樟脑磺酸及其与阳离子赋形剂的组合作为高浓缩蛋白质制剂中的降粘剂的制作方法

1.本发明涉及显示降低的粘度的高度浓缩蛋白质制剂的组合物，所述降低的粘度是由添加至少樟脑磺酸引起的。在所制备的制剂中所含的蛋白质针对聚集和变性是稳定的，并因此在施用于患者之前具有足够的储存稳定性。


背景技术：

2.大多数研发中的生物治疗性蛋白质产品为单克隆抗体(mab)或相关形式，例如双特异性抗体或抗体片段。在广泛的临床重要适应症中，此类产品的治疗剂量通常很高。
3.但是，肽和蛋白质分子比传统的有机和无机药物分子更大和更复杂(即，除了具有复杂的三维结构外，它们还具有多个官能团)，对于配制者来说，此类蛋白质制剂存在特定问题。这些问题之一是蛋白质制剂的粘度增加，尤其是在高浓度下。
4.然而，后者是一个特殊的问题，因为从患者便利性、依从性和整体医疗保健成本的角度来看，非常需要通过小剂量皮下注射来输送所得产品。
5.但是，高治疗剂量和高度期望的低注射体积的组合常常导致需要非常高度浓缩的活性成分制剂。众所周知，在高浓度下获得稳定的生物治疗剂水性制剂可能极具挑战性，通常会导致聚集速率、颗粒形成和粘度显著增加。因为高粘度极大地限制了产品的可注射性，因此高粘度是不可接受的。
6.抗体和其他蛋白质治疗剂可以肠胃外施用，例如通过静脉内(iv)，肌内(im)或皮下(sc)途径。皮下注射由于其简化患者施用(快速，小体积注射)和降低治疗成本(缩短医疗救助)的潜力，已越来越受到蛋白质治疗剂递送的关注。为了确保患者依从性，期望皮下注射剂型是等渗的并且包括小注射体积(每个注射部位《2.0ml)。为了减少注射体积，通常在1mg/ml至150mg/ml的范围内施用蛋白质。
7.因此，用于皮下施用的蛋白质制剂的主要开发通常与粘度挑战相关。体积限制(《2ml)和剂量要求(通常》100mg施用)经常需要高度浓缩的蛋白质制剂。但是，正如已经说过的，在高浓度下，蛋白质往往会形成高粘度溶液，并且由于形成可溶性和不溶性蛋白质-蛋白质聚集体，稳定性可能会成问题。因此，这样的粘度对于a)制造过程和b)对患者施用造成严重的挑战。
8.在制造过程中，高粘度的高度浓缩蛋白质制剂在加工中存在困难，特别是在超滤和无菌过滤方面。此外，增加的粘度导致对蛋白质的剪切应力增加，这经常导致产品损失。
9.基于mab的疗法通常会在很长一段时间内重复施用，并且需要每千克几毫克(mg/kg)的剂量。抗体溶液或悬浮液可以经由肠胃外途径施用，例如通过静脉内(iv)输注，以及皮下(sc)或肌内(im)注射。此处，在注射溶液中，高粘度是一个问题。为了解决该问题并改进溶液的稳定性，通常还添加较高浓度的添加剂和赋形剂。在对于旨在用于肌内或皮下施用的制剂所期望的蛋白质浓度，需要高浓度的稳定剂，例如蔗糖和氯化钠，以实现长期的蛋白质稳定性。由于高的注射力和组织损伤，所得的溶液常常引起注射疼痛。因此，对于高蛋
白浓度制剂的稳定性和渗透压而言，平衡所需稳定剂的量至关重要。
10.结果，归因于粘度的技术障碍常常导致无法开发用于皮下递送的蛋白质制剂。
11.为了提高皮下制剂开发的成功率，近年来通过化学方法降低和控制粘度已引起相当大的关注。
12.大量出版物和专利申请涉及来自盐(主要是nacl)家族和特殊氨基酸(优选精氨酸、组氨酸和脯氨酸)的赋形剂，这些赋形剂已显示出可有效降低某些高浓度蛋白质治疗剂的粘度。
13.不幸的是，这些众所周知的降低粘度的方法并非普遍适用，这可能是因为这样一个事实：蛋白质制剂的粘度是各种分子间作用力的结果。取决于蛋白质分子及其配制条件，不同的相互作用可能会影响粘度，例如分子拥挤或偶极-偶极或偶极-电荷相互作用或疏水或带电基团之间的相互作用。因此，制药行业强烈需要降粘赋形剂，尤其是当上述基于nacl和氨基酸的标准溶液不能降低粘度时作为替代选择。
14.过去已经研究了许多降粘添加剂和赋形剂。然而，目前，仍然不是所有的在高浓度下展现出粘度问题的治疗性蛋白质溶液可以通过已知的降粘赋形剂适当地解决。
15.在生物过程中，溶液必须通过管道和色谱柱泵送。在高粘度下，通过这种柱的流速受到所述粘度的限制，这会导致更长的处理时间、色谱过程中的大量蛋白质损失或可能导致蛋白质溶液的完全不可处理。此外，当从窄管穿过连接器进入较窄的柱时，可能会出现剪切力。剪切应力是蛋白质变性和潜在聚集从而降低过程产率的典型原因。显然，这种剪切应力引起的聚集对过程经济性具有不利影响。此外，色谱柱内的凝胶床可能会被高压损坏。
16.此外，一些蛋白质通过切向流过滤(tff)制成高浓度。当溶液的粘度变得临界时，可能会在膜附近形成凝胶状层。特别是膜通量显著降低，导致处理时间增加，因此制造成本显著增加。如前所述，在tff期间也可能发生剪切应力，导致不溶性蛋白质聚集体和降低的产率。
17.通常，已经观察到高粘度溶液产生一定的粘性，使其难以从容器、管道中回收完整的溶液或从处理系统中移出整个物质。这种物质损失导致产品显著降低的产率，对过程经济性产生明显的不利影响。
18.本发明的目的
19.旨在用于药物应用的蛋白质制剂(例如单克隆抗体、融合蛋白等)通常需要稳定剂以防止不希望的聚集并防止物理或化学降解。这些问题在高蛋白浓度下恶化，然而高蛋白浓度对于这类分子的治疗施用通常是所需的。
20.在高浓度下，蛋白质趋向于自缔合，从而导致高粘度制剂，并例如使这些蛋白质溶液通过注射施用复杂化，也使得制造过程复杂化，其中切向流过滤通常用于缓冲液交换和增加蛋白质浓度。在过滤和注射过程中，通过增加背压和剪切应力，治疗性蛋白质可能会不稳定或过度地延长处理时间。因此，在生物制药工业中高度需要具有降粘特征的制剂添加剂和赋形剂或其组合。但是，配制蛋白质(如单克隆抗体)需要仔细选择配制添加剂和/或赋形剂，以避免蛋白质变性和生物活性丧失。
21.但是，仍然有大量新兴抗体和抗体形式需要开发合适的、创新的降粘添加剂和/或赋形剂，或特定的添加剂/赋形剂组合或靶向制剂策略。这些添加剂/赋形剂必须是药学上安全的，因为蛋白质制剂是肠胃外施用的，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮内或皮下途径。因
此，可以在这些制剂中使用的添加剂必须在生理上相容，并且必须没有任何不良副作用，并且在任何情况下都不会导致过敏反应，特别地，它们不得引起任何过敏反应样副作用。
22.此外，要解决的问题是提供能够有效降低蛋白质溶液粘度的赋形剂组合。
23.还有一个要解决的问题是许多以相关浓度使用的降粘赋形剂可对蛋白质稳定性产生不利影响。因此，要解决的另一个问题是提供赋形剂组合，该组合可以有效地降低蛋白质溶液的粘度，并且与以更高的浓度(从而导致与组合相似的粘度降低)单独使用的一种降粘赋形剂相比表现出改善的蛋白质稳定性。
24.蛋白质溶液的高粘度在生物加工中造成许多困难。由于迄今为止用于降低相应蛋白质溶液的粘度的已知添加剂在许多情况下不能产生足够的降低粘度效果，因此本发明的一个目的是寻找新的可能性，从而可以提高相应的粘度降低效果并可以减少对过程经济性的不利影响。


技术实现要素：

25.出乎意料地，在配制高度浓缩蛋白质制剂的实验中发现了单独或与其他赋形剂组合适用于显著降低粘度的赋形剂。
26.本发明涉及一种用于降低液体组合物的粘度的方法，该液体组合物包含浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的蛋白质，该方法包括将液体组合物与处于具有降低粘度的作用的浓度的作为赋形剂的至少樟脑磺酸组合的步骤。
27.根据该方法，将选自下文所列分子组的赋形剂或赋形剂组合以优化的浓度添加到高度浓缩的蛋白质液体制剂中。包含蛋白质的液体组合物的粘度由此显著降低。
28.优选地，液体蛋白质组合物与樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂组合。当将樟脑磺酸与至少一种选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的阳离子赋形剂组合添加到包含蛋白质的液体组合物中时，实现了粘度的良好降低。
29.令人惊讶的是，本发明的赋形剂组合可以协同降低液体蛋白质组合物的粘度并任选地同时增加蛋白质的稳定性。
30.令人惊讶的是，关于粘度降低潜力，与仅使用一种降粘赋形剂时相比，在使用本发明的赋形剂组合时，蛋白质稳定性受到的负面影响较小。
31.蛋白质可以是治疗或药学活性蛋白质并且可以是选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子、抗体-药物缀合物和融合蛋白的蛋白质。这样，制剂的粘度降低了至少12％，优选地降低了至少50％。
32.因此，本发明的一个目的是通过该方法生产与没有赋形剂或没有赋形剂组合的相同制剂相比具有降低的粘度的液体蛋白质组合物或液体药物制剂。
33.使用包含浓度为至少40mg/ml至250mg/ml，优选浓度为至少90mg/ml至250mg/ml的蛋白质优选治疗性蛋白质的液体药物制剂，并且如果添加至少樟脑磺酸作为降粘赋形剂，实现了良好的粘度降低。当赋形剂在液体药物组合物中的浓度低于约500mm，尤其是低于200mm时，实现特别好的粘度降低效果，该液体药物组合物显示ph值在约3至约8，优选4.5至约8.0的范围内，更优选在约4.7至约7.5之间的范围内，特别优选在约5至约7.2的范围内并且包含缓冲剂。所述制剂可包含磷酸盐或醋酸盐缓冲液。此外，该制剂可以包含稳定剂。这种稳定剂可以是糖或表面活性剂，如蔗糖、聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯80或泊洛沙姆。
34.相应制备的粘度降低的药物制剂可以制备为冻干粉末。像这样的冻干粉末包含治疗性蛋白质和樟脑磺酸，其中樟脑磺酸或樟脑磺酸与阳离子赋形剂的组合的存在量足以在重构时产生低于500mm、优选低于200mm的浓度，并且其中蛋白质产生为至少40mg/ml至250mg/ml、优选至少90mg/ml至250mg/ml的浓度。该粉末的重构包括添加无菌水性稀释剂的步骤。因此，本发明的一个目的是如本文所表征的方法，其中制备制剂，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白，优选地，治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白，特别优选地，治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
35.本发明的另一个主题是在生物过程中降低液体蛋白质组合物的粘度的方法，包括将液体蛋白质组合物与作为赋形剂的至少樟脑磺酸组合的步骤，所述樟脑磺酸在液体蛋白质组合物中的浓度具有降低粘度的作用。优选地，液体蛋白质组合物与樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂组合。当樟脑磺酸与至少一种选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的阳离子赋形剂组合添加到液体蛋白质组合物中时，实现了粘度的良好降低。
36.本发明的主题还是一种试剂盒，其包含如前所述的药物制剂或包含在给定实施方案中的冻干粉末。该试剂盒可以包含通过上述方法获得的药物组合物的冷冻干燥或喷雾干燥的制剂，并且其可以在使用前制成溶液制剂。因此，相应的试剂盒可以包含置于96孔板中的即用型冷冻干燥或喷雾干燥的制剂。该试剂盒还可以包含容器、注射器和/或带有或不带有针头的其他施用装置、输液泵、喷射注射器、笔式装置、透皮注射器或其他无针注射器和取决于所述试剂盒的应用的需要的说明书。
具体实施方式
37.如上所述，高蛋白质浓度带来了与液体制剂中蛋白质的物理和化学稳定性有关的挑战，以及在所述蛋白质制剂的生产、储存和施用方面的困难。一个主要问题是蛋白质在加工和/或储存期间趋于聚集并形成颗粒的趋势，这使得在进一步加工和/或施用期间的操作变得困难。浓度依赖的降解和/或聚集是开发更高浓度液体蛋白质制剂的主要挑战。除了潜在的非天然蛋白质聚集和颗粒形成之外，在水溶液中可能会发生可逆的自缔合，这尤其导致粘度增加，使注射递送复杂化。
38.定义
