药理作用，不良反应少，临床上被广泛应用于心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病及肿瘤辅助治疗。银杏黄酮苷元(ginkgo flavone aglycone，ga)是贵州大学通过酶水解法将银杏叶提取物中黄酮苷去除糖基后获得的新型提取物，主要成分为槲皮素、山奈酚和异鼠李素。与传统的银杏叶提取物相比，ga具较高的生物活性。
5.化疗药物治疗是现代肿瘤学防控体系的主要治疗手段之一，多柔比星(doxorubicin，dox)，又称阿霉素，是临床一线肿瘤化疗药物，但该药在治疗过程中具有明显的心脏毒性、肾毒性、骨髓抑制等严重的不良反应，其中心脏毒性最多见，且在治疗过程中易产生多药耐药性，已成为临床治疗难以克服的瓶颈。
6.心脏毒性是dox最为严重的不良反应之一，其引发的心脏毒性具有剂量依赖性，最后可导致心力衰竭，一旦发生，病死率可达35％-50％，预后效果不佳。因此，寻求一种既可以增强其抗肿瘤作用，又能减轻其心脏毒性的方式具有十分重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种降低阿霉素心脏毒性的抗肿瘤药物，具有明显的抗肿瘤和降低阿霉素心脏毒性作用，对恶性肿瘤的治疗以及与化疗药物联用具有重要意义。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种降低心脏毒性的抗肿瘤药物，包含银杏黄酮苷元和阿霉素。
9.优选的，银杏黄酮苷元的用量为每天30mg
·
kg-1
。
10.优选的，银杏黄酮苷元与阿霉素用量比为24:1。
11.银杏黄酮苷元和阿霉素的药物用于制备抗肿瘤药物中的应用。
12.因此，本发明采用上述一种降低阿霉素心脏毒性的抗肿瘤药物，具有明显的抗肿瘤和降低阿霉素毒性作用，对恶性肿瘤的治疗以及与化疗药物联用具有重要意义。
13.在肿瘤治疗过程中，dox的多药耐药性主要表现为由p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)所介导，阿霉素与p-gp抑制剂联合用可以增强dox抗肿瘤活性；此外，dox所致的氧化损伤是其产生心脏毒性的主要原因。
14.ga中的槲皮素、山奈酚、异鼠李素可通过阻断细胞周期进程、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等多种途径来发挥抗肿瘤作用，且三者都是p-gp的抑制剂。此外，槲皮素还可通过抑制血管生成和转移等途径来发挥其抗肿瘤作用。
15.其中，槲皮素通过抑制氧化应激和通过14-3-3γ来改善线粒体功能起到保护心肌细胞免受dox损伤；山奈酚通过抑制p53介导的、线粒体依赖的内源性凋亡信号，以及通过参与erk依赖的mapk途径来改善dox所诱导的心脏毒性；异鼠李素通过抑制dox诱导的氧化应激，线粒体凋亡途径和丝裂原活化蛋白激酶通路的激活等途径来改善dox所诱导的心脏毒性。由于，心指数、血清bnp、nt-pro bnp、心脏组织病理学变化以及纤维化程度可反映心功能的变化。研究发现，荷瘤小鼠用dox化疗后，心脏指数明显降低，血清bnp、nt-pro bnp水平明显升高，组织病变及纤维化程度更为严重，ga与dox联用对上述状况有改善。
16.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
17.图1各组h22荷瘤小鼠的体重生长曲线；
18.图2是各组h22荷瘤小鼠的体重变化百分比；
19.图3是ga与dox联用对h22荷瘤小鼠的抑瘤作用中各组肿瘤解剖图；
20.图4是ga与dox联用对h22荷瘤小鼠的抑瘤作用中肿瘤生长曲线；
21.图5是各组h22荷瘤小鼠血清afp水平的柱形图；
22.图6是各组h22荷瘤小鼠肿瘤组织病理学变化和肿瘤细胞凋亡图；
23.图7是ga与dox联用对h22荷瘤小鼠肿瘤组织中cd31表达的影响示意图；
24.图8是各组荷瘤小鼠的心脏指数示意图；
25.图9是各组的h22荷瘤小鼠血清bnp水平和nt-pro bnp的水平示意图；
26.图10是ga与dox联用对荷瘤小鼠心脏组织病理学和心肌纤维化的影响示意图。
具体实施方式
