一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法

技术特征：
1.一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，以谷氨酸、谷氨酸钠或谷氨酰胺为底物，酶法制备γ-聚谷氨酸，所述酶法制备γ-聚谷氨酸的方式包括：联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的重组载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；所述联用生物酶的氨基酸序列含有：1)seq id no.1、seq id no.2所示的氨基酸序列；或者，2)在seq id no.1限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化谷氨酸或谷氨酸钠通过γ-酰胺键聚合成γ-pga活性的聚谷氨酸合成酶的氨基酸序列；或者谷氨酰胺转移酶的氨基酸序列；或者，3)在seq id no.2限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化atp再生活力的多聚磷酸激酶ppk；或者，4)能用于催化atp再生的乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶的氨基酸序列，其中，乙酸激酶蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示，肌酸激酶蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示。2.根据权利要求1所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，所述方法合成γ-pga的底物为谷氨酸、谷氨酸钠或谷氨酰胺；所述方法利用的生物酶为如下(1)至(8)中任意一组或多组的生物酶：(1)聚谷氨酸合成酶和多聚磷酸激酶ppk；(2)聚谷氨酸合成酶和乙酸激酶；(3)聚谷氨酸合成酶和丙酮酸激酶；(4)聚谷氨酸合成酶和肌酸激酶；(5)谷氨酰胺转移酶和多聚磷酸激酶ppk；(6)谷氨酰胺转移酶和乙酸激酶；(7)谷氨酰胺转移酶和丙酮酸激酶；(8)谷氨酰胺转移酶和肌酸激酶。3.根据权利要求1或2所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，所述制备方法中的酶存在、利用形式包括如下(1)至(6)中任意一种：(1)权利要求2中所述生物酶的任何一种组合；(2)编码权利要求2中以下生物酶的基因：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；(3)含有权利要求2中以下生物酶的基因：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；(4)含有权利要求2中以下生物酶的基因的表达载体或克隆载体：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；(5)含有权利要求2中以下生物酶的基因的转基因细胞系：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；(6)含有权利要求2中以下生物酶的基因的基因工程菌：(聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶。4.根据权利要求1所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其
特征在于，所述联用生物酶选择为聚谷氨酸合成酶pgsb和多聚磷酸激酶ppk，其中，聚谷氨酸合成酶pgsb具有如seq id no.1所示的蛋白质序列，多聚磷酸激酶ppk2具有如seq id no.2所示的蛋白质序列。5.根据权利要求1所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：(a)获得过表达pgsb基因的一号重组菌，所述pgsb基因表达聚谷氨酸合成酶；(b)获得过表达ppk2基因的二号重组菌，所述ppk2基因表达多聚磷酸激酶；(c)将步骤(a)得到的一号重组菌和步骤(b)得到的二号重组菌混合，获得混菌细胞，再催化含谷氨酸和/或谷氨酸盐的底物合成γ-聚谷氨酸。6.根据权利要求5所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述聚谷氨酸合成酶的基因pgsb来源于枯草杆菌属，其氨基酸序列为：如seq id no.1所示的氨基酸序列；或，在seq id no.1限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化谷氨酸或谷氨酸钠通过γ-酰胺键聚合成γ-pga活性的聚谷氨酸合成酶的氨基酸序列。7.根据权利要求5所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，步骤(b)中编码聚磷酸激酶的ppk2基因来源于红假单胞菌属或异常球菌属；其氨基酸序列为：如seq id no.2所示的氨基酸序列；或，在seq id no.2限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化atp再生活力的多聚磷酸激酶ppk。8.根据权利要求5所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，步骤(c)中，一号重组菌和二号重组菌的重量比为8：1～2：1。9.根据权利要求5所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，步骤(c)中，混菌细胞在16-37℃，ph为6-8的条件下，孵育3-12h直接催化合成γ-聚谷氨酸。10.根据权利要求5所述的一种耦合atp再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-pga制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述催化合成的底物为谷氨酸和/或谷氨酸盐、镁离子、单磷酸腺苷和多聚磷酸盐的混合物。

技术总结
本发明涉及一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，具体为以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，酶法制备聚谷氨酸(γ-PGA)的方法，属于生物工程技术领域。该方法包括联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；优选联用聚谷氨酸合成酶PgsB和多聚磷酸激酶PPK。与现有技术相比，本发明方法技术路线简洁，方法所涉及的底物来源充足，反应专一性高、速率快，底物转化效率高，体系中杂质少易于下游分离纯化，γ-PGA生产成本与现有发酵制备法相当，具有较大的工业应用潜力。具有较大的工业应用潜力。具有较大的工业应用潜力。


技术研发人员：赵黎明 范立强
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/5/5