一种治疗阿尔兹海默病的中药组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种治疗阿尔兹海默病的中药组合物及其应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,ad)是一种常见的神经退行性疾病。早期临床表现为短期记忆的缺失，随着病情的发展可出现语言障碍，方向感缺失，运动和神经障碍等，严重影响老年人的健康和生活质量。随着人口老龄化的日益加剧，全球约有4600万人因其缺乏有效的治疗而受累。除此之外，该病目前的致病机制尚不清楚也是造成患者数量庞大的一个重要原因。因此，深入研究ad的致病机理并研发安全有效的防治药物或策略仍是该领域亟待解决的问题。越来越多的证据表明，沉积的淀粉样蛋白-β(aβ)斑块(aβ生产过剩和/或aβ清除障碍)和神经原纤维缠结(tau蛋白过度磷酸化所致)是导致突触功能障碍、神经损失、认知功能下降的两个主要的原因。此外，代谢紊乱和神经炎症是ad的重要病理特征。在过去的几十年中，很多针对aβ、tau、神经炎症或其他ad相关病理的药物未能阻止或延迟ad进展，这表明单一靶点的治疗对于复杂性病理机制的ad来说可能杯水车薪。因此，从整体来看，多靶点药物可能是治疗ad的另一种选择。
3.中医药治疗疾病已经有几千年的历史，中药“多成分-多靶点”的特点在治疗复杂疾病的过程中普遍优于单靶点药物。许多中药复方在神经退行性疾病的预防和治疗方面取得了很大的进展，包括提高学习记忆能力、调节代谢功能障碍、抑制神经炎症、降低氧化应激和抗衰老(如抗aβ聚集、抗tau蛋白过度磷酸化、抗氧化应激等)、抗神经元凋亡。ad俗称老年痴呆，在中医经典中最早被记载成“言善误”、“好忘”、“健忘”和“喜忘”等病名。自明清时期关于“痴呆”的病因、病机、病状、治法及预后逐渐被认识。目前普遍认为，ad为主要由于肾精亏虚、髓海失充，或由于痰浊上蒙、瘀血阻络等因素渐使脑髓空虚、元神失养、神机失用而为病。《辨证录
·
呆病门》中提出：“痰积于脑中，盘踞于心外，使神明不清而成呆病矣。”强调了痰与呆病的关系。痰浊是津液代谢失常的病理产物，痴呆患者脏腑功能虚弱、肾气亏虚，不能温煦气化津液，聚而成痰；或肾精亏虚，阴虚火动，灼津为痰。痰浊壅塞、蒙闭经脉、脑窍，清阳不升，神明失用，神识不清，从而发为呆病。
4.因此，目前仍需要一种有效治疗阿尔兹海默病的中药组合物，同时对该中药在治疗阿尔兹海默病的分子机理进行更加深入的探究，为中药在阿尔兹海默病的治疗提供理论基础。
5.背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的问题，本发明从通过祛除病理因素“痰”出发，设计了一种中药组合物，从而显著改善ad的病情进展。本发明人经大量研究、试验发现中药组合物，以特定中药原料进行科学配伍后，可以显著改善ad模型小鼠的临床症状和病理症状，同
时本发明进一步对其分子机理进行了深入研究，发现本发明的组合物能够有效抑制小胶质细胞活化，从而有效治疗阿尔兹海默症。本发明的目的在于提供一种用于治疗ad的中药组合物。具体地，本发明包括以下内容。
7.本发明的第一方面，提供一种治疗阿尔兹海默病的中药组合物，其包括下述组分：胆南星、黄连、黄芩、清半夏、天麻、石菖蒲、干姜和炙甘草。
8.根据本发明所述的治疗阿尔兹海默病的中药组合物，优选地，由下述组分组成：10-20重量份的胆南星、1-10重量份的黄连、5-15重量份的黄芩、5-15重量份的清半夏、5-15重量份的天麻、5-15重量份的石菖蒲、5-15重量份的干姜和1-10重量份的炙甘草。
9.本发明的第二方面，提供根据第一方面所述的中药组合物在制备用于治疗阿尔兹海默病的药物中的用途。
10.本发明的第三方面，提供根据第一方面所述的中药组合物在制备用于预防阿尔兹海默病发生的药物中的用途。
11.本发明的第四方面，提供根据第一方面所述的中药组合物在制备用于改善阿尔兹海默病患者学习记忆能力的药物中的用途。
12.本发明的第五方面，提供根据第一方面所述的中药组合物在制备用于改善阿尔兹海默病患者淀粉样斑块沉积的药物中的用途。
13.根据第五方面所述的用途，优选地，所述中药组合物能够降低在皮层、海马dg区和海马ca1区的aβ斑块数量。
14.本发明的第六方面，提供根据第一方面所述的中药组合物在制备用于改善阿尔兹海默病患者脑内炎症水平的药物中的用途。
15.根据本发明所述的用途，优选地，所述药物组合物通过抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的异常激活，从而改善炎症水平。
16.根据本发明所述的用途，优选地，所述改善是指抑制炎症水平。
