基因工程细胞及其用途的制作方法

技术特征：
1.一种融合蛋白，其包括通过连接子与β-2-微球蛋白(β2m)肽共价连接的呈递肽，其中所述融合蛋白结合主要组织相容性(mhc)重链以形成mhc复合物，所述mhc复合物结合免疫细胞的抑制性受体以抑制所述免疫细胞，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述免疫细胞的所述抑制性受体是nkg2a。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述免疫细胞的抑制性受体选自由kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1、kir3dl2、kir3dl3和lir1组成的群组。4.根据权利要求1到3中任一项所述的融合蛋白，其中所述mhc重链是经典i类mhc重链、非经典i类mhc重链或mhc样重链。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述mhc重链是经典i类mhc重链，所述经典i类mhc重链选自由hla-a重链、hla-b重链和hla-c重链组成的群组。6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述mhc重链是非经典i类mhc重链，所述非经典i类mhc重链选自由hla-e重链、hla-f重链和hla-g重链组成的群组。7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述mhc重链是mhc样分子重链，所述mhc样分子重链选自由cd1重链、mr1重链、fcrn重链和ul18组成的群组。8.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述mhc重链是hla-e重链。9.一种融合蛋白，其包括通过连接子与β2m肽共价连接的呈递肽，其中所述呈递肽是hla-e限制性呈递肽，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。10.根据权利要求1到9中任一项所述的融合蛋白，其中所述呈递肽源自病毒、原核生物、真核生物或哺乳动物。11.根据权利要求1到9中任一项所述的融合蛋白，其中所述呈递肽源自人。12.根据权利要求1到11中任一项所述的融合蛋白，其中所述呈递肽是i类mhc分子的信号肽或其片段。13.一种融合蛋白，其包括通过连接子与β2m肽共价连接的呈递肽，其中所述呈递肽是i类mhc分子的信号肽或其片段，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。14.根据权利要求1到13中任一项所述的融合蛋白，其中所述呈递肽具有5-30个氨基酸。15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述呈递肽具有7-20个氨基酸。16.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述呈递肽具有8-10个氨基酸。17.根据权利要求12到16中任一项所述的融合蛋白，其中所述呈递肽是i类mhc分子的信号肽或其片段，其中所述i类mhc分子选自由以下各项的重链组成的群组：hla-a1、hla-a2、hla-a*3401、hla-a*80、hla-b7、hla-b*13、hla-b15、hla-cw3、hla-cw*2、hla-cw*0809、hla-cw7、hla-cw*1701、hla-g和hla-f。18.根据权利要求12到17中任一项所述的融合蛋白，其中所述呈递肽的氨基酸序列包括x1x2x3x4x5x6x7x8l；其中x1是v或i；x2是t、a、m或l；x3是a、p、k或n；x4是p、l或t；x5是r、q或k；x6是t或a；x7是l、i、v或p；x8是v、l、i、f或t(seq id no:115)。19.根据权利要求12到17中任一项所述的融合蛋白，其中所述呈递肽的氨基酸序列选
自由seq id nos:21-73组成的群组。20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其中呈递肽的所述氨基酸序列是vmaprtvll(seq id no:38)。21.根据权利要求1到20中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括少于500个氨基酸、少于400个氨基酸、少于300个氨基酸或少于200个氨基酸。22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括约120-180个氨基酸。23.根据权利要求1到22中任一项所述的融合蛋白，其从n端到c端包括所述呈递肽、所述连接子和所述β2m肽。24.根据权利要求1到23中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子的氨基酸序列包括(eaaak)n，其中n＝3、4或5(seq id no:110)，并且其中所述连接子具有5到30个氨基酸。25.根据权利要求1到23中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子的氨基酸序列包括(ggggs)n，其中n＝3、4或5(seq id no:112)，并且其中所述连接子具有5到30个氨基酸。26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述连接子的氨基酸序列是seq id no:1或2。27.根据权利要求1到26中任一项所述的融合蛋白，其中所述β2m肽的氨基酸序列与seq id no:81具有至少85％、至少90％或至少95％的同一性。28.根据权利要求27所述的融合蛋白，其中所述β2m肽的氨基酸序列是seq id no:81。29.根据权利要求1到28中任一项所述的融合蛋白，其由所述呈递肽、所述连接子和所述β2m肽组成。30.