27.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
28.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
29.试验测试
30.一、材料
31.实验动物：spf级雄性icr小鼠(16-20g)，购自苏州西山生物技术有限公司，生产许可证号：scxk(辽)2020-0001。
32.细胞株：h22小鼠肝癌细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
33.药品与试剂：ga由贵州省生化工程中心何珺副教授惠赠；盐酸阿霉素(批号n1111a)购于大连美伦生物技术有限公司；羧甲基纤维素钠(批号no.1028h023)购于北京索莱宝科技有限公司；生理盐水(批号e121041911)购于贵州科伦药业有限公司；甲胎蛋白
(afp)检测试剂盒(批号20210816)购于南京建成科技有限公司；脑钠尿肽(bnp)(批号08/2021)、n端前脑钠素(nt-pro bnp)检测试剂盒(批号08/2021)购于上海酶联生物科技有限公司；水为超纯水。
34.仪器：allegra x-30r离心机(美国beckman coulter)；ims-20全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)；680酶标仪(日本bio-rad)；二氧化碳细胞培养箱(美国thermo公司)；双人超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；el204型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；数显立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司公司医疗仪器厂)；高速冷冻离心机(thermo，美国)。
35.二、细胞培养
36.h22细胞用含10％胎牛血清(fbs)和1％青链霉素的rpmi-1640培养基，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养传代，细胞悬浮生长，每2-3d传代一次，传代2次。收集对数生长期细胞，通过台盼蓝进行染色，细胞存活率需大于95％，使用pbs调整细胞浓度至1
×
107个/ml。
37.三、构建h22荷瘤小鼠模型
38.上述h22细胞悬液经2次腹水传代后，用pbs稀释，制成浓度为2
×
107个/ml的肿瘤细胞悬液。于小鼠右腋皮下接种0.2ml，即2
×
106个/只。之后每天观察肿瘤体积变化，当右腋下有肉眼可见瘤块为模型成功。
39.四、动物分组及给药
40.模型成功后将小鼠随机分为4组(每组6只)：模型对照组、dox组、ga组、ga dox组。模型对照组每日腹腔注射生理盐水2.5ml，dox组在单天(1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d)尾静脉注射dox 2.5mg
·
kg-1
，ga组每日灌胃ga 30mg
·
kg-1
(0.5％cmc-na混悬)，ga dox组每日灌胃ga 30mg
·
kg-1
，期间单天(1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d)尾静脉注射dox 2.5mg
·
kg-1
，连续给药15d。末次给药2h眼球取血后处死小鼠，取肿瘤和心脏组织检测各项指标。
41.其中，涉及到的数据采用graphpad prism 8.0.1软件进行统计分析，p＜0.05代表结果具有显著性差异。
42.(1)ga联合dox对h22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
43.治疗期间，各组小鼠饮食正常，除对照组和dox组小鼠出现精神萎靡情况外，其余各组小鼠精神状况良好。实验期间各组小鼠生长曲线见图1，小鼠的体重变化百分比见图2。与对照组相比，dox组小鼠体重增加缓慢，ga不影响小鼠体重的增加速度，ga dox组小鼠的体重变化百分比介于两者之间。