17.本发明的第七方面，提供用于治疗阿尔兹海默病和/预防阿尔兹海默病发生的方法，其包括向有需要的受试者和/患者施用治疗有效量的药物的步骤，其中所述药物包括根据第一方面所述的中药组合物。
18.本发明人发现以上诸药，君臣佐使共用，开窍化痰，标本兼治，对ad的治疗效果显著。发明人在中医研究和临床实践中，将所述药物用于ad的治疗，在不偏离中药组合物的组方原理的基础上，所述中药组合物中各味药材的用量可进行适量的调整，也可取得显著的治疗效果。同时本发明的中药组合物在研究中未见到任何毒副作用。
附图说明
19.图1ntq改善ad模型小鼠空间学习记忆能力。a.5
×
fad小鼠口服ntq的时间轴示意图。b.不同组别小鼠在喂药期间的体重变化。c.不同组别小鼠在水迷宫学习训练过程中逃避至隐藏平台的潜伏期曲线图(two-way anova，*p《0.05)。d.不同组别小鼠在水迷宫测试中穿越隐藏平台所在位置的次数(one-way anova，**p《0.01)。e.不同组别小鼠在水迷宫测试中逃至隐藏平台所用的时间(one-way anova，**p《0.01)。f.不同组别小鼠在水迷宫测试中运动平均速度(one-way anova，**p《0.01)。g.不同组别小鼠在水迷宫测试中运动轨迹典型图。其中，在图d、e、f中，各柱状图自左向右分别代表：wt、5
×
fad、5
×
fad ntq(5g/kg)、5
×
fad ntq(50g/kg)、5
×
fad memantine(10mg/kg)。
20.图2ntq改善ad模型小鼠短期记忆能力。a.新物体识别实验流程示意图。b.新物体识别实验检测结果(n＝12；student t-test，*p《0.05)。c.新物体实验运动轨迹典型图。
21.图3ntq改善ad模型小鼠病理症状。a-b.硫黄素s染色典型图和不同脑区放大图。c-h.aβ斑块数量在皮层、海马dg区和海马ca1区的定量统计结果(n＝5-10张脑片，one-way anova，**p《0.01，***p《0.001,***p《0.0001)。其中，在图c-h中，各柱状图自左向右分别代表：5
×
fad、5
×
fad ntq(5g/kg)、5
×
fad ntq(50g/kg)、5
×
fad memantine(10mg/kg)。
22.图4ntq改善ad模型小鼠脑内神经炎症。a.海马dg区不同组别ts染色、gfap(星型胶质细胞)和iba1(小胶质细胞)免疫荧光染色典型图。b.前额叶皮层区(pfc)不同组别ts染色、gfap(星型胶质细胞)和iba1(小胶质细胞)免疫荧光染色典型图。c-d gfap阳性的星形胶质细胞在海马dg和pfc的数量统计结果(n＝5-10张脑片每组，one-way anova，***p《0.001，***p《0.0001)。e-f iba1阳性的星形胶质细胞在海马dg和pfc的数量统计结果(n＝5-10张脑片每组，one-way anova，***p《0.001，***p《0.0001)。其中，在图c-f中，各柱状图自左向右分别代表：wt、5
×
fad、5
×
fad ntq(5g/kg)、5
×
fad ntq(50g/kg)、5
×
fad memantine(10mg/kg)。
具体实施方式
23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
26.本领域技术人员可通过已知手段对本发明中药成分中的有效活性成分进行测定，测定方法包括高效液相色谱法(hplc)、质谱法(ms)或气相色谱-质谱联用(gc-ms)法。其中所述活性成分包括齐墩果酸、小襞碱、表小襞碱、黄连碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩、肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸、芩黄素、天麻素、6-姜辣素、甘草苷。
27.本发明中，术语“阿尔兹海默病(症)”，又称为“老年痴呆症(ad)”是指一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。
28.本发明提供一种用于祛除病理因素“痰”的中药组合物，因此，本发明的中药组合物有时也称为“中药组合物-脑痰清(ntq)”。
29.[中药组合物-脑痰清]
[0030]
