一种酶法制备N4-OH-CMP的方法与流程

一种酶法制备n4-oh-cmp的方法
技术领域
1.本发明属于酶催化技术领域，更具体的涉及酶催化磷酸化反应的方法。


背景技术：

2.β-d-n4-羟基胞苷-5
’‑
单磷酸脂(cas：4988-54-9，简写：n4-oh-cmp)是一种广谱抗病毒药，由于其是抗新冠药n-羟基胞苷(cas：3258-02-4)的磷酸化结构，更有利于体内的吸收利用，因此在治疗新冠方面，效果更佳。
3.目前n4-oh-cmp的制备方法为化学制备法，原料成本高；含盐量大，不利于纯化，尚无报道酶法合成n4-oh-cmp的方法。


技术实现要素：

4.本发明提出了一种酶法催化羟甲基结构的化合物制备磷酸酯的方法，尤其是酶催化n-羟基胞苷的磷酸化制备n4-oh-cmp的方法，及其纯化n4-oh-cmp的方法。本发明方法底物转化率高，选择性高，产物易纯化。
5.本发明是通过如下技术方案实现上述目的的，一种酶法催化制备磷酸酯的方法，将磷酸根供体、金属离子加入水中，然后调节ph后加入酶、羟甲基结构的化合物酶催化反应得产物；所述酶为激酶(又称为磷酸化酶或磷酸转移酶)。
6.优选地，所述羟甲基结构的化合物为呋喃果糖或吡喃果糖中一个或多个羟基被取代的化合物，进一步优选为呋喃果糖中的一个羟基被取代的化合物。
7.优选地，所述呋喃果糖中的一个羟基被取代的化合物为n-羟基胞苷；即将磷酸根供体、金属离子加入水中，然后调节ph后加入酶、n-羟基胞苷，酶催化反应得产物n4-oh-cmp。
8.反应方程式如下：
[0009][0010]
优选地，所述磷酸根供体包括atp、多聚磷酸、磷酸盐，所述磷酸盐为三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠等；
[0011]
优选地，所述金属离子包括mg
2
或mn
2
；浓度为反应体系质量的0.1-2％；
[0012]
优选地，所述酶为激酶(又称为磷酸化酶或磷酸转移酶)；所述的酶优选的为nrk1(nicotinamide riboside kinase 1(homo sapiens))和nrk2(nicotinamide riboside kinase 2(homo sapiens))；所述的激酶(又称为磷酸化酶或磷酸转移酶)的添加形式为酶液、酶粉、固定化酶或未破碎菌体；所述酶液加入量为反应体系质量的5-20％。
[0013]
优选地，所述酶为nrk2(nicotinamide riboside kinase 2(homo sapiens))。尤
其是采用nrk2催化n-羟基胞苷制备n4-oh-cmp时，收率较nrk1体现显著提高，起到了意料不到的技术效果。
[0014]
优选地，所述酶催化反应的反应温度为10-60℃，进一步优选为25-40℃；
[0015]
优选地，所述磷酸化反应的反应时间为1-24h。
[0016]
优选地，所述酶催化反应得产物后采用离子交换树脂纯化；进一步优选地所述离子交换树脂包括强阴离子交换树脂和弱阳离子交换树脂；所述强阴离子交换树脂为d201、201*7；所述弱阳离子交换树脂为d113、110。
[0017]
3、本发明所产生的技术效果。
[0018]
(1)本发明提供了酶法合成n4-oh-cmp方法，底物转化率可达95％以上。
[0019]
(2)本发明提供的纯化n4-oh-cmp方法可以获得纯度98％以上的纯品，回收率95％以上。
附图说明
[0020]
图1为n-羟基胞苷酶催化合成n4-oh-cmp反应式。
[0021]
图2为n-羟基胞苷与n4-oh-cmp液相检测谱图。
具体实施方式
[0022]
本发明中nrk1和nrk2的蛋白序列如下：
[0023]
nrk1(nicotinamide riboside kinase 1(homo sapiens))蛋白序列mktfiigisg vtnsgkttla knlqkhlpnc svisqddffk peseietdkn gflqydvlea lnmekmmsai scwmesarhs vvstdqesae eipiliiegf llfnykpldt iwnrsyflti pyeeckrrrs trvyqppdsp gyfdghvwpm ylkyrqemqd itwevvyldg tkseedlflq vyedliqela kqkclqvta nrk2(nicotinamide riboside kinase 2(homo sapiens))蛋白序列mklivgiggm tnggkttltn sllralpncc vihqddffkp qdqiavgedg fkqwdvlesl dmeamldtvq awlsspqkfa rahgvsvqpe asdthillle gfllysykpl vdlysrryfl tvpyeeckwr rstrnytvpd ppglfdghvw pmyqkyrqem eangvevvyl dgmksreelf revlediqns llnrsqesap sparpartqg pgrgcghrta rpaasqqdsm
[0024]
本发明中hplc检测方法如下
[0025]