39.如本文中通常使用的，术语“蛋白质”是指通过肽键彼此连接以形成多肽的氨基酸聚合物，该多肽的链长足以产生至少可检测的三级结构。分子量(以kda表示，“da”代表“道尔顿”，1kda＝1,000da)大于约100kda的蛋白质可以被称为“高分子量蛋白质”，而分子量小于大约100kda的蛋白质可以被称为“低分子量蛋白质”。术语“低分子量蛋白质”排除缺乏被认为是蛋白质必须存在的至少三级结构的小的肽。蛋白质分子量可以使用本领域技术人员已知的标准方法来确定，包括但不限于质谱法(例如，esi，maldi)或由已知的氨基酸序列和糖基化来计算。蛋白质可以是天然存在的或非天然存在的、合成的或半合成的。
[0040]“几乎纯的蛋白质”和“基本纯的蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指包含至少约90重量％的纯蛋白质、优选至少约95重量％的纯蛋白质的组合物。“几乎均质的”和“基本上均质的”在本文中可互换使用，并且是指其中存在的至少约90重量％、优选至少约95重
量％的蛋白质是单体与可逆的二聚和低聚缔合体(不是不可逆的聚集体)的组合的组合物。
[0041]
如本文中通常使用的，术语“抗体”广泛涵盖mab(包括具有免疫球蛋白fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、双抗体和单链抗体分子以及抗体片段(例如fab、fab
′
、f(ab
′
)2和fv)、单结构域抗体、多价单结构域抗体、fab融合蛋白及其融合物。
[0042]
如本文中通常使用的，术语“单克隆抗体”或“mab”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变之外，该群体包含的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个表位具有高度特异性。例如，这些通常是通过培养杂交瘤细胞合成的，如kohler等描述的(nature 256:495，1975)，或可以通过重组dna方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)，或使用描述于clackson等(nature 352:624-628，1991)和marks等(j.mol.biol.222:581-597，1991)的技术从噬菌体抗体库中分离。如本文所用的，“mab”具体包括衍生的抗体、抗体-药物缀合物和“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体种类或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体种类或子类的抗体的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们展现出所需的生物学活性(美国专利号4,816,567；morrison等，proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855，1984).
[0043]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，包括完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab
′
、f(ab
′
)2和fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870；zapata等，protein eng.8:1057-1062，1995)；单链抗体分子；多价单域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0044]
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是大部分人类序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如fv、fab、fab
′
、f(ab
′
)2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有最少的衍生自非人类免疫球蛋白的序列。(参见，例如jones等，nature 321:522-525，1986；reichmann等，nature 332:323-329，1988；和presta，curr.op.struct.biol.2:593-596，1992.)
[0045]
在此上下文中，术语“治疗活性蛋白质”、“药物活性蛋白质”或“治疗蛋白质”是指为了治疗或预防疾病或医学病症而施用于受试者的如上定义的蛋白质或肽。特别地，受试者可以是哺乳动物或人。可以施用治疗性蛋白质用于不同目的，例如替换缺乏或异常的蛋白质、增强现有途径、提供新的功能或活性、干扰分子或生物体以及递送其他化合物或蛋白质，例如放射性核素、细胞毒性药物或效应蛋白。治疗性蛋白质包括基于抗体的药物、fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白介素、抗体药物缀合物(adc)和溶栓剂。治疗性蛋白质可以是天然存在的蛋白质或重组蛋白质。它们的序列可以是天然的或工程化的。
[0046]“流变学”是指物质的变形和流动的研究，而“粘度”是指物质(通常是液体)的流动阻力。粘度与剪切力的概念有关；可以理解为当流体的不同层彼此相对运动时，流体的不同层彼此或在其他表面上施加剪切力的效果。有几种粘度度量。粘度单位为n/m2，称为帕斯卡秒(pa-s)。粘度可以是“运动的”或“绝对的”。运动粘度是通过流体传递动量的速率的量度。它以斯托克斯(st)测量。运动粘度是在重力影响下流体的阻力流的量度。当将两种体积相同但粘度不同的流体放在相同的毛细管粘度计中并通过重力流过时，流过毛细管的粘度较
高的流体比粘度较低的流体花费的时间更长。例如，如果一种流体需要200秒(s)才能完成其流动，而另一种流体需要400s，则在运动粘度标度上，称为第二种流体的粘度是第一种流体的两倍。运动粘度的量度是长度2/时间。通常，运动粘度以厘斯托克斯(cst)表示。运动粘度的si单位为mm2/s，其等于1cst。“绝对粘度”，有时也称为“动态粘度”或“简单粘度”，是运动粘度和流体密度的乘积。绝对粘度以厘泊(cp)为单位表示。绝对粘度的si单位是毫帕斯卡秒(mpa-s)，其中1cp＝1mpa-s。
[0047]
粘度可通过使用例如粘度计以给定的剪切速率或多个剪切速率来测量。可以通过在绝对粘度与剪切速率的关系图上创建四个最高剪切点的最佳拟合线，并且将粘度线性外推回零剪切，来确定“外推零剪切”粘度。或者，对于牛顿流体，可以通过在多个剪切速率下取平均粘度值来确定粘度。粘度也可以使用微流体粘度计在单剪切速率或多剪切速率(也称为流速)下进行测量，其中绝对粘度源自液体在流过通道时的压力变化。粘度等于剪切应力除以剪切速率。在一些实施方案中，可以将用微流体粘度计测量的粘度直接与外推的零剪切粘度进行比较，例如从使用锥板粘度计在多个剪切速率下测量的粘度推断的粘度。根据本发明，当至少一种上述方法显示出粘度降低效果时，组合物和制剂的粘度降低。优选地，使用mvroc
tm
技术测量粘度。更优选地，粘度使用mvroc
tm
技术在20℃测量。最优选地，在20℃使用mvroc
tm
技术并使用500μl注射器、3000s-1或2000s-1的剪切速率和200μl的体积测量粘度。本领域普通技术人员熟悉使用mvroc
tm
技术进行粘度测量，尤其是选择上述参数。详细的规格、方法和设置可以在901003.5.1-mvroc_user’s_manual中找到。
[0048]“剪切速率”是指一层流体通过相邻层时的速度变化率。速度梯度是速度根据与板之间的距离的变化。这种简单的情况显示出以剪切速率(v
1-v2)/h的均匀速度梯度，单位为(cm/sec)/(cm)＝1/sec。因此，剪切速率单位是秒的倒数或通常是时间的倒数。对于微流体粘度计，压力和流速的变化与剪切速率有关。“剪切速率”是指材料变形的速度。当使用锥板粘度计和本领域技术人员适当选择的锭子以精确测量在目标样品的粘度范围内的粘度进行测量时(即，在固定到dv2t粘度计(brookfield)的cpe40锭子上最准确地测量20cp的样品)，通常在约0.5s-1
至约200s-1
的剪切速率下测量含有蛋白质和降粘剂的制剂；当使用微流体粘度计测量时，在大于约20s-1
至约3,000s-1
的剪切速率下测量含有蛋白质和降粘剂的制剂。
[0049]
对于本文中通常使用的经典“牛顿”流体，粘度基本上与剪切速率无关。然而，对于“非牛顿流体”，粘度随着剪切速率的增加而降低或增加，例如，流体分别为“剪切稀化”或“剪切稠化”。在浓缩(即高浓度)蛋白质溶液的情况下，这可能表现为假塑性剪切稀化行为，即粘度随剪切速率降低。
[0050]
如本文中通常使用的，术语“化学稳定性”是指制剂中的蛋白质组分抵抗经由化学途径如氧化、脱酰胺或水解的降解的能力。如果在4℃放置24个月后小于约5％的组分降解，则通常认为蛋白质制剂是化学稳定的。
[0051]
如本文中通常使用的，术语“物理稳定性”是指蛋白质制剂抵抗物理劣化例如聚集的能力。物理稳定的制剂仅形成可接受百分比的生物活性蛋白试剂不可逆聚集体(例如，二聚体、三聚体或其他聚集体)。聚集体的存在可以几种方式来评估，包括通过借助动态光散射来测量制剂中蛋白质的平均粒度。如果在4℃24个月后形成少于约5％的不可逆聚集体，则认为制剂是物理稳定的。聚集污染物的可接受水平理想地将小于约2％。可以达到低至约
0.2％的水平，尽管更典型的是约1％。
[0052]
如本文通常使用的，术语“稳定的制剂”是指制剂在化学上和物理上都是稳定的。稳定的制剂可以是这样一种制剂，其中在4℃储存24个月或在高温下的等价溶液条件下，例如在40℃储存一个月后，超过约95％的生物活性蛋白分子在制剂中保留生物活性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，例如在peptide and protein drug delivery，247-301，vincent lee编，marcel dekker，inc.，new york，n.y.(1991)和jones，a.，adv.drug delivery revs.10:29-90，1993中综述。可以在选定的温度下测量特定时间段的稳定性。为了快速筛选，例如，可以将制剂在40℃保持2周至一个月，此时测量残留的生物活性并将其与初始条件进行比较以评估稳定性。当制剂要在2℃-8℃储存时，通常制剂应该在30℃或40℃稳定至少一个月和/或在2℃-8℃稳定至少2年。当制剂要在约25℃的室温下储存时，通常制剂应在约25℃稳定至少2年和/或在40℃稳定至少约6个月。冻干和储存后的聚集程度可以用作蛋白质稳定性的指示。在一些实施方案中，通过测量制剂中蛋白质的粒度来评估稳定性。在一些实施方案中，可以通过使用标准生物学活性或结合测定法来测量制剂的活性来评估稳定性，所述标准生物学活性或结合测定法完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0053]
如本文中通常使用的，术语蛋白质“粒度”是指通过使用众所周知的粒度测定仪例如动态光散射、sec(尺寸排阻色谱法)或本领域普通技术人员已知的其他方法测定的制剂中生物活性分子颗粒的主要群体的平均直径或其粒度分布。
[0054]
如本文中通常使用的，术语“浓缩”或“高浓度”描述了液体蛋白质制剂的最终蛋白质浓度为至少1mg/ml，尤其是大于约10mg/ml，优选大于约50mg/ml，更优选大于约100mg/ml，还更优选大于约200mg/ml，或最优选大于约250mg/ml。
[0055]
如本文中通常使用的“重构制剂”是指通过将干燥的粉末、冻干的、喷雾干燥的或溶剂沉淀的蛋白质溶解在稀释剂中以使蛋白质溶解或分散在用于施用的水性溶液中而制备的制剂。