发明人通过前期研究发现“虚”、“痰”、“瘀”相互为患是老年痴呆的主要病理基础。病位在脑，与心、肝、脾、肾密切相关。老年人肾气虚衰，气不化津，水无所主；思虑过度，或饮食不节，或情志不舒，肝郁气滞，肝气犯脾，损伤脾胃，脾失健运，聚湿生痰，痰迷心窍，心神错乱而发为痴呆；或痰浊阻遏清窍，脑髓失养而发为痴呆。可见痰浊蒙窍与本病的发生密切相关。该病以痰为病理基础，是为五脏六腑功能失调而痰渐生。痰蒙清窍，热蕴脑府，痰热互结，神机失用而为病。痰浊凝聚，脑窍昏蒙，治宜化痰开窍，使痰去窍开，清阳得升，脑窍得养；火热蕴结，神机失用，治宜清热泻火，使火热得泻，脑窍得清，神机得用；治宜清热泻火。清
·
陈士铎在《辨证录
·
呆病门》“痰气独盛，呆气最深”，《石室秘录
·
痴呆》又言“治呆无奇法，治痰即治呆也”。因此，发明人按照“化痰开窍”的思路进行组方，得到本发明的中药组合物。
[0031]
本发明的中药组合物由下述中药原料和可选的药用辅料组成，其中所述中药原料含有特定的活性成分。具体如下：
[0032]
胆南星味苦、微辛，凉。归肺、肝、脾经，通常用于痰热咳嗽，中风痰迷，癫狂惊痫等疾病的组方中。本发明的中药组合物以胆南星作为君药用于治疗痰浊蒙窍ad，因其清热化痰从病因病机上消除ad病理因素。火热炽盛，上扰神明，内生之痰首责于中焦脾土，黄连、黄芩苦寒，泻中焦火热。清半夏辛，温。归脾、胃、肺经，可有燥湿化痰之功，以上共祛痰。天麻甘，平。归肝经，息风止痉，平抑肝阳，祛风通络。石菖蒲辛、苦，温。归心、胃经。豁痰开窍，醒神益智。辛苦而温，芳香而散，开心孔，利九窍。老年多虚，干姜辛，热。归脾、胃、肾、心、肺经。以上共同佐助苦寒清泻，豁痰利窍。加之炙甘草甘，平。归心、肺、脾、胃经，药性和缓，升降合宜，浮沉得当，可缓和诸药之性，调和诸药之功。
[0033]
以上诸药，君臣佐使共用，开窍化痰，标本兼治，对ad的治疗效果显著。发明人在中医研究和临床实践中，将所述药物用于ad的治疗，在不偏离中药组合物组方的原理的基础上，所述中药组合物中各味药材的用量可进行适量的调整，也可取得显著的治疗效果。目前该中药组合物在研究中尚未见到任何毒副作用。
[0034]
本发明的中药组合物优选由下述组分组成：10-20重量份的胆南星、1-10重量份的黄连、5-15重量份的黄芩、5-15重量份的清半夏、5-15重量份的天麻、5-15重量份的石菖蒲、5-15重量份的干姜和1-10重量份的炙甘草。还优选为由12-18重量份的胆南星、2-8重量份的黄连、5-12重量份的黄芩、6-12重量份的清半夏、6-12重量份的天麻、6-12重量份的石菖蒲、6-12重量份的干姜和2-8重量份的炙甘草组成。进一步优选为由13-17重量份的胆南星、3-8重量份的黄连、5-10重量份的黄芩、8-12重量份的清半夏、8-12重量份的天麻、6-10重量份的石菖蒲、6-10重量份的干姜和4-8重量份的炙甘草组成。
[0035]
在具体实施方案中，本发明的中药组合物-脑痰清(ntq)由胆南星15g，黄连6g，黄芩8g，清半夏10g，天麻10g，石菖蒲8g，干姜8g，炙甘草6g组成。
[0036]
需要说明的是，本发明中药组分过多或过少均影响治疗阿尔兹海默症的效果，并且特定的上述原料配比具有理想的协同效果。
[0037]
药用辅料不特别限定，只要能够用于添加而形成有效、稳定和安全的制剂均可用于本发明的组合物。本发明的中药组合物，其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、
硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。
[0038]
本发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
[0039]
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
[0040]
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
[0041]
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
[0042]
本发明的中药组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素c、edta二钠、edta钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
[0043]
用途
[0044]
一方面，本发明提供上述中药组合物的多种用途。在另一方面中，提供使用包含述中药组合物的药物或试剂盒来预防、抑制、降低所述阿尔兹海默病的严重程度或治疗所述阿尔兹海默病的方法。
[0045]
除非另有说明，本文所用术语“受试者”和“患者”在本文中互换地用于指可能需要本文描述的中药组合物或药物治疗和/或预防的任何动物。受试者和患者因此包括但不限于：灵长类动物(包括人类)、犬科动物、猫科动物、鼠和其它哺乳动物受试者。优选地，所述患者是人类。