液相色谱仪：安捷伦1260；色谱柱：月旭xtimate-c18；检测波长：254nm；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；流动相：tris-醋酸缓冲液(25mmol/l，ph7.0)，按表a中程序进行梯度洗脱
[0026]
表a流动相梯度方法
[0027]
时间/min甲醇tris-醋酸缓冲液0.002986.0059511.00109016.00208016.5029820.00298
[0028]
反应酶体系筛选与优化
[0029]
实例1：称取三聚磷酸钠284mg，六水合氯化镁30mg，溶于9ml水中；用磷酸或盐酸溶液调ph至5.5，后加入100mg n-羟基胞苷，1ml nrk1酶液，30℃反应3h，转化率5.1％。
[0030]
实例2：称取多聚磷酸261mg，六水合氯化镁30mg，溶于9ml水中；用1m氢氧化钠溶液调ph至5.5，后加入100mg n-羟基胞苷，1ml nrk1酶液，30℃反应3h，转化率10.7％。
[0031]
实例3：称取六偏磷酸钠471mg，六水合氯化镁15mg，溶于9ml水中；用1m氢氧化钠溶液调ph至5.5，后加入100mg n-羟基胞苷，1ml nrk2酶液，30℃反应3h，转化率2.3％。
[0032]
实例4：称取焦磷酸钠471mg，六水合氯化镁15mg，溶于9ml水中；用磷酸或盐酸溶液调ph至5.5，后加入100mg n-羟基胞苷，1ml nrk2酶液，30℃反应3h，转化率15.0％。
[0033]
实例5：称取atp 212mg，六水合氯化镁30mg，溶于9ml水中；用1m氢氧化钠水溶液调ph至5.5，后加入100mg n-羟基胞苷，1ml nrk2酶液，30℃反应2.5h，转化率27.2％。
[0034]
实例6：称取atp 212mg，六水合氯化镁30mg，溶于9ml水中；用1m氢氧化钠水溶液调ph至5.5，后加入100mg n-羟基胞苷，1ml nrk2酶液，30℃反应2.5h，转化率67.1.3％；反应时间延长至5h，转化率77.1％。
[0035]
实例7：称取atp 212mg，六水合氯化镁30mg，溶于8ml水中；用1m氢氧化钠水溶液调ph至5.5，后加入100mg n-羟基胞苷，2ml nrk2酶液，30℃反应2.5h，转化率90.1％；延长反应时间至5h，转化率95.7％。
[0036]
其反应过程hplc检测谱图如图2所示，n-羟基胞苷出峰时间10.5min，n4-oh-cmp出峰时间3.5min。
[0037]
n4-oh-cmp纯化实施例
[0038]
纯化实例1：n4-oh-cmp反应液(实例7方法所得)除蛋白后上样d201树脂(柱体积500ml)，上样总量(51.2g)，n4-oh-cmp含量19.5％，纯水洗脱，流速0.5bv/h；d201树脂为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。洗脱参数如下：
[0039]
表1 n4-oh-cmp过d201树脂洗脱液参数汇总
[0040]
编号接收体积(ml)纯度(％)峰面积120000220015.1121320078.27822420081.31207520090.597620000
[0041]
收集表1中编号为3-5杯洗脱液，旋蒸浓缩至49.7g。上样d113树脂(500ml)，纯水洗脱，流速0.5bv/h；d113树脂是在大孔结构的丙烯酸共聚体上带有羧酸基(-cooh)的阳离子交换树脂。洗脱参数如下：
[0042]
表2 n4-oh-cmp过d201树脂后再过d113树脂洗脱液参数汇总
[0043][0044][0045]
收集表2中编号为3-7杯洗脱液，合并浓缩，检测纯度为91.7％，产品回收率79.8％。
[0046]
纯化实例2：n4-oh-cmp反应液(实例7方法所得)除蛋白后上样201*7树脂(柱体积500ml)，上样总量(55.3g)，n4-oh-cmp含量19.5％，纯水洗脱，流速0.5bv/h；201*7树脂(717树脂)是交联为7％的苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有季铵基[-n(ch3)3oh]的阴离子交换树脂。洗脱参数如下：
[0047]
表3 n4-oh-cmp过201*7树脂洗脱液参数汇总
[0048]
编号接收体积(ml)纯度(％)峰面积120000220018.787320085.610230420087.91050520092.349620000
[0049]
收集表3中编号为3-4杯洗脱液，旋蒸浓缩至43.0g。上样110树脂(500ml)，110树脂为凝胶型阳离子交换树脂，骨架为丙烯酸系连接-coo-基团，纯水洗脱，流速0.5bv/h。洗脱参数如下：
[0050]
表4 n4-oh-cmp过201*7树脂后再过110树脂洗脱液参数汇总
[0051]
编号接收体积(ml)纯度(％)峰面积120000220095.621
320098.214908420099.025105200100356620000
[0052]
收集表4中编号为3-4杯洗脱液，合并浓缩，检测纯度为98.2％，产品回收率95.7％。
[0053]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。