[0056]“冻干保护剂”是当与蛋白质组合时，在冻干和/或随后存储时显著降低蛋白质的化学和/或物理不稳定性的物质。通常将冻干保护剂以“冻干保护量”添加到冻干前的制剂中。这意味着，在冻干保护剂量的冻干保护剂存在下冻干蛋白质之后，蛋白质基本上保留了其物理和化学稳定性和完整性。
[0057]
如本文通常使用的，“稀释剂”或“载剂”是用于制备液体制剂(例如，冻干后重构的水性制剂)的药学上可接受的(即，对人或另一种哺乳动物施用是安全且无毒的)且有用的成分。示例性的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(bwfi)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液及其组合。
[0058]“防腐剂”是可以添加到本文制剂中以降低细菌、真菌或另一种传染剂的污染和/或作用的化合物。防腐剂的添加可以例如促进多用途(多剂量)制剂的生产。
[0059]
如本文中通常使用的“填充剂”是这样的化合物，其增加了冻干混合物的质量并且有助于冻干饼的物理结构(例如，促进了保持开口孔结构的基本上均匀的冻干饼的生产)。
[0060]“治疗有效量”是实现可测量的改进或预防任何症状或特定病况或病症、实现可测量的预期寿命提高或总体上改进患者生活质量所需的最小浓度。治疗有效量取决于特定的生物活性分子和要治疗的特定病况或病症。许多蛋白质例如本文所述的mab的治疗有效量
在本领域中是众所周知的。可以通过标准技术确定尚未建立的或使用临床上用于治疗另外的病症的已知蛋白质(如mab)来治疗特定病症的蛋白质治疗有效量，所述标准技术是在技术人员(例如医师)的能力之内。
[0061]
如本文中通常使用的，术语“可注射性”或“注射性”是指药物制剂通过配备有18-32号针头，任选地薄壁的针头的注射器的注射性能。可注射性取决于诸如注射所需的压力或力、流动的均匀性、抽吸质量和不被堵塞的因素。液体药物制剂的可注射性可以通过将粘度降低的制剂与不添加降粘剂的标准制剂的注射力进行比较来评估。含有降粘剂的制剂的注射力的降低反映了该制剂的改进的可注射性。当与除了用大约相同浓度的适当缓冲液代替降粘剂外具有相同浓度的蛋白质在相同条件下的标准制剂相比，注射力降低至少10％、优选至少30％、更优选至少50％、最优选至少75％时，降低粘度的制剂具有改进的可注射性。或者，可以通过比较当用相同的力压下注射器时注射相同体积(例如0.5ml，或更优选约1ml)的不同液体蛋白制剂所需的时间来评估液体药物制剂的可注射性。
[0062]
如本文中通常使用的，术语“注射力”是指以给定的注射速度将给定的液体制剂推过配备有给定的针号的给定的注射器所需的力。注射力通常以牛顿表示。例如，可以将注射力测量为以250mm/min的注射速度将液体制剂推过装配有0.50英寸27号针头具有0.25英寸内径的1ml塑料注射器所需的力。测试设备可用于测量注射力。在相同条件下进行测量时，粘度较低的制剂通常需要总体上较低的注射力。
[0063]
如本文中通常使用的，术语“降低粘度的制剂”是指与不包含降粘添加剂或试剂的相应制剂相比，通过存在一种或多种添加剂改性而降低粘度的具有高浓度的大分子量蛋白质(例如mab)或低分子量蛋白质的液体制剂。
[0064]
如本文所用的，术语“降粘剂”是指相对于不存在降粘剂的溶液的粘度来降低溶液的粘度的化合物。降粘剂可以是单一化合物或可以是一种或多种化合物的混合物。当降粘剂是两种或更多种化合物的混合物时，除非另有说明，否则所列浓度是指每种单独的试剂。举例来说，含有约0.25m的葡甲胺苯磺酸盐作为降粘剂的制剂是具有浓度为0.25m的苯磺酸和浓度为0.25m的葡甲胺的溶液。
[0065]
某些降粘剂含有酸性或碱性官能团，并且可以显示亲水和疏水区域，它们共同影响与溶液中所含蛋白质的相互作用特性。官能团是否被完全或部分电离取决于它们所在制剂的ph。除非另有说明，否则提及含有具有可电离官能团的降粘剂的制剂包括母体化合物和任何可能的电离态二者。
[0066]
如本文所用的，术语“液体制剂”或“制剂”是在可接受的药物稀释剂中提供的蛋白质或在施用于患者之前在可接受的药物稀释剂中重构的蛋白质。
[0067]
生物仿制药可由微生物细胞(原核、真核)、人或动物来源的(例如哺乳动物、禽类、昆虫)细胞系或衍生自动物或植物的组织生产。提出的生物仿制药产品的表达构建体将通常会编码与其参考产品相同的一级氨基酸序列。可能会存在较小的修饰，例如不会影响安全性、纯度或效力的n端或c端截断。
[0068]
就安全性和功效而言，生物仿制药mab在物理化学或生物学上均与参考mab相似。可以使用一项或多项体外研究相对于参考mab来评估生物仿制药mab，所述体外研究包括对下述进行详细说明的测定：结合靶抗原；结合fcγ受体(fcγri、fcγrii和fcγriii)、fcrn和补体(c1q)的亚型；与fab相关功能(例如中和可溶性配体，受体激活或阻断)；或与fc相关
的功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补体依赖性细胞毒性、补体激活)。可以将体外比较与体内数据相结合，以证明药代动力学、药效学和/或安全性的相似性。针对参考mab的生物仿制药mab的临床评估可以包括对下述的比较：药代动力学特性(例如auc
0-inf
，auc
0-t
，c
max
，t
max
，c
trough
)；药效学终点；或临床疗效的相似性(例如，使用随机、平行组比较临床试验)。可以使用既定程序评估生物仿制药mab与参考mab之间的质量比较，包括在“guideline on similar biological medicinalproducts containing biotechnology-derived proteins as active substance:quality issues”(emea/chmp/bwp/49348/2005)，和“guideline on development,production,characterization and specifications for monoclonal antibodies andrelated substances”(emea/chmp/bwp/157653/2007)中描述的那些。生物仿制药mab和参考mab之间的差异可以包括翻译后修饰，例如通过将其他生化基团(例如磷酸盐、各种脂质和碳水化合物)与mab相连；通过翻译后的蛋白水解切割；通过改变氨基酸的化学性质(例如甲酰化)；或通过许多其他机制。其他翻译后修饰可以是生产过程中操作的结果，例如，在产品暴露于还原糖中时可能发生糖基化。在其他情况下，存储条件可能允许某些降解途径(例如氧化、脱酰胺或聚集)，因为所有这些与产品相关的变体都可能包含在生物仿制药mab中。
[0069]
如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒的酸和碱(包括无机酸和碱，以及有机酸和碱)制备的盐。
[0070]
如本文所使用的，术语“烷基”是指直链、支链和环状烃基。除非另有说明，否则术语“烷基”包括包含一个或多个双键或三键的烃基。包含至少一个环体系的烷基是“环烷基”。包含至少一个双键的烷基是“烯基”，并且包含至少一个三键的烷基是“炔基”。
[0071]
如本文所使用的，术语“芳基”是指芳族碳环体系，包括稠环体系。在“芳基”基团中，形成环的每个原子均为碳原子。
[0072]
如本文所用的，“杂芳基”是指芳族环体系，包括稠环体系，其中形成该环的原子中的至少一个是杂原子。此外，本文所用的术语“杂环”是指不是芳族的环体系，其包括稠合的环体系，其中形成环的原子中的至少一个是杂原子。
[0073]
如本文所用的术语“杂原子”是任何非碳或非氢原子。优选的杂原子包括氧、硫和氮。
[0074]
术语“生物过程”是指治疗性细胞制造过程，其可分为上游过程和下游过程。上游过程定义为从细胞化合物分离蛋白质之前的整个过程。上游过程包括早期的细胞分离和培养、细胞保存和细胞的培养扩增直至最终收获。生物过程的下游部分是指从上游的进料纯化靶蛋白并进行处理以满足纯度和质量要求的部分。某些类型的细胞在进入下游过程时需要被破坏。然而，其他细胞可能将靶蛋白分泌到培养基中，并需要通过过滤去除细胞。进一步的下游加工通常分为几个主要部分：纯化部分和精炼(polishing)部分。生物过程可以是分批过程或半连续或连续过程。
[0075]
术语“渗透通量”是指在特定时间段(通常为几分钟)内通过定义过滤器的体积。
[0076]
术语“过滤步骤”是指液体通过具有限定孔径的材料的过程步骤，以允许基于材料的尺寸分离材料。对于某些过滤器，孔径以纳米为单位定义。然而对于其他过滤器，孔径不是直接定义的，而是给出了要保留的分子的重量。过滤材料可以以阻塞过滤装置的横截面(死端过滤)的方式放置。然而，过滤材料可以以待过滤的溶液切向流过所述材料的表面的
方式放置，例如切向流过滤。过滤材料可以是膜、玻璃过滤器、金属过滤器或树脂。树脂可以保持在色谱柱中。树脂可以是阳离子或阴离子交换树脂、亲和树脂，如蛋白质a或谷胱甘肽树脂，或疏水或亲水树脂。
[0077]
缓冲液交换和体积减少后的术语“蛋白质回收率”是指在处理步骤后要回收的蛋白质级分。
[0078]
术语“切向流过滤”或“tff”是指一种过滤方法，其中溶液切向通过限定的过滤器。小于过滤器孔的物质通过由溶液流速、粘度、温度和其他因素产生的压力通过过滤器从溶液中排出。
[0079]
制剂
[0080]
生物相容性、低粘度蛋白质溶液(例如mab的那些)可用于以皮下(sc)和肌内(im)注射有用的体积递送治疗有效量的蛋白质，对于sc的注射量通常小于或等于约2ml，而对于im小于或等于约5ml，更优选对于sc小于或等于约1ml，而对于im小于或等于约3ml。蛋白质通常可以具有任何分子量，尽管在一些实施方案中，高分子量蛋白质是优选的。在其他实施方案中，蛋白质是低分子量蛋白质。
[0081]
现在，本发明提供一种降低包含蛋白质的液体组合物的粘度和任选地提高稳定性的方法，包括将液体组合物与作为赋形剂的降低粘度量的樟脑磺酸组合的步骤，该赋形剂可以与至少一种合适的阳离子赋形剂组合。该阳离子赋形剂可选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物。这些赋形剂以合适的量添加到制剂中。优选地，它们以等摩尔量加入到所包含的液体蛋白质组合物中。取决于溶液的ph值、液体蛋白质组合物的浓度、蛋白质的性质、所添加赋形剂的最终浓度及其(它们的)化学性质，降低粘度的效果有所不同。在一个具体实施方案中，液体组合物是液体药物制剂并且蛋白质是治疗性蛋白质。
[0082]
特别地，当樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂以等摩尔量添加到浓缩的液体蛋白质组合物中，例如添加到(mabc、mabd和mabe)溶液中时，实现了特别好的粘度降低。根据本发明，mabc代表单克隆抗体英夫利昔单抗(infliximab)，mabd代表单克隆抗体依洛尤单抗(evolocumab)，并且mabe代表单克隆抗体瑞利珠单抗(reslizumab)。
[0083]
出乎意料地，通过实验发现樟脑磺酸与选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的阳离子酸的混合物作为特定的等摩尔混合物显著降低单克隆抗体或融合蛋白的高度浓缩蛋白质液体制剂的粘度。
[0084]
此外，发现樟脑磺酸与选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的阳离子酸的混合物可以协同降低包含蛋白质的组合物和制剂的粘度和/或增加稳定性。如本文所定义，“协同地”是指组分组合的作用大于单独的每种组分的作用之和的效果。
[0085]
本发明还提供一种协同降低包含蛋白质的液体组合物或包含浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的药学活性蛋白质的液体制剂的粘度的方法，包括将液体蛋白质组合物与作为赋形剂的至少樟脑磺酸以及与选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的阳离子酸以具有降低粘度作用的浓度组合的步骤。在一个具体实施方案中，通过樟脑磺酸和精氨酸的组合协同降低粘度。优选地，通过以1∶1的浓度比组合樟脑磺酸和精氨酸来协同降低粘度。