[0046]
在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如自身免疫性疾病的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延
长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
[0047]
本文所用术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。通常，本文中的有效量根据各种因素而变化，所述因素例如给定的药物或化合物、药学制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者等等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。本发明的中药组合物或其药物的有效量可以由本领域技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。
[0048]
优选地，本发明的中药组合物能够降低或减少在皮层、海马dg区和海马ca1区的aβ斑块数量。还优选地，本发明的中药组合物能够降低或减少相关基因app和ps1突变所介导的阿尔兹海默氏症的皮层、海马dg区和海马ca1区的aβ斑块数量。
[0049]
优选地，本发明的中药组合物能够抑制/降低/减少相关基因app和ps1的突变所介导阿尔兹海默氏症的pfc和海马组织中激活的星形胶质和小胶质细胞数量。
[0050]
实施例1
[0051]
本实施例的中药组合物信息见表1和图1。
[0052]
表1：中药组合物的性味归经、功能主治、主要成分信息
[0053][0054]
备注：参考《中华人民共和国药典》2020版。
[0055]
实施例2
[0056]
本实施例用于研究ntq对5
×
fad小鼠认知功能下降的影响。
[0057]
取5
×
fad小鼠48只，随机分为4组，分别为5
×
fad对照组、5
×
fad ntq(50g/kg)、5
×
fad ntq(5g/kg)和5
×
fad memantine(10mg/kg)；wt(c57bl/6j)小鼠12只(5
×
fad小鼠为c57bl/6和sjl杂交背景，其它spf级c57bl/6j小鼠购于斯贝福公司)。所有小鼠饲养于23℃，12h昼夜周期节律，水和粮食自由获取的动物房中。在5
×
fad小鼠75天时给药，连续90天按0.1ml/10g给药体积灌胃给药，连续90天后进行水迷宫实验、y迷宫和新物体识别。
[0058]
水迷宫是检测动物空间学习记忆能力的经典实验方法。水迷宫主要由一个圆形不锈钢水池构成，其直径为120cm，逃生平台直径为10cm，注入水之后，添加钛白粉或牛奶使水不透明，并将平台隐藏在水面下1cm(固定在人为划分好的四个象限的其中一个中间)。水池深60cm，其边缘设定四个小鼠入水起始点(东、西、南、北)，并在壁上贴不同形状和颜色的物体给小鼠空间定位提供视觉线索。每天实验开始前，将小鼠提前放到行为学屋，适应1h后再开始实验。实验过程中，水温保持在22
±
1℃，整个实验过程中平台位置、视觉线索位置等均保持不变。实验中小鼠放入水池后，连接于电脑摄像头开始记录下小鼠在水迷宫中寻找隐藏平台的游泳潜伏期、路程及路径。小鼠每天训练2-4次，每次1min，对于找到平台的小鼠，让其待在平台上30s后拿出迷宫，休息两个小时后再进行下次训练；对于找不到平台的小鼠，将其引导到平台上，同样在平台上待30s后拿出，休息两个小时后再进行下次训练。根据小鼠的训练情况，连续训练6天左右，并在最后一次训练结束24h后检测小鼠的记忆能力(平台拿走，让小鼠在迷宫中自由探索1min，记录分析小鼠穿越平台所在位置的次数、待在平台所在象限的时间等)。
[0059]
实验结果：学习认知功能是临床上检测ad患者病情的重要指标，也是评价治疗药物对ad是否有效的重要方法。5
×
fad是一种急性的ad模型小鼠，2-3个月开始出现病理变化，4-5个月出现学习认知功能障碍。为检测ntq对急性的ad模型小鼠是否也有效，本实施例在5
×
fad小鼠2.5月龄时，以口服给药的方式连续给药3个月，在小鼠5.5月龄时用水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力，在小鼠6.5月龄时检测病理情况(图1a)。结果显示，经过口服给药，各组的小鼠的体重未发生显著差异的变化(图1b)。在水迷宫的学习训练过程中，给予ntq的5
×
fad小鼠逃避至隐藏平台的潜伏期明显变短，表现出较5
×