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与选自由seq id nos:5和13-18组成的群组中的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％的同一性。31.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列选自由seq id nos:5和13-18组成的群组。32.一种核酸，其对根据权利要求1到31中任一项所述的融合蛋白进行编码。33.一种核酸，其包括(i)对融合蛋白进行编码的第一片段，所述融合蛋白包括通过连接子共价连接的呈递肽和β2m肽，其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链；以及(ii)对合成受体进行编码的第二片段。34.根据权利要求33所述的核酸，其中所述合成受体选自由嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)、tcr受体融合构建体(truc)、t细胞抗原偶联物(tac)、抗体tcr受体(abtcr)和嵌合cd3受体组成的群组。35.根据权利要求33所述的核酸，其中所述合成受体是car。36.根据权利要求33到35中任一项所述的核酸，其中所述合成受体包括特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。37.根据权利要求36所述的核酸，其中所述肿瘤抗原选自由cd19、cd20、cd22、cd30、cd123、cd138、cd33、cd70、bcma、cs1、c-met、il13ra2、egfrviii、cea、her2、gd2、mage、gpc3、间皮素、psma、ror1、egfr、muc1和ny-eso-1组成的群组。38.根据权利要求36所述的核酸，其中所述肿瘤抗原是cd19或bcma。39.根据权利要求33到35中任一项所述的核酸，其中所述合成受体包括特异性结合病毒抗原的抗原结合结构域。
40.根据权利要求39所述的核酸，其中所述病毒抗原是ebv或hpv。41.根据权利要求33到40中任一项所述的核酸，其中所述第一片段和所述第二片段通过对2a肽进行编码的多核苷酸连接。42.根据权利要求41所述的核酸，其中所述2a肽是p2a肽、t2a肽、f2a肽或e2a肽。43.根据权利要求41或42所述的核酸，其从n端到c端对所述合成受体、所述2a肽、所述融合蛋白进行编码。44.根据权利要求33到40中任一项所述的核酸，其中所述第一片段和所述第二片段通过ires序列连接。45.一种载体，其包括根据权利要求32所述的核酸。46.根据权利要求45所述的载体，其是病毒载体。47.根据权利要求46所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。48.一种载体，其包括根据权利要求33到44中任一项所述的核酸。49.根据权利要求48所述的载体，其是病毒载体。50.根据权利要求49所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。51.一种基因工程细胞，其表达根据权利要求1到31所述的融合蛋白。52.一种基因工程细胞，其包括根据权利要求32所述的核酸或根据权利要求45到47中任一项所述的载体。53.一种基因工程细胞，其包括根据权利要求33到44中任一项所述的核酸或根据权利要求48到50中任一项所述的载体。54.根据权利要求51所述的细胞，其进一步表达合成受体。55.根据权利要求52所述的细胞，其进一步包括第二核酸，所述第二核酸对合成受体进行编码。56.根据权利要求54或55所述的细胞，其中所述合成受体选自由car、tcr、truc、tac、abtcr和嵌合cd3受体组成的群组。57.根据权利要求56所述的细胞，其中所述合成受体是car。58.根据权利要求54到57中任一项所述的细胞，其中所述合成受体包括特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。59.根据权利要求58所述的细胞，其中所述肿瘤抗原选自由cd19、cd20、cd22、cd30、cd123、cd138、cd33、cd70、bcma、cs1、c-met、il13ra2、egfrviii、cea、her2、gd2、mage、gpc3、间皮素、psma、ror1、egfr、muc1和ny-eso-1组成的群组。60.根据权利要求59所述的细胞，其中所述肿瘤抗原是cd19或bcma。61.根据权利要求60所述的细胞，其中所述合成受体是car，所述car具有特异性结合cd19或bcma的抗原结合结构域，其中所述car的氨基酸序列选自由seq id nos:74-80和136组成的群组。62.根据权利要求60所述的细胞，其中所述合成受体是tcr，所述tcr具有特异性结合ny-eso-1的抗原结合结构域，其中所述tcr的氨基酸序列是seq id no:132。63.根据权利要求54到57中任一项所述的细胞，其中所述合成受体包括特异性结合病
毒抗原的抗原结合结构域。64.根据权利要求63所述的细胞，其中所述病毒抗原是ebv或hpv。65.根据权利要求51到64中任一项所述的细胞，其中所述融合蛋白与在所述细胞表面上的内源性mhc重链形成复合物。66.根据权利要求51到65中任一项所述的细胞，其中所述细胞缺乏对所述细胞表面上的i类mhc分子或mhc样分子进行编码的至少一个基因的内源性表达。67.根据权利要求66所述的细胞，其中所述细胞缺乏在所述细胞表面上的i类mhc分子的内源性表达，所述i类mhc分子选自由hla-a重链、hla-b重链、hla-c重链、hla-e重链、hla-f重链和hla-g重链组成的群组。68.根据权利要求66所述的细胞，其中所述细胞缺乏在所述细胞表面上的β2m的内源性表达。69.根据权利要求66所述的细胞，其中所述细胞缺乏在所述细胞表面上的mhc样分子的内源性表达，所述mhc样分子选自由cd1重链、mr1重链、fcrn重链和ul18组成的群组。70.根据权利要求51到69中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。71.