[0086]
此外，令人惊讶地发现，与单独的樟脑磺酸相比，向樟脑磺酸添加选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的阳离子酸导致蛋白质的稳定性提高。
[0087]
本发明进一步提供了用于稳定浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的液体组合物中的蛋白质或液体制剂中的药物活性蛋白质的方法，包括将液体蛋白质组合物与作为赋形剂的至少樟脑磺酸与选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的阳离子酸的组合以具有降低粘度作用的浓度组合的步骤。在一个具体实施方案中，蛋白质通过樟脑磺酸和精氨酸或樟脑磺酸和鸟氨酸的组合来稳定。优选地，通过樟脑磺酸和精氨酸或樟脑磺酸和鸟氨酸以1∶1的浓度比组合来稳定蛋白质。优选地，与包括将液体蛋白质组合物与作为赋形剂的樟脑磺酸组合的步骤的浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的包含蛋白质的液体组合物或包含药物活性蛋白质的液体制剂相比，药物活性蛋白的稳定性提高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。
[0088]
本发明还提供一种协同降低浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的包含蛋白质的液体组合物或包含药学活性蛋白质的液体制剂的粘度的方法，包括将液体蛋白组合物与作为赋形剂的樟脑磺酸与精氨酸的组合以具有降低粘度作用的浓度组合的步骤，而与包括将液体蛋白质组合物与作为赋形剂的樟脑磺酸组合的步骤的浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的包含蛋白质的液体组合物或包含药物活性蛋白质的液体制剂相比，药物活性蛋白的稳定性提高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。
[0089]
在示例性实施方案中，蛋白质或治疗性蛋白质处于如上所述的高蛋白质浓度。在一些实施方案中，与其中在液体蛋白质组合物中添加相同量的缓冲溶液而不是降粘剂溶液的对照制剂相比，粘度降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。
[0090]
在示例性实施方案中，蛋白质或治疗性蛋白质处于如上所述的至少50mg/ml、优选大于75mg/ml、更优选大于100mg/ml的高蛋白质浓度。在此测试和公开的制剂的蛋白质浓度范围为150-280mg/ml。在一些实施方案中，与对照制剂相比，粘度降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多。
[0091]
在另一个方面，本发明提供了液体溶液，其包含治疗性蛋白质和作为赋形剂的樟脑磺酸以及至少另外的选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的阳离子赋形剂，其中所述制剂相对于对照制剂表现出降低的粘度。在示例性实施方案中，治疗性蛋白质处于如上所述的高蛋白质浓度，并且本文所述的赋形剂以降低粘度的浓度存在。樟脑磺酸及其赋形剂可以以高达其溶解度极限的浓度使用。此类溶液还可包含有效量的其他添加剂，以进一步提高稳定性、减少聚集和/或使制剂等渗，而不会显著增加粘度。
[0092]
在进一步的实施方案中，作为赋形剂的樟脑磺酸的浓度小于约500mm，尤其是小于200mm。优选地，樟脑磺酸的浓度为至少约50mm至约300mm，或至少约100mm至约250mm，或至少约140mm至约200mm。在示例性实施方案中，赋形剂的浓度为至少约50、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185，190、195、200、210、220、250或300mm或更多。至少一种选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的阳离子赋形剂的浓度为至少约50mm至约300mm，或至少约100mm至约250mm，或至少约140mm至约200mm。在示例性实施方案中，至少一种阳离子赋形剂的浓度为至少约50、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、250或300mm或更多。当单独使用或与至少一种阳离子赋形剂组合使用时，樟脑磺酸的优选浓度在
25mm和250mm之间，更优选在50mm和200mm之间，最优选在75mm和150mm之间。当组合使用时，至少一种阳离子赋形剂的浓度优选在25mm和250mm之间，更优选在50mm和200mm之间，最优选在75mm和150mm之间。当樟脑磺酸与选自精氨酸、肉碱、葡甲胺和鸟氨酸的阳离子赋形剂组合使用时，樟脑磺酸与阳离子赋形剂之间的摩尔比优选在1:3至3:1的范围内，更优选1:2至2:1，最优选1:1。例如，25mm肉碱与50mm樟脑磺酸的组合在这些赋形剂的1:2混合物的溶液中产生75mm的赋形剂浓度。其他示例性实施方案包括有效使制剂等渗而不显著增加粘度的赋形剂浓度。示例性浓度包括约150mm或更高的浓度，在进一步的实施方案中，该量为至少约170mm或更高。然而，所选择的浓度必须能够有效降低液体蛋白质组合物的粘度，并且所选择的浓度对生物体来说是安全和可耐受的。
[0093]
在另一个方面，本发明提供了冻干蛋白制剂，其包含治疗性蛋白以及作为赋形剂的樟脑磺酸和至少一种选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的阳离子赋形剂，其中在用推荐量的稀释剂重构后，该制剂相对于对照制剂表现出降低的粘度。在示例性实施方案中，治疗性蛋白质处于如上所述的高蛋白质浓度。在一些实施方案中，赋形剂以在用稀释剂重构时有效降低粘度的量存在，例如包含98mg mabc：150mm赋形剂。这样的制剂可以包含有效量的另外的添加剂，以进一步提高稳定性、减少聚集和/或使制剂等渗而不显著增加粘度。
[0094]
在本发明的示例性实施方案中，赋形剂和所选赋形剂的浓度为至少约1μg/mg治疗性蛋白质，至多约1.0mg/mg治疗性蛋白质。在一些实施方案中，赋形剂的浓度为至少约1、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500或550μg/mg治疗性蛋白质。在其他示例性实施方案中，赋形剂的浓度高达约600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg/mg治疗性蛋白质。
[0095]
在又一个实施方案中，本发明提供了通过使用以如本文所述的任何量或浓度存在、与选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的至少一种阳离子赋形剂组合的樟脑磺酸作为赋形剂来防止液体制剂中蛋白质的自缔合的方法。
[0096]
本发明还提供了一种试剂盒，其包含本发明的液体蛋白制剂，和用于其施用的说明书，任选地容器、注射器和/或其它施用装置。本发明进一步提供了一种试剂盒，其包含本发明的冻干蛋白制剂(任选地在容器中)，以及用于其重构和施用的说明书，任选地和一小瓶无菌稀释剂，以及任选地注射器或其他施用装置。示例性的容器包括小瓶、试管、瓶子、单腔或多腔预填充注射器或药筒，以及一个96孔板，其包含位于孔中的即用型冷冻干燥或喷雾干燥的制剂。示例性的施用装置包括具有或不具有针头的注射器、输液泵、喷射注射器、笔式装置、经皮注射器或其他无针注射器。
[0097]
本发明的另一方面是提供一种用于筛选赋形剂的降低粘度的浓度的方法，包括以下步骤：(1)评估包含第一浓度的樟脑磺酸作为赋形剂和第一浓度的选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的合适的赋形剂和治疗性蛋白质(例如抗体)的第一溶液的粘度，(2)评估包含不同的第二浓度的赋形剂和治疗性蛋白质的第二溶液的粘度，和(3)如果第一溶液粘度较低，则确定第一浓度的赋形剂比第二浓度的赋形剂更能降低粘度。粘度可以例如使用m-vroc
tm
技术流变仪(rheosense，san ramon，california，usa)或aries arg2流变仪或brookfield rv-dviii流变仪来确定。
[0098]
提供了用于筛选赋形剂的减少聚集或稳定浓度的类似方法。
[0099]
可以通过多种方式评估稳定性，包括监测一系列温度(热稳定性)和/或时间段(保质期)内和/或暴露于压力处理情况(例如物理摇晃)后的构象变化。可以使用多种方法测量含有不同浓度的制剂组分的制剂的稳定性。例如，蛋白质聚集的量可以通过浊度的肉眼观察、通过测量特定波长下的吸光度、通过尺寸排阻色谱法(其中蛋白质的聚集体与其天然活性状态的蛋白质相比将在不同的级分中洗脱)、hplc或其他色谱方法来测量。可以使用其他测量构象变化的方法，包括使用差示扫描量热法(dsc)，例如确定变性温度，或圆二色性(cd)，其测量蛋白质的摩尔椭圆率。荧光也可用于分析组合物。荧光包括在吸收光之后的光发射，这需要合适的波长。潜在读出是光的极性特性、光强度或发射波长的变化。荧光发射可以是蛋白质固有的，或可以是由于荧光报告分子(例如与部分未折叠蛋白质的疏水袋结合)产生。报告分子结合的增加可以通过检测蛋白质样品的荧光信号来监测。可以使用其他用于测量稳定性的手段，这些手段对于本领域技术人员来说是众所周知的。根据本发明，当至少一种上述方法显示稳定作用时，组合物和制剂的稳定性增加。
[0100]
在进行的实验中，首先，测试单独和与抗体(mabc、mabd、mabe)组合的樟脑磺酸的粘度降低潜力。如下面的实施例中所示地调节蛋白质的浓度以产生高粘度水平。
[0101]
如上所述，这些制剂的ph值对于它们的有效性和各自药学活性蛋白质的可用性特别重要。因此期望将所研究的蛋白质制剂的ph调节在约3至约8，优选4.5至约8.0的范围内。取决于所含蛋白质或肽的性质，优选将ph值调节在约3至约8的范围内，优选4.5至约5.5或约5.0至约8.0的范围内。用于调节ph的缓冲液优选为ph 5.0的醋酸盐缓冲液(25mm)和ph 7.2或7.5的磷酸盐缓冲盐水(10mm)。但是，如果需要，可以使用与所含药物活性蛋白质相容且生理上可接受的另一种缓冲液。
[0102]
将降粘剂的浓度调节在50mm至500mm的范围内。使用基于芯片的(微机电系统)毛细管流变仪m-vroc
tm
(rheosence，san ramon，ca)来测量动态粘度。通常，也被称为绝对粘度(绝对粘度系数)的动态粘度是内部阻力的量度，其可以通过蛋白质分子在高浓缩溶液中的自缔合来确定。
[0103]
确定的粘度清楚地表明，在溶液中应用一定浓度的樟脑磺酸以及特定的抗体导致高浓缩液体蛋白质组合物的粘度显著降低。
[0104]
然而，特别出乎意料的是，实验表明，樟脑磺酸和选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的赋形剂的组合添加导致显著更高的粘度降低。
[0105]
如已经指出的，特别是如果将樟脑磺酸和选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱或其混合物的赋形剂的混合物以等摩尔量添加到浓缩的液体蛋白质组合物中，例如添加到mabc、mabd和mabe的溶液中，实现了特别好的粘度降低。
[0106]
在进一步的实验中，研究了任何一种测试的阳离子赋形剂与樟脑磺酸组合的混合物降低高浓缩抗体溶液(mabc、mabd和mabe)粘度的潜力。对于这些研究中的每一项，添加等摩尔量的这些赋形剂的混合物。等摩尔量的这些赋形剂是优选的。对于150mm添加的赋形剂的浓度，这里发现了特别好的结果。
[0107]