44.治疗期间，每2d测量一次肿瘤体积(v)，计算公式为：v＝(a
×
b2)
×
0.5。于末次给药2h后眼球取血，处死小鼠，完整剥离肿瘤组织，去除血污和脂肪等非肿瘤组织，称取瘤体质量，计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(c-t)/c
×
100％(式中，c为对照组小鼠的平均瘤体质量，t为各给药小鼠的平均瘤体质量)。使用金氏公式来评估药物联合用药的效果(q)：q＝e(a b)/ea (1-ea)eb，式中ea，eb和e(a b)表示a，b及其组合的抑制率，组合效果可以分为拮抗(q《0.85)，加性(0.85《q《1.15)或协同(q》1.15)。
45.治疗期间，肿瘤生长速度为：对照组＞ga组＞dox组＞ga dox组；经过15d的治疗后，治疗组的肿瘤体积均小于对照组，且各治疗组的肿瘤重量显著低于对照组(均p＜0.0001)；与dox组相比，ga dox组肿瘤重量显著降低(p＜0.01)。dox组、ga组、ga dox组的抑瘤率分别为69.56％、50.24％和89.18％。ga与dox相互作用指数q值为1.41，说明ga与dox联
用在体内表现为协同的抑瘤作用，详见图4和表1。
46.表1ga与dox联用对h22荷瘤小鼠的抑瘤作用(n＝6)
47.组别剂量(mg/kg)肿瘤重量(g)抑瘤率(％)q对照组-2.80
±
0.25
‑‑
dox组2.50.85
±
0.23####69.56-ga组301.40
±
0.27####50.24-ga dox组30 2.50.30
±
0.05####***89.181.41
48.备注：与对照组相比####p＜0.0001；与dox组相比***p＜0.001
49.(2)ga联合dox对h22荷瘤小鼠血清中afp的影响
50.取模型对照组、dox组、ga组、ga dox组小鼠血清适量，采用elisa法测定甲胎蛋白(afp)的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。
51.甲胎蛋白(afp)癌症标志物是一种糖蛋白分子，是目前临床上诊断肝癌的常用血清肿瘤标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。与对照组相比，各治疗组小鼠血清中afp显著降低(均p＜0.05)；与dox组相比，ga dox组小鼠血清中afp水平低，但无显著性差异(p＞0.05)，详见图5。
52.(3)ga联合dox对h22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡及组织病理学的影响
53.取模型对照组、dox组、ga组、ga dox组肿瘤组织适量，在福尔马林溶液中固定72h后，石蜡包埋，脱水，切片。将组织切片进行苏木精-伊红(he)和tunel染色，对肿瘤组织病理改变及肿瘤细胞凋亡凋亡情况进行观察。
54.he染色肿瘤组织病理学检查见图6。对照组肿瘤细胞数量增多，无明显坏死细胞，形态特征明显，呈明显的球形、梭形和大核，表明肿瘤细胞处于快速增殖状态。治疗组肿瘤组织出现不同程度的坏死，表现为坏死面积大，分布不规则，胞核固缩、碎裂，其中ga dox组最明显，说明ga联合dox具有协同抗肿瘤作用。
55.细胞凋亡在肿瘤细胞的形成及发展中起着致关重要的作用。细胞凋亡失衡不仅是肿瘤发生和进展的原因，也是肿瘤对治疗耐药的原因。肿瘤组织tunnel实验结果见图6。与对照组相比，各给药组小鼠肿瘤组织内细胞凋亡率升高(绿色为阳性凋亡细胞)；与dox组相比，ga组无明显差异，但ga dox组小鼠肿瘤组织内细胞凋亡率提高。
56.(4)ga联合dox对h22荷瘤小鼠肿瘤组织中cd31水平的影响
57.取模型对照组、dox组、ga组、ga dox组肿瘤组织适量，石蜡切片，脱蜡，经乙醇梯度水化，抗原修复后，用3％过氧化氢溶液孵育以阻断内源性过氧化物酶；用3％bsa室温孵育以进行血清封闭，加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育50min，pbs清洗3次，以dab试剂显色，经水洗、苏木精复染、脱水、封片后，使用显微镜镜检，并进行图像采集分析。苏木素染细胞核为蓝色，dab显出的阳性表达为棕黄色。