根据权利要求70所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是白细胞。72.根据权利要求71所述的免疫细胞，其中所述白细胞选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、浆细胞、树突状细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞组成的群组。73.根据权利要求72所述的免疫细胞，其中所述白细胞是nk细胞。74.根据权利要求72所述的免疫细胞，其中所述白细胞是t细胞。75.根据权利要求74所述的免疫细胞，其中对tcr复合物的组分进行编码的至少一个基因在所述t细胞中被灭活。76.一种药物组合物，其具有根据权利要求51到75中任一项所述的细胞和药学上可接受的载体。77.一种根据权利要求51到76中任一项所述的细胞在同种异体移植中的用途。78.一种根据权利要求53到76中任一项所述的细胞在癌症治疗中的用途。79.一种根据权利要求53到76中任一项所述的细胞在制备用于治疗癌症的药物的用途。80.一种细胞在同种异体移植中的用途，其中所述细胞包括对融合蛋白进行编码的核酸，所述融合蛋白包括通过连接子共价连接的呈递肽和β2m肽，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。81.一种细胞在同种异体移植中的用途，其中所述细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包括通过连接子共价连接的呈递肽和β2m肽，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。82.一种治疗需要同种异体移植的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求51到76中任一项所述的细胞。83.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求53到76中任一项所述的细胞。84.一种治疗需要同种异体移植的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细胞，其中所述细胞包括对融合蛋白进行编码的核酸，所述融合蛋白包括通过连接
子共价连接的呈递肽和β2m肽，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。85.一种治疗需要同种异体移植的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细胞，其中所述细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白包括通过连接子共价连接的呈递肽和β2m肽，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。86.一种对细胞进行基因工程改造以用于同种异体移植的方法，所述方法包括用对融合蛋白进行编码的核酸转导所述细胞，其中所述融合蛋白包括通过连接子共价连接的呈递肽和β2m肽，并且其中所述融合蛋白(1)包括少于500个氨基酸，或者(2)缺乏hla-e重链。87.一种对细胞进行基因工程改造以用于同种异体移植的方法，所述方法包括用根据权利要求32到44中任一项所述的核酸转导所述细胞。88.一种对细胞进行基因工程改造以用于同种异体移植的方法，所述方法包括用根据权利要求45到50中任一项所述的载体转导所述细胞。89.根据权利要求86到88中任一项所述的方法，其进一步包括：使所述细胞中对i类mhc分子或mhc样分子进行编码的至少一个基因灭活。90.根据权利要求89所述的方法，其中所述灭活基因对i类mhc分子进行编码，所述i类mhc分子选自由hla-a重链、hla-b重链、hla-c重链、hla-e重链、hla-f重链和hla-g重链组成的群组。91.根据权利要求89所述的方法，其中所述灭活基因对β2m进行编码。92.根据权利要求89所述的方法，其中所述灭活基因对mhc样分子进行编码，所述mhc样分子选自由cd1重链、mr1重链、fcrn重链和ul18组成的群组。93.根据权利要求89到92中任一项所述的方法，其中所述基因通过dna剪切、dna剪切和修复、碱基编辑、引物编辑、rna干扰或rna编辑灭活。94.根据权利要求93所述的方法，其中所述基因通过dna剪切灭活，所述dna剪切使用稀有核酸内切酶，所述稀有核酸内切酶选自由rna定向核酸内切酶、tal核酸酶、归巢核酸酶、锌指核酸酶和mega-tal核酸酶组成的群组。95.根据权利要求93所述的方法，其中所述基因通过dna剪切和修复灭活。96.根据权利要求93所述的方法，其中所述基因通过使用crispr-cas系统灭活。97.根据权利要求96所述的方法，其中所述crispr-cas系统是cr1spr-cas9系统。98.根据权利要求86到97中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。99.根据权利要求98所述的方法，其中所述免疫细胞选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、浆细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞组成的群组。100.一种治疗需要同种异体移植的受试者的方法，所述方法包括根据权利要求86到99中任一项制备基因工程细胞，并将所述经工程改造的细胞施用于所述受试者。

技术总结
本发明公开了具有β2M多肽和呈递肽的融合蛋白，以及对此类融合蛋白进行编码的核酸。本发明还提供了表达此类融合蛋白的基因工程细胞、其制备方法以及其在同种异体移植中的用途。本发明还公开了表达本发明所公开的融合蛋白的CAR-T细胞及其在癌症治疗中的用途。T细胞及其在癌症治疗中的用途。T细胞及其在癌症治疗中的用途。


技术研发人员：黄倬 林彦妮 郑小翠 孔红梅 王文博 冯爱华
受保护的技术使用者：苏州克睿基因生物科技有限公司
技术研发日：2020.08.10
技术公布日：2022/5/6