所有模型抗体均以约100mg/ml、一些约150mg/ml、尤其是超过200mg/ml、特别是220mg/ml(mabe)的相当高的浓度在ph 5或ph 5.5的醋酸盐缓冲液中或在ph 7.2的磷酸盐缓冲液中配制。使用基于芯片的(微机电系统)毛细管流变仪m-vroc
tm
(rheosence，san ramon，ca)测量20℃的粘度。
[0108]
在所有情况下，阳离子赋形剂浓度为150mm的特定等摩尔混合物显示在高度浓缩的抗体溶液中测得的粘度显著降低。
[0109]
在进一步的实验中，已经发现樟脑磺酸和至少一种上述阳离子赋形剂的组合在以150mm的总浓度分别添加到液体蛋白质组合物中时可以显著降低抗体制剂的粘度。
[0110]
此外，在包含mabd(作为蛋白质)的溶液中，添加各150mm的樟脑磺酸和阳离子赋形剂作为赋形剂导致粘度显著降低。
[0111]
此外，如所进行的实验所示，本文提到的各种其他助剂组合降低了高浓度抗体溶液的粘度。因此，这里提到的赋形剂组合并不详尽，还有其他可能的组合导致相应的结果。
[0112]
在这方面，降低各种液体蛋白质组合物的粘度的尝试表明，取决于特定溶液中所含的蛋白质，不同的添加剂导致最佳的稳定性和粘度降低。
[0113]
在这种情况下，蛋白质mabc的最佳制剂是包含溶解在milli-q水中并调节至ph7.2的磷酸盐缓冲液、聚山梨醇酯80、75mm樟脑磺酸和75mm精氨酸的组合物。
[0114]
进而，对于mabe，最好的制剂是包含溶解在milli-q-水中并调节至ph5.5的醋酸盐缓冲液、0.1g/l聚山梨醇酯80、75mm樟脑磺酸和75mm精氨酸的组合物。
[0115]
因此，本发明的特别优选的实施方案在于在上文所述的高度浓缩的液体蛋白质组合物中添加作为赋形剂的樟脑磺酸与作为赋形剂的选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的单独的或组合的阳离子赋形剂的组合，用于降低粘度。特别优选地，与葡甲胺组合或与鸟氨酸组合或与肉碱组合的樟脑磺酸的添加导致良好的粘度降低。在本发明的另一个优选实施方案中，与精氨酸组合的樟脑磺酸作为赋形剂在包含ph5.0的醋酸盐缓冲液的溶液中以及在包含ph7.2的磷酸盐缓冲液的溶液中也导致特别好的粘度降低。
[0116]
溶液制剂的配制和冷冻干燥可以通过上述方法进行。
[0117]
总之，在高度浓缩的液体蛋白质组合物中，作为关键生理特性的粘度可以通过添加赋形剂樟脑磺酸而有利地降低。如果樟脑磺酸与至少一种选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸、肉碱的阳离子赋形剂组合，则可获得特别好的粘度降低效果。因此，通过添加以下组合可获得特别好的粘度降低效果：葡甲胺与樟脑磺酸、鸟氨酸与樟脑磺酸、肉碱与樟脑磺酸和精氨酸与樟脑磺酸。
[0118]
在一个方面，本发明提供了一种降低液体制剂粘度的方法，该液体制剂包含浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的药物活性蛋白质，该方法包括将蛋白质溶液与作为赋形剂的至少樟脑磺酸组合的步骤，所述樟脑磺酸在蛋白质溶液中的浓度具有降低粘度的作用。
[0119]
在另一方面，本发明提供如上所述的方法，包括将蛋白质溶液与樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂组合的步骤。
[0120]
在另一方面，本发明提供如上所述的方法，其中樟脑磺酸与至少一种选自l-精氨酸、葡甲胺、l-鸟氨酸和l-肉碱的阳离子赋形剂组合添加。
[0121]
在另一方面，本发明提供如上所述的方法，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
[0122]
在另一方面，本发明提供了如上所述的方法，其中制剂的粘度降低了至少12％。
[0123]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的方法，其中制剂的粘度降低了至少50％。
[0124]
在另一方面，本发明提供了通过上述方法生产的液体药物制剂，其与不含赋形剂
或不含赋形剂组合的相同制剂相比具有降低的粘度。
[0125]
在另一方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其包含浓度为至少90mg/ml至高达250mg/ml的治疗性蛋白质和作为降粘赋形剂的樟脑磺酸。
[0126]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其中赋形剂的浓度小于约500mm，尤其是小于200mm。
[0127]
在另一方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其具有在约4.5至约8.0的范围内的ph并且包含缓冲液。
[0128]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其具有在约4.5至约7.5的范围内的ph并且包含缓冲液。
[0129]
在另一方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其具有约5至约7.2的ph并包含缓冲液。
[0130]
在另一方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其包含磷酸盐或醋酸盐缓冲液。
[0131]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其包含稳定剂。
[0132]
在另一方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其包含糖或表面活性剂作为稳定剂。
[0133]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其包含蔗糖作为稳定剂。
[0134]
在另一方面，本发明提供了如上所述的液体药物制剂，其包含聚山梨醇酯或泊洛沙姆80作为稳定剂。
[0135]
在另一方面，本发明提供了制备冻干粉末的方法，包括冻干上述药物组合物的步骤。
[0136]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的包含治疗性蛋白质和樟脑磺酸的冻干粉末，其中樟脑磺酸或樟脑磺酸与阳离子赋形剂的组合以足以在重构后产生小于500mm、优选小于200mm的浓度的量存在。
[0137]
在另一方面，本发明提供了重构上述冻干粉末的方法，包括添加无菌水性稀释剂的步骤。
[0138]
在另一方面，本发明提供如上所述的方法，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
[0139]
在另一方面，本发明提供如上所述的药物制剂或药物组合物，其中所述治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
[0140]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的冻干粉末，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、纳米抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
[0141]
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含如上所述的药物制剂或冻干粉末。
[0142]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的试剂盒，其包含通过上述方法获得的药物组合物的冷冻干燥或喷雾干燥制剂，其可以在使用前制成溶液制剂。
[0143]
在另一个方面，本发明提供了如上所述的试剂盒，其包含置于96孔板中的即用型冷冻干燥或喷雾干燥的制剂。
[0144]
在另一方面，本发明提供了如上所述的用于向患者施用的试剂盒，包括容器、注射器和/或其他带有或不带有针头的施用装置、输液泵、喷射注射器、笔式装置、透皮注射器或
其他无针头注射器和说明。
[0145]
此外，已发现上述赋形剂和赋形剂组合在生物过程中是有益的。发现赋形剂和赋形剂组合可以降低色谱柱的背压并允许更大的流速。这导致溶液中使蛋白质应变的剪切力较小，因此聚集会减少。总之可以获得更高的产率。除此之外，当过程可以使用更高的流速运行时，过程时间将显著减少。
[0146]
在此处提及的生物过程中，这些被发现用作降粘添加剂的赋形剂的添加导致改进的过程经济性，因为一方面可以提高完整蛋白质的产率，另一方面可以提高可以减少该过程的持续时间。
[0147]
在本发明中，所进行的实验的基础是由离心过滤研究奠定的。这些实验类似于任何过程步骤，其中溶液通过离心力经过过滤膜。对离心力的抵抗力取决于过滤器的特性(其在本实验的情形内假定是恒定的)以及溶液的粘度。选择提供最有利解决方案的赋形剂和赋形剂组合用于使用搅拌池的更复杂的实验。
[0148]
在使用搅拌池的实验中，使用氮气对溶液施加压力，使溶液被加压通过过滤器。压力的阻力取决于过滤器的特性(在本实验的情形内假定为恒定)以及溶液的粘度。在使用实验室规模的切向流过滤(tff)系统的实验中，使用了给出最有利结果的赋形剂组合。
[0149]
这两个实验突出了在死端过滤方法中降粘剂的有益效果。此外，很明显的是，在技术方法中，在溶液通过后端压力施加的力(例如在色谱纯化过程中)通过过滤器或介质例如凝胶床时，所公开的降粘赋形剂具有有益效果。虽然所述过滤步骤主要用于下游过程，但降粘赋形剂在上游过程中也可能是有益的。当蛋白质浓度升高到它们引起粘度的水平时(具有所描述的压力限制和剪切力的负面影响)，当溶液通过管道或过滤器以去除细胞物质和碎片时，本发明显然将具有有益效果。为了测量切向流过滤中的过程效率，在与以前使用的方法相比，大部分场流沿切向流过过滤器的表面而不是穿过过滤器时，使用了实验室规模的tff系统。虽然过滤原理与前面描述的方法不同，但这里的过滤效率也取决于膜的阻力(这里也保持恒定)和溶液粘度(其通过本发明改良)。过滤方法是用于交换制剂缓冲液或将生物分子的浓度提高到所需水平的典型的单元操作。本文使用的搅拌池代表了死端过滤器，其中进料通过过滤材料，该过滤材料在材料顶部保留较大的分子，从而在装置的另一端释放滤液。
[0150]
交换缓冲液和浓缩蛋白质的常用方法是切向流过滤，其中与以前使用的方法相比，大部分场流沿切向流过过滤器表面，而不是穿过过滤器。就像在切向流过滤中使用搅拌池时一样，通过使较小分子通过合适的过滤材料，将大分子与较小分子分离。与代表一种死端过滤形式的搅拌池相比，在切向流过滤中，进料的流动几何形状不同，以避免形成滤饼并允许连续过程。当使用搅拌池时，通过使用搅拌装置同样可以防止形成滤饼。因此，尽管过滤器几何形状不同，但搅拌池非常类似于切向流过滤装置。两种方法的效率主要取决于膜阻力。此外，已知高粘度会降低可用的通量速率，因此会增加处理时间，从而导致更高的生产成本。因此，预计降低的粘度允许更有效的过滤过程，同时剪切力保持低，从而产生滤液中更高的蛋白质浓度。hung等人的工作突出了这一点，其描述了：“在通过切向流超滤(tff)生产浓缩单克隆抗体制剂期间，高粘度和聚集通常会导致广泛的膜污染、通量衰减和产品产率低”(journal of membrane science volume 508，15june 2016，第113-126页)。
[0151]
如前所述，实验表明樟脑磺酸适用于提高生物过程的经济性。此外，与作为赋形剂的选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的阳离子赋形剂和所述赋形剂中的两种组合的樟脑磺酸改善生物过程经济性。尤其是取决于蛋白质溶液的各种比例的组合改善了所描述的生物过程经济性。
[0152]