fad对照小鼠更好的学习能力(图1c)。而在水迷宫实验测试阶段，给予ntq的5
×
fad小鼠与5
×
fad对照小鼠相比，穿越平台所在位置的次数更多，待在平台所在象限的时间更长，而小鼠们的运动速度都无明显变化(图1d-f)，说明给予ntq的5
×
fad小鼠具有更好的记忆能力。这些结果表明，ntq可以改善5
×
fad小鼠的空间学习记忆功能。
[0060]
新物体识别实验作为一种检测动物认知功能的重要方法，其原理是利用小鼠对新鲜事物的天然偏好性。该行为学实验由一个50
×
50
×
20cm的矩形装置构成，需要4天。第1-3天为适应环境阶段，即在前3天，把每只实验小鼠放入空的矩形箱中，让其自由探索5min，结束后拿出小鼠，并用75％乙醇擦拭箱子，去除异味，再进行下一只小鼠实验。第四天为物体识别实验，首先将两个一模一样的物体放在矩形箱中，并用双面胶固定好，将小鼠放入装置中自由探索5min，结束后将小鼠拿出，用75％乙醇擦拭箱子，去除异味。1h后，将其中任意一个物体换成新的物体，并将小鼠再次放入装置中，自由探索5min。实验过程中，用摄像头和行为学分析系统记录小鼠探索每个物体的时间。
[0061]
实验结果：连续给药3.5个月后，用新物体识别实验检测小鼠的认知功能。在做新物体识别检测前，先将小鼠放入实验环境中适应3天，每天5min，第四天检测(图2a)。结果显示，给ntq后的5
×
fad小鼠对新鲜物体具有明显偏好性，呈现出与wt小鼠相当的认知功能，而5
×
fad对照小鼠对新鲜物体则无明显偏好性(图2b-c)，提示ntq的干预可以恢复ad小鼠的短期记忆功能。
[0062]
实施例3
[0063]
本实施例用于研究ntq对5
×
fad小鼠aβ斑块的影响。
[0064]
上述实验在小鼠6.5月龄时心脏灌流处死取脑组织，4％pfa固定的脑组织用30％蔗糖脱水后(中间换一次蔗糖溶液，脑组织沉至管底即可)，冰冻切片机将脑子切成40μm的冠状切片，放入1
×
pbs中。对于长期保存的脑片，将pbs换成脑片防冻液，于-20℃保存。
[0065]
硫黄素s染色(ts)是一种特异性结合aβ斑块的染料。脑片用0.002％ts(溶于50％的乙醇)避光染色8min，50％的乙醇洗2次，pbs洗3次。为了了解ntq是否会影响ad小鼠aβ斑块的沉积。通过ts染色我们发现，给予ntq的5
×
fad小鼠，无论是在皮层区，还是海马区，aβ斑块数量都比5
×
fad对照组小鼠显著减少(图3a-h)。
[0066]
实施例4
[0067]
本实施例用于研究ntq对5
×
fad小鼠神经炎症的影响。
[0068]
慢性神经炎症伴随着ad发生发展各个阶段，星形胶质细胞和小胶质细胞的异常激活是其中的一个特征。前面结果中证明了ntq可以显著减少ad小鼠脑中的aβ沉积，为了探究ntq是否减轻星形胶质细胞和小胶质细胞的异常激活，本发明用免疫荧光染色的方法，分别检测星形胶质细胞的形态和数量。取上述实验小鼠-20℃保存的脑片用0.002％ts(溶于50％的乙醇)避光染色8min，50％的乙醇洗2次，pbs洗3次。封闭后，脑片与其它抗体标记。首先用3％h2o2处理15min，抑制内源性过氧化物酶活性。pbs洗3次，每次5min，封闭液(含0.3％tritonx-100，5％羊血清和2％bsa的pbs)室温封闭1-2h，封闭后加入相应的一抗(gfap和iba1)，4℃孵育过夜，并用对应属性荧光素偶联的二抗标记，dapi或hoechst染色后，贴片并加入抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦拍片。
[0069]
实验结果：图4a-b示出了硫黄素s染色典型图和不同脑区放大图。c-h.aβ斑块数量在皮层、海马dg区和海马ca1区的定量统计结果(n＝5-10张脑片，one-way anova，**p《0.01，***p《0.001,***p《0.0001)。ntq可以显著减少5
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fad小鼠pfc和海马组织中激活的星形胶质和小胶质细胞数量(图4a-f)，这些结果表明，ntq可以抑制ad小鼠神经炎症通过抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的异常激活。
[0070]
尽管已经参考示例性实施方案对本发明进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对示例性实施方案做多种调整或变化。本发明的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。