58.血小板-内皮细胞黏附分子(cd31)在血管生成中起到了十分重要的作用，免疫组化检测指标可作为机体血管生成的标志。肝癌作为一种血管依赖性恶性肿瘤，其生长和转移与血管生成密切相关。免疫组织化学结果显示，与对照组相比，各给药组小鼠肿瘤组织中cd31的表达水平降低；与dox组相比，ga dox组cd31的表达水平有所降低，见图7(蓝色为细胞核，箭头所指的棕色为阳性表达)。上述结果表明，ga和dox通过减少肿瘤组织中血管生成而发挥抑瘤的作用；两者联用进一步抑制肿瘤组织中的血管生成，发挥协同的抗肿瘤作用。
59.(5)ga联合dox对h22荷瘤小鼠一般生长状况及心脏功能的影响
60.治疗期间观察小鼠一般生长状况，称量小鼠体重，计算体重变化百分比并绘制体重变化曲线。小鼠体重变化百分比(％)＝(最终体重-最初体重)/最初体重
×
100％。处死小鼠后取出心脏，用生理盐水冲洗后用滤纸吸干并称重，计算小鼠的心脏指数。心脏指数/％＝心脏重量/最终体重
×
100。将心脏组织于4％福尔马林溶液中固定72h后，石蜡包埋，脱水，切片。将组织切片进行he及天狼猩红染色观察心肌病理改变及纤维化情况；检测血清bnp、nt-pro bnp水平。
61.心脏指数是指心脏重量与最终体重的比值，当心脏功能受损时其值会发生变化。与对照组相比，dox组心脏指数明显降低(p＜0.05)；与dox组相比，ga dox组小鼠心指数有一定的提高，见图8。说明dox具有心脏毒性作用，ga与dox联用可降低dox所导致的心脏毒性。
62.bnp和nt-pro bnp由bnp前体(pro bnp)经裂解而产生，当心功能受损时bnp和nt-pro bnp在血清中的水平升高。结果显示，与对照组相比，dox的bnp和nt-pro bnp水平均明显增加(p《0.05)，说明dox具有心脏毒性作用；ga与dox联用具有降低bnp和nt-pro bnp水平的趋势，见图9。
63.小鼠心肌病理学的结果见图10。对照组和ga组小鼠心肌纤维束排列整齐，横纹清晰，胞浆均匀，无空泡化，无明显组织病变；dox组小鼠心肌纤维排列紊乱，横纹消失，胞浆不均匀，出现节段性凝聚及溶解，空泡化严重；ga dox组小鼠心肌排列尚整齐，横纹尚清晰，心肌肌纤维断裂、胞浆空泡化及溶解与dox组相比明显减轻。上述结果表明，ga不会引起心脏组织病变，且ga可改善dox所致的心脏组织病变。
64.心肌纤维化是指多种病理因素导致心脏组织中心肌间质数量占心肌组织比例增加的疾病，是心血管疾病发展到一定阶段的共同表现，最终导致心衰，而天狼星红染色可用于检测心肌组织是否存在纤维化。结果显示，对照组与ga组小鼠心肌纤维排列规则，红染即纤维化染色不明显；dox组小鼠心肌纤维排列紊乱，纤维化(红染)严重；ga dox组小鼠心肌排列较规则，纤维化程度不及dox组明显。上述结果表明，ga不引起心肌纤维化，且ga可改善dox所致的心肌纤维化，见图10。
65.治疗组小鼠体内肿瘤受到了不同程度的抑制，与对照组相比，各治疗组荷瘤小鼠血清中afp水平显著降低，且ga dox组荷瘤小鼠血清中afp较dox组有所降低；当ga与dox联用时，q值为1.41，提示ga与dox单用或联用时都表现出了一定的抑瘤作用，且两者联用时具有协同抗肿瘤作用；癌症是由于较少发生凋亡，从而导致恶性细胞不会死亡的情况之一。因此，增强肿瘤细胞凋亡的治疗策略越来越受到了人们的关注。当ga与dox联用时，增加肿瘤细胞的凋亡。此外，与对照组相比，各治疗组cd31的表达水平明显减少，且ga dox组cd31的表达水平低于dox组，表明ga与dox联用可以提高dox抑制肿瘤血管生成的作用，从而提高dox的抗肿瘤作用。综上，ga可通过抑制肿瘤血管生成、促进细胞凋亡，从而发挥其抗h22的作用，且与dox联用时具有协同h22的作用。
66.因此，本发明采用上述一种降低阿霉素心脏毒性的抗肿瘤药物，具有明显的抗肿瘤和降低阿霉素心脏毒性作用，对恶性肿瘤的治疗以及与化疗药物联用具有重要意义。
67.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。