因此，本发明的另一方面是提供一种在生物过程中降低液体组合物的粘度的方法，该液体组合物包含浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml范围内的蛋白质，该方法包括将液体组合物与处于具有降低粘度的作用的浓度的作为赋形剂的至少樟脑磺酸、优选与至少一种阳离子赋形剂、更优选与选自包含精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱的列表的至少一种阳离子赋形剂进行组合的步骤。
[0153]
本发明的另一方面是如上所述的用于降低液体组合物粘度的方法在生物过程中的用途。
[0154]
根据本发明，上述所有参数；例如赋形剂的浓度、蛋白质的浓度、赋形剂的定量、组合物的其他元素例如缓冲剂或稳定剂、ph值、粘度降低、蛋白质的规格、蛋白质的分子量，也适用于生物过程中的用途。
[0155]
作为用于生物过程的优选实施方案，樟脑磺酸以75-500mm、更优选75-150mm、最优选75mm或150mm的浓度使用。当樟脑磺酸与选自精氨酸、肉碱、葡甲胺和鸟氨酸的阳离子组合使用时，每种赋形剂的浓度为75-500mm，更优选75-150mm，最优选75mm或150mm。当樟脑磺酸与选自精氨酸、肉碱、葡甲胺和鸟氨酸的阳离子组合使用时，比例在1:3至3:1的范围内，更优选1:2至2:1，最优选1:1。例如，25mm肉碱与50mm樟脑磺酸的组合在这些赋形剂的1:2混合物溶液中产生75mm的赋形剂浓度。
[0156]
取决于蛋白质溶液和所进行的生物过程，可以使用不同的缓冲系统作为缓冲液。取决于生物过程期间的条件，本文可以使用醋酸盐，如醋酸铵或醋酸钠，碳酸盐，如碳酸氢铵或碳酸氢钠，或磷酸盐，如磷酸钠或tris-磷酸盐。
[0157]
本发明的另一方面是提供一种用于降低如上文所述的生物过程中液体组合物的粘度的方法，其中与不含樟脑磺酸的相同液体组合物相比，或与不包含樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂(优选选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱)的相同液体组合物相比，过滤步骤中液体组合物的渗透通量增加。
[0158]
本发明的另一方面是该方法在如上所述的生物过程中的用途，其中与不含樟脑磺酸的相同液体组合物相比，或与不包含樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂(优选选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱)的相同液体组合物相比，过滤步骤中液体组合物的渗透通量增加。
[0159]
渗透通量的增加是指至少2％，优选至少5％，更优选至少10％，最优选10％至100％的百分比增加。
[0160]
本发明的另一方面是提供一种用于降低如上所述的生物过程中液体组合物粘度的方法，其中与不含樟脑磺酸的相同液体组合物相比，或与不包含樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂(优选选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱)的相同液体组合物相比，缓冲液更换和过滤器中体积减少后的蛋白质回收率增加。
[0161]
本发明的另一方面是该方法在如上所述的生物过程中的用途，其中与不含樟脑磺酸的相同液体组合物相比，或与不包含樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂(优选选自精氨
酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱)的相同液体组合物相比，缓冲液更换和过滤器中体积减少后的蛋白质回收率增加。
[0162]
缓冲液更换和过滤器中体积减少后蛋白质回收率的增加是指蛋白质回收率的至少1％，优选至少2％，更优选至少5％，最优选5％至20％的百分比增加。
[0163]
本发明的另一个方面是提供一种用于在上述生物过程中降低液体组合物粘度的方法，其中与不含樟脑磺酸的相同液体组合物相比，或与不包含樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂(优选选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱)的相同液体组合物相比，过滤步骤，优选其中蛋白质被浓缩的过滤步骤的处理时间减少。
[0164]
本发明的另一方面是该方法在如上所述的生物过程中的用途，其中与不含樟脑磺酸的相同液体组合物相比，或与不包含樟脑磺酸和至少一种阳离子赋形剂(优选选自精氨酸、葡甲胺、鸟氨酸和肉碱)的相同液体组合物相比，过滤步骤，优选其中蛋白质被浓缩的过滤步骤的处理时间减少。
[0165]
过滤步骤的处理时间的减少是指至少5％，优选至少10％，更优选至少25％，最优选25％至100％的百分比减少。
[0166]
在本发明的一个具体实施方案中，过滤步骤是切向流过滤(tff)。
[0167]
本发明的其他方面是提供用于实施本文所述方法的试剂盒。通常，用于实践的试剂盒适用于本发明的方法，并且部件的形式取决于它们的预期功能。
[0168]
通常，试剂盒经过包装并包括装有试剂的容器，其溶液体积将基于试剂盒额定的制剂量而变化。容器通常包括一种或多种可用于实施本发明方法的试剂。在某些实施方案中，试剂盒是分隔试剂盒，即，试剂盒包括包含在相同或分开的容器中的试剂。容器的示例包括但不限于小玻璃容器、塑料容器或塑料纸条。这些或其他小容器允许将试剂从一个隔间有效转移到另一个隔间。这样的容器可以包括接受测试样品的容器、含有本公开内容的蛋白质或蛋白质溶液的容器、含有材料的容器、含有洗涤试剂的容器和/或含有在试剂盒的应用中有用的试剂的容器。该试剂盒可以包括本文所述多肽的来源和浓缩物。对于更大规模的应用，试剂盒通常将包括类似的试剂和溶液，但量更大。
[0169]
本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包含本发明的液体蛋白质制剂，以及其施用说明，任选地带有容器、注射器和/或其他施用装置。本发明进一步提供了试剂盒，该试剂盒包含本发明的冻干蛋白质制剂(任选地在容器中)，以及关于其重构和施用的说明，任选地带有无菌稀释剂的小瓶，并且任选地带有注射器或其他施用装置。示例性容器包括小瓶、试管、瓶子、单腔或多腔预填充注射器或药筒，而且还包括96孔板，其包括位于孔中的即用型冷冻干燥或喷雾干燥的制剂。示例性施用装置包括注射器(有或没有针头)、输液泵、喷射注射器、笔式装置、透皮注射器或其他无针注射器。
[0170]
试剂盒通常还包括使用说明。这些说明通常适用于使最终用户能够进行所需的制备或测定。说明通常采用有形的表达方式，例如，描述至少一种制备或测定的试剂浓度、参数例如待混合的试剂和样品的相对量、试剂/样品混合物的维持或温育时间、温度要求或偏好等。说明可以印刷在试剂盒的外包装或内包装上、小册子、卡片或试剂盒内的其他纸上，和/或试剂盒中包含的容器或器皿的外表面上。
[0171]
虽然已经详细描述了本发明，但是将明显的是在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下可以进行修改和变化。此外，应当理解，本公开内容中的所有实例均作为
非限制性实例提供。
[0172]
溶液制剂的配制和冷冻干燥可以通过本领域技术人员已知的方法进行。
[0173]
本描述使本领域普通技术人员能够全面地实践本发明。即使没有进一步的评论，因此假设本领域的普通技术人员将能够在最广泛的范围内利用以上描述。
[0174]
尽管已经结合优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，本领域技术人员可以对本发明进行各种修改、添加和变更而不背离如所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围。特别地，本发明构思不限于实施例中所示的特定蛋白质，而是可以转移到如上定义的所有其他蛋白质。
[0175]
如果有任何不清楚的地方，可以理解的是，应该参考技术人员所引用和已知的出版物和专利文献。因此，所引用的文件被视为本说明书的公开内容的一部分并且通过引用并入本文。
[0176]
为了更好地理解和说明本发明，下面给出一些实施例，这些实施例都在本发明的保护范围内。这些实施例还用于举例说明可能的变体。
[0177]
此外，不言而喻，对于本领域普通技术人员而言，在给出的实施例和说明书的其余部分中，存在于组合物中的组分的量总和基于整个组合物仅达到100重量％或摩尔％，并且，即使在所示百分比范围内可能会出现更高的值，也不能超过这个百分比。除非另有说明，百分比数据因此是重量百分比或摩尔百分比，但在体积数据中显示的比率除外。
[0178]
本发明进一步提供了降低包含蛋白质的液体组合物的粘度的方法，其中该蛋白质是英夫利昔单抗。在本发明中，英夫利昔单抗被简称为“mabc”。优选地，药物制剂中的英夫利昔单抗浓度为122mg/ml至185mg/ml。
[0179]
由janssen biotech,inc.开发的英夫利昔单抗和由biogen和由celltrion(inflectra)开发的其生物仿制药用于治疗类风湿性关节炎、成人溃疡性结肠炎、斑块型银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人和儿童克罗恩病(剂量/用量：5mg/kg)。英夫利昔单抗是一种针对肿瘤坏死因子α(tnf-a)的单克隆抗体，用于治疗自身免疫性疾病。英夫利昔单抗通过以高亲和力结合可溶性和跨膜形式的tnfa来中和tnfa的生物活性，并抑制tnfa与其受体的结合。它由美国的强生全球服务公司(janssen global services,llc，“janssen”)、日本的三菱田边制药(mitsubishi tanabe pharma)、中国的西安杨森(xian janssen)、和默沙东(merck sharp&dohme，“msd”)和其他公司以商品名销售。在一些实施方案中，制剂包含的生物仿制药，例如remsima
tm
或inflectra
tm
。remsima
tm
由celltrion公司(celltrion,inc.，“celltrion”)开发，inflectra
tm
由英国赫升瑞公司(hospira inc.,uk)开发。目前英夫利昔单抗通过静脉输注以约3mg/kg至约10mg/kg范围内的剂量施用。
[0180]
本发明进一步提供了用于降低包含蛋白质的液体组合物的粘度的方法，其中该蛋白质是依洛尤单抗。在本发明中，依洛尤单抗被简称为“mabd”。优选地，药物制剂中的依洛尤单抗浓度为163mg/ml至204mg/ml。
[0181]
由amgen开发的依洛尤单抗用于治疗hefh、cvd，通过靶向pcsk9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型)降低低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)(剂量/用量：每月420mg)。
[0182]
本发明进一步提供了用于降低包含蛋白质的液体组合物的粘度的方法，其中该蛋白质是瑞利珠单抗。在本发明中，瑞利珠单抗被简称为“mabe”。优选地，药物制剂中的瑞利珠单抗浓度为178mg/ml至224mg/ml。
[0183]
由梯瓦制药(teva pharmaceuticals)开发的瑞利珠单抗用于严重哮喘发作(恶化)(剂量/用量：3mg/kg)。
[0184]
实施例：
[0185]
在实施例中，mab使用以下缩写：
[0186]
mabc：英夫利昔单抗
[0187]
mabd：依洛尤单抗
[0188]
mabe：瑞利珠单抗
[0189]
实施例1
[0190]
葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱和樟脑磺酸对高度浓缩的蛋白质溶液的作用：
[0191]
实施例1a)显示l-精氨酸、l-肉碱和樟脑磺酸而非l-鸟氨酸和葡甲胺降低分别处于98mg/ml和148mg/ml的mabc的粘度。
[0192]
实施例1b)显示葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱和樟脑磺酸降低处于170mg/ml和190mg/ml的mabd的粘度。
[0193]
实施例1c)显示葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱和樟脑磺酸降低处于179mg/ml和223mg/ml的mabe的粘度。
[0194]
在所有情况下，对照样品都是相应mab的市售制剂而不含降粘赋形剂。
[0195]
实施例1a
[0196]
l-精氨酸、l-肉碱和樟脑磺酸而非l-鸟氨酸和葡甲胺的粘度降低作用降低在ph7.2的磷酸盐缓冲液中配制的mabc的粘度。
[0197]
缓冲液制备
[0198]
通过适当混合磷酸二氢钠和磷酸氢二钠以产生7.2的ph并将所述混合物溶解在超纯水中来制备5mm磷酸盐缓冲液。使用henderson-hasselbalch方程确定所述比率。如有必要，使用hcl和naoh调节ph值。
[0199]
加入50mg/ml蔗糖和0.05mg/ml聚山梨醇酯80作为稳定剂。
[0200]
样品制备
[0201]
分别在ph7.2的磷酸盐缓冲液中制备150mm l-鸟氨酸、l-精氨酸、l-肉碱、葡甲胺和樟脑磺酸的赋形剂溶液。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0202]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积来制备含有所需赋形剂的浓缩mab溶液。随后将蛋白质分别稀释至98mg/ml和148mg/ml。
[0203]
粘度测量
[0204]
mvroc
tm
技术(rheo sense，san ramon，california usa)用于粘度测量。
[0205]
使用500μl注射器和3000s-1
剪切速率在20℃进行测量。使用了200μl的体积。所有样品一式三份测量。
[0206]
图1显示了在ph7.2的磷酸盐缓冲液中配制的mabc中的葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱、精氨酸和樟脑磺酸的粘度降低效果(实施例1a)。
[0207]
实施例1b
[0208]
葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱和樟脑磺酸降低处于170mg/ml和190mg/ml的mabd的粘度。
[0209]
缓冲液制备
[0210]
通过将1.2mg/ml冰醋酸与超纯水混合来制备20mm醋酸盐缓冲液。如有必要，使用hcl和naoh将ph值调节至5.0。
[0211]
添加0.1mg/ml聚山梨醇酯80作为稳定剂
[0212]
样品制备
[0213]
分别在ph5.0的醋酸盐缓冲液中制备150mm l-鸟氨酸、l-精氨酸、l-肉碱、葡甲胺和樟脑磺酸的赋形剂溶液。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0214]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积来制备含有所需赋形剂的浓缩mab溶液。随后将蛋白质分别稀释至169mg/ml和190mg/ml。
[0215]
粘度测量
[0216]
mvroc
tm
技术(rheo sense，san ramon，california usa)用于粘度测量。
[0217]
使用500μl注射器和对于169mg/ml的蛋白质溶液用3000s-1
的剪切速率和对于190mg/ml的蛋白质溶液用2000s-1
的剪切速率在20℃进行测量。使用了200μl的体积。所有样品一式三份测量。
[0218]
图2显示了在ph5.0的醋酸盐缓冲液中配制的mabd中的葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱、精氨酸和樟脑磺酸的粘度降低效果(实施例1b)。
[0219]
实施例1c
[0220]
葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱和樟脑磺酸降低处于179mg/ml和223mg/ml的mabe的粘度。
[0221]
缓冲液制备
[0222]
通过将醋酸钠和冰醋酸与超纯水以产生ph5.5的缓冲溶液的比例混合来制备20mm醋酸盐缓冲液。醋酸钠和冰醋酸的比例使用henderson-hasselbalch方程计算。如有必要，使用hcl和naoh调节ph值。添加70mg/ml蔗糖作为稳定剂
[0223]
样品制备
[0224]
分别在ph5.5的醋酸盐缓冲液中制备150mm l-鸟氨酸、l-精氨酸、l-肉碱、葡甲胺和樟脑磺酸的赋形剂溶液。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0225]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积来制备含有所需赋形剂的浓缩mab溶液。随后将蛋白质分别稀释至179mg/ml和223mg/ml。
[0226]
粘度测量
[0227]
mvroc
tm
技术(rheo sense，san ramon，california usa)用于粘度测量。
[0228]
使用500μl注射器和3000s-1
剪切速率在20℃进行测量。使用了200μl的体积。所有样品一式三份测量。
[0229]
图3显示了在ph5.5的醋酸盐缓冲液中配制的mabe中的葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱、精氨酸和樟脑磺酸的粘度降低效果(实施例1c)。
[0230]
实施例2
[0231]
l-精氨酸、l-肉碱、l-鸟氨酸和葡甲胺与樟脑磺酸的组合的效果。
[0232]
实施例2a)显示，当与樟脑磺酸组合时，葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱降低分别处于98mg/ml和148mg/ml的mabc的粘度。
[0233]
实施例2b)表明，当与樟脑磺酸组合时，葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱降低处于170mg/ml和190mg/ml的mabd的粘度。
[0234]
实施例2c)显示当与樟脑磺酸组合时，葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱降低处于179mg/ml和223mg/ml的mabe的粘度。
[0235]
实施例2d)显示了通过将l-精氨酸与樟脑磺酸组合对在ph7.2的磷酸盐缓冲液中配制的mabc的协同粘度降低。
[0236]
实施例2a
[0237]
缓冲液制备
[0238]
通过适当混合磷酸二氢钠和磷酸氢二钠以产生7.2的ph并将所述混合物溶解在超纯水中来制备5mm磷酸盐缓冲液。使用henderson-hasselbalch方程确定所述比率。如有必要，使用hcl和naoh调节ph值。加入50mg/ml蔗糖和0.05mg/ml聚山梨醇酯80作为稳定剂。
[0239]
样品制备
[0240]
分别在ph7.2的磷酸盐缓冲液中制备了补充有另外75mm樟脑磺酸的75mm l-鸟氨酸盐酸盐、l-精氨酸、l-肉碱、葡甲胺的赋形剂溶液。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0241]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积来制备含有所需赋形剂的浓缩mab溶液。随后将蛋白质分别稀释至98mg/ml和148mg/ml。
[0242]
粘度测量
[0243]
mvroc
tm
技术(rheo sense，san ramon，california usa)用于粘度测量。
[0244]
使用500μl注射器和3000s-1
剪切速率在20℃进行测量。使用了200μl的体积。所有样品一式三份测量。
[0245]
图4显示了在ph7.2的磷酸盐缓冲液中配制的mabc中的葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱在与樟脑磺酸组合时的粘度降低效果(实施例2a)。
[0246]
实施例2b
[0247]
缓冲液制备
[0248]
通过将1.2mg/ml冰醋酸与超纯水混合来制备20mm醋酸盐缓冲液。如有必要，使用hcl和naoh将ph值调节至5.0。
[0249]
添加0.1mg/ml聚山梨醇酯80作为稳定剂。
[0250]
样品制备
[0251]
分别在ph5.0的醋酸盐缓冲液中制备补充有另外75mm樟脑磺酸的75mm l-鸟氨酸盐酸盐、l-精氨酸、l-肉碱、葡甲胺的赋形剂溶液。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0252]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积来制备含有所需赋形剂的浓缩mab溶液。随后将蛋白质分别稀释至169mg/ml和190mg/ml。
[0253]
粘度测量
[0254]
mvroc
tm
技术(rheo sense，san ramon，california usa)用于粘度测量。
[0255]
使用500μl注射器和对于169mg/ml的蛋白质溶液用3000s-1
的剪切速率和对于190mg/ml的蛋白质溶液用2000s-1
的剪切速率在20℃进行测量。使用了200μl的体积。所有样品一式三份测量。
[0256]
图5显示了在ph5.0的醋酸盐缓冲液中配制的mabd中的葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱在与樟脑磺酸组合时的粘度降低效果(实施例2b)。
[0257]
实施例2c
[0258]
缓冲液制备
[0259]
通过将醋酸钠和冰醋酸与超纯水以产生ph5.5的缓冲溶液的比例混合来制备20mm醋酸盐缓冲液。醋酸钠和冰醋酸的比例使用henderson-hasselbalch方程计算。如有必要，使用hcl和naoh调节ph值。
[0260]
添加70mg/ml蔗糖作为稳定剂
[0261]
样品制备
[0262]
分别在ph5.5的醋酸盐缓冲液中制备补充有另外75mm樟脑磺酸的75mml-鸟氨酸、l-精氨酸、l-肉碱、葡甲胺的赋形剂溶液。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0263]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积来制备含有所需赋形剂的浓缩mab溶液。随后将蛋白质分别稀释至179mg/ml和223mg/ml。
[0264]
粘度测量
[0265]
mvroc
tm
技术(rheo sense，san ramon，california usa)用于粘度测量。
[0266]
使用500μl注射器和3000s-1
剪切速率在20℃进行测量。使用了200μl的体积。所有样品一式三份测量。
[0267]
图6显示了在ph5.5的醋酸盐缓冲液中配制的mabe中的葡甲胺、l-鸟氨酸、l-肉碱在与樟脑磺酸组合时的粘度降低效果(实施例2c)。
[0268]
实施例2d
[0269]
根据实施例1a)和2a)进行缓冲液制备、样品制备和粘度测量。
[0270]
图7显示了在ph7.2的磷酸盐缓冲液中配制的mabc中的l-精氨酸在与樟脑磺酸组合时的协同粘度降低效果(实施例2d)。“预期粘度-组合”对应于每种赋形剂l-鸟氨酸和l-精氨酸各自单独在75mm时的假定相加作用。测量的组合显示甚至更低的粘度，证明这两种赋形剂对处于148mg/ml的mabc的协同作用。
[0271]
实施例3
[0272]
实施例3显示樟脑磺酸及其与l-鸟氨酸或l-精氨酸的组合对mabc的蛋白质稳定性的作用。
[0273]
缓冲液制备
[0274]
通过适当混合磷酸二氢钠和磷酸氢二钠以产生7.2的ph并将所述混合物溶解在超纯水中来制备5mm磷酸盐缓冲液。使用henderson-hasselbalch方程确定所述比率。如有必要，使用hcl和naoh调节ph值。加入50mg/ml蔗糖和0.05mg/ml聚山梨醇酯80作为稳定剂。
[0275]
样品制备
[0276]
在ph7.2的磷酸盐缓冲液中制备含有150mm l-鸟氨酸、l-精氨酸或樟脑磺酸的赋
形剂溶液。还分别在ph7.2的磷酸盐缓冲液中制备了补充有另外的75mm樟脑磺酸的75mm l-鸟氨酸盐酸盐或l-精氨酸。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0277]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积来制备含有所需赋形剂的浓缩mab溶液。随后将该蛋白质稀释至约80mg/ml。
[0278]
使用注射器过滤器(millex gv，0.22μm，pvdf，art.no.:slgv013sl)对样品进行灭菌，并分装在预先冲洗和灭菌的压盖式小瓶中。将小瓶压盖并在40℃/75％rh储存28天。
[0279]
单体含量分析
[0280]
使用连接到agilent 1290infinity uhplc系统的aquity uplc protein beh sec柱通过尺寸排阻色谱法测定单体含量。在30℃，用含有10％有机溶剂的钾盐洗脱液恒溶剂模式进行尺寸分离。作为标准(100％)，使用了mabc(1mg/ml)的无应力样品。样品稀释至1mg/ml用于分析。
[0281]
图8显示了在40℃/75％rh条件下储存28天的有或没有赋形剂的磷酸盐缓冲液(ph7.2)中包含约80mg/ml mabc的溶液的残留单体含量。当使用樟脑磺酸与l-精氨酸或l-鸟氨酸的组合时而非当酸是唯一的赋形剂时，蛋白质稳定性受到较小的负面影响。
[0282]
实施例4：离心过滤装置的益处
[0283]
缓冲液制备
[0284]
使用柠檬酸一水合物并将其溶解在超纯水中制备10mm柠檬酸盐缓冲液。如有必要，使用hcl和naoh将ph值调节至5.5。添加0.25mg/ml聚山梨醇酯80作为稳定剂。
[0285]
樟脑磺酸(csacid)、鸟氨酸(orn或om)、精氨酸(arg或ag)、肉碱(car)和葡甲胺(meg或mg)的赋形剂溶液以150mm的浓度在ph5.5的柠檬酸盐缓冲液中制备。以各自75mm或各自150mm的浓度制备含有这些赋形剂中的两种的组合。
[0286]
样品制备
[0287]
含有约14.7mg/ml的西妥昔单抗(cetuximab)溶液用作起始材料。其中，假设高达20％的样品损失，计算出足够的体积以在500μl样品中实现超过120mg/ml的最终浓度。
[0288]
蛋白质浓度测量
[0289]
使用应用朗伯比尔定律的吸收光谱测定蛋白质浓度。当赋形剂本身在280nm处具有强吸光度时，使用bradford测定。
[0290]
浓缩的蛋白质溶液被稀释，以使它们的预期浓度在测量中处于0.3至1.0mg/ml。
[0291]
对于吸收光谱法，使用kinetic(eppendorf，hamburg，germany)在280nm处测量280nm处的吸光度，使用蛋白质消光系数a0.1％，280nm＝1.4。
[0292]
对于在280nm处吸收光的赋形剂，使用bradford测定确定蛋白质浓度。因此，使用了来自thermo scientific
tm
(thermo fisher，waltham，massachusetts，usa)的试剂盒以及通过使用应用朗伯比尔定律的吸收光谱制备的西妥昔单抗标准品。使用multiskan
tm wellplatereader(thermo fisher，waltham，massachusetts，usa)在595nm处测量吸光度。通过从125到1500μg/ml的标准曲线的适当多项式回归确定蛋白质浓度。
[0293]
体积测量
[0294]
使用适当大小的容量瓶测量渗透体积。
[0295]
对于离心过滤器单元，在离心后将渗透液转移到容量瓶中。对于
搅拌池实验，渗透液直接收集在这样的一个搅拌池中。
[0296]
使用适当大小的e3x(eppendorf，hamburg，germany)和combitips测量浓缩蛋白质溶液的体积。
[0297]
缓冲液交换和体积减少
[0298]
使用具有30kda mwco的离心过滤器将原始缓冲液交换为含有相关赋形剂的缓冲液并减少溶液的体积。
[0299]
使用五个透析体积(diavolume)将原始缓冲液交换为含有相关赋形剂的缓冲液。
[0300]
为了测量渗透通量，将离心过滤器以2000xg离心15分钟，并如上文所述测量体积(重复四次并计算平均值)。
[0301]
为了达到最终浓度，离心过滤器以小时间步长进行离心，并在达到500μl标记时表示累积持续时间。
[0302]
图9至图11突出了由增加的渗透通量表明的过程改进。
[0303]
发现在所述实验条件下，150mm的每种赋形剂增加了流通液。使用包含75mm csacid和更多阳离子赋形剂的组合也增加了流通液，特别是ag/csacid组合。
[0304]
发现当个体赋形剂的浓度增加到150mm时，所有测试的组合都显著增加了流通液。
[0305]
使用离心过滤器表征过程益处的另一个方面是达到一定体积所需的时间。这方面与平均渗透通量相关但不同于平均渗透通量，因为此处赋形剂在较高蛋白质浓度下的作用对该参数具有更强的影响。
[0306]
图12至图14分别显示了通过使用75mm阳离子或阴离子赋形剂可实现的过程时间的减少。
[0307]
对于每种列出的赋形剂，可以观察到减少的处理时间。图13和14突出了赋形剂组合对处理时间的影响。
[0308]
列出的每种组合都减少了处理时间，因此对过程经济性具有有益的影响。
[0309]
除了处理时间之外，对过程经济性至关重要的另一个方面是过程效率。该参数可以在这个实验设置中通过蛋白质的回收率来评估。回收率定义为在溶液体积减少到0.5ml后可以从amicon过滤器中回收的蛋白质的分数。
[0310]
图15和图16分别显示了75mm阳离子和/或阴离子赋形剂对蛋白质回收率的影响。
[0311]
发现在所有测试条件下，通过添加根据本发明的降粘赋形剂提高了回收率。
[0312]
实施例5：搅拌池的益处
[0313]
在离心过滤器的处理中具有积极作用的赋形剂和组合用于搅拌池过滤。旋转柱浓缩器由离心力驱动，而搅拌池由以氮气或空气流形式施加到溶液的背压操作。该模型系统经常用于测试溶液的可加工性，并且与以前使用的离心过滤器相比是更接近的模型系统。
[0314]
缓冲液制备
[0315]
参见实施例1。
[0316]
样品制备
[0317]
假设损失高达20％，计算抗体储备溶液的体积以产生至少10ml的包含25mg/ml西
妥昔单抗的溶液。
[0318]
蛋白质浓度测量
[0319]
参见实施例1。
[0320]
体积测量
[0321]
参见实施例1。
[0322]
缓冲液交换和体积减少
[0323]
对于搅拌池设置，最大容量为50ml的模型配备了具有30kda的nmwl和13.4cm2的活性膜面积的超滤盘式过滤器。
[0324]
将相应体积的西妥昔单抗储备溶液填充到搅拌池中，并将相应的缓冲液添加到50ml标记处。
[0325]
使用五个透析体积将原始缓冲液交换为含有相关赋形剂或组合的缓冲液。
[0326]
为了测量渗透通量，以200rpm的混合速度(使用磁力搅拌器板)在搅拌池上施加4bar的压力持续30分钟(四次)。
[0327]
对于最终浓缩时间，用各自的缓冲液再次将池填充至50ml标记并以200rpm搅拌器速度施加4bar压力。在达到10ml标记时，表示持续时间，过程停止并且如上所述测量所得抗体溶液的体积和浓度。
[0328]
与上一节一样，首先评估制剂对平均渗透通量的影响。结果如图17所示。
[0329]
对于每种使用的赋形剂和赋形剂组合，观察到提高的渗透通量。
[0330]
下一个要分析的参数是处理时间。在此，测量直到制剂的体积减少到10ml的时间。结果如图18所示。
[0331]
对于本文使用的每种赋形剂和赋形剂组合，观察到处理时间的减少。最后，确定了来自搅拌池的蛋白质回收率形式的过程产率，如图19所示。
[0332]
对于所有测试条件，观察到提高的回收率。
[0333]
实施例5：使用amicons对英夫利昔单抗的处理
[0334]
缓冲液制备
[0335]
通过适当混合磷酸二氢钠和磷酸氢二钠以产生7.2的ph并将所述混合物溶解在超纯水中来制备5mm磷酸盐缓冲液。使用henderson-hasselbalch方程确定所述比率。如有必要，使用hcl和naoh调节ph值。
[0336]
加入50mg/ml蔗糖和0.05mg/ml聚山梨醇酯80作为稳定剂。
[0337]
样品制备
[0338]
如果没有另外说明，则在ph7.2的磷酸盐缓冲液中以150mm的浓度制备含有一种化合物的赋形剂溶液。以12mm浓度制备叶酸。焦磷酸硫胺素以75mm浓度制备。如有必要，使用hcl或naoh调节ph。
[0339]
在两种赋形剂的组合中，以各自75mm的浓度制备各自化合物。叶酸以12mm用在组合中。
[0340]
使用离心过滤器(amicon，30kda mwco)制备含有所需赋形剂的浓缩英夫利昔单抗溶液，以用含有相关赋形剂的缓冲液交换原始缓冲液并减少溶液体积。
[0341]
使用含有10mg/ml英夫利昔单抗的溶液作为储备材料，并计算起始体积，使得在0.5ml中达到至少160mg/ml的浓度。
[0342]
蛋白质浓度测量
[0343]
使用bradford测定确定蛋白质浓度。
[0344]
因此，使用了来自thermo scientific
tm
(thermo fisher，waltham，massachusetts，usa)的试剂盒以及通过应用朗伯比尔定律的吸收光谱制备的英夫利昔单抗标准品。使用multiskan
tm wellplatereader(thermo fisher，waltham，massachusetts，usa)在595nm处测量吸光度。通过从125到1500μg/ml的标准曲线的适当多项式回归确定蛋白质浓度。
[0345]
图20和图21描绘了直到达到约0.5ml体积的处理时间。
[0346]
使用本研究中使用的每种赋形剂，处理时间可以减少至少20分钟，在某些情况下减少多至90分钟。图21描述了使用赋形剂组合(每种75mm)可以达到的时间减少。
[0347]
当amicon过滤器用作模型时，使用降粘赋形剂组合可减少英夫利昔单抗的处理时间。如前所述，本文所示的过程益处可以转化为改进的可加工性，即使是在使用更真实的模型例如tff时。
[0348]
发现：
[0349]
·
l-精氨酸、l-鸟氨酸、l-肉碱、葡甲胺和樟脑磺酸降低高度浓缩的蛋白质溶液的粘度。
[0350]
·
与l-精氨酸、l-鸟氨酸、l-肉碱、葡甲胺组合的樟脑磺酸降低高度浓缩的蛋白质溶液的粘度。
[0351]
·
l-精氨酸和樟脑磺酸的组合比单独的两种赋形剂的总和实现的理论降低更强烈地降低粘度(协同组合)。
[0352]
·
关于粘度降低潜力，与樟脑磺酸为唯一赋形剂时相比，樟脑磺酸与l-精氨酸或l-鸟氨酸组合使用对蛋白质稳定性的负面影响较小。
[0353]
·
使用离心过滤器的渗透通量通过樟脑磺酸以及樟脑磺酸与l-鸟氨酸、l-精氨酸、l-肉碱和葡甲胺的组合增加。增加离心过滤器中渗透通量的赋形剂和组合也可以增加搅拌池中的这种通量。
[0354]
·
与不含赋形剂的样品相比，通过樟脑磺酸和樟脑磺酸与l-鸟氨酸、l-精氨酸、l-肉碱和葡甲胺的组合可以减少达到最终蛋白质浓度的持续时间。
[0355]
·
与不含赋形剂的样品相比，通过樟脑磺酸以及樟脑磺酸与l-鸟氨酸、l-精氨酸、l-肉碱和葡甲胺的组合可以提高缓冲液更换和体积减少后的抗体的回收率。在离心过滤器中缓冲液交换和体积减少后增加蛋白质回收率的赋形剂和组合也可以在搅拌池中增加蛋白质回收率。