一种用于治疗肿瘤的药物组合及其应用的制作方法

1.本发明涉及肿瘤治疗领域，特别涉及一种基于toll样受体激动剂的用于治疗眼内肿瘤的药物组合及其应用。


背景技术：

2.葡萄膜黑色素瘤(um)是成人中最常见的原发性眼内恶性肿瘤，占所有癌症死亡的1％。um来自葡萄膜中的黑色素细胞，包括眼睛前房的虹膜、睫状体和眼后房脉络膜。尽管局部治疗充分，但5年总生存率低于60％。其原因主要是um的转移行为，最初是血行播散和转移至肝脏的倾向。一旦发生转移，预期寿命缩短至不到6个月。然而，传统疗法的5年生存率仍然很差。由于眼睛已被证明是一种特权免疫器官并为um提供免疫逃逸机制，因此重新激活癌细胞中的免疫系统至关重要。
3.最近，临床前研究提出了溶瘤病毒在治疗um方面的治疗意义。溶瘤腺病毒已被研究为一种新的治疗方法。然而，与其他溶瘤病毒相比，它的效果较差。还有研究表明高效溶瘤单纯疱疹病毒1型(ohsv-1)作为um治疗的新型治疗候选药物，参考文献：s.liu,j.zhang,s.fang,q.zhang,g.zhu,y.tian,m.zhao,and f.liu,macrophage polarization contributes to the efficacy of an oncolytic hsv-1targeting human uveal melanoma in a murine xenograft model.exp eye res202(2021)108285.；s.liu,j.zhang,s.fang,x.su,q.zhang,g.zhu,l.zhu,m.zhao,and f.liu,antitumor efficacy of oncolytic hsv-1expressing cytosine deaminase is synergistically enhancedby dpd down-regulation and emt inhibition in uveal melanoma xenograft.cancer lett 495(2020)123-134.；s.liu,f.liu,m.zhao,and j.zhang,antitumor efficacy of oncolytic herpes virus type 1armed with gm-csf in murine uveal melanoma xenografts.cancer manag res 12(2020)11803-11812.。
4.以溶瘤单纯疱疹病毒作为病毒载体、插入有胞嘧啶脱氨酶(cd)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)在内的重组病毒被证明对um的治疗有效。溶瘤病毒载体缺失神经毒力基因icp34.5和抗原呈递抑制剂icp47，这种基因工程病毒能够激活免疫细胞并刺激全身抗肿瘤作用，参考文献：j.m.markert,a.malick,d.m.coen,and r.l.martuza,reduction and elimination of encephalitis in an experimental glioma therapy model with attenuated herpes simplex mutants that retain susceptibility to acyclovir.neurosurgery 32(1993)597-603.；b.l.liu,m.robinson,z.q.han,r.h.branston,c.english,p.reay,y.mcgrath,s.k.thomas,m.thornton,p.bullock,c.a.love,and r.s.coffin,icp34.5 deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic,immune stimulating,and anti-tumour properties.gene ther 10(2003)292-303.；r.tomazin,n.e.van schoot,k.goldsmith,p.jugovic,p.sempe,k.fruh,and d.c.johnson,herpes simplex virus type 2 icp47 inhibits human tap but notmouse tap.j virol 72(1998)2560-3.。以前的研究表明hsv-1感染导致星形胶质细胞中tlr3表达
的上调，参考文献：c.farina,m.krumbholz,t.giese,g.hartmann,f.aloisi,and e.meinl,preferential expression and function of toll-like receptor 3 in human astrocytes.j neuroimmunol 159(2005)12-9.。但提高葡萄膜黑色素瘤患者的生存期始终是科学家们致力解决的问题，因此，迫切需要寻找新的治疗um以延长患者生存期的方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于治疗肿瘤的药物组合，所述肿瘤为眼内肿瘤，特别指葡萄膜黑色素瘤。将tlr3激动剂与溶瘤病毒结合，重新激活tlr3介导的信号通路，提高了抗肿瘤能力和效果。
6.为了实现上述目的，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合，包括：溶瘤病毒和toll样受体激动剂，其中，所述溶瘤病毒为野生型单纯疱疹病毒或经基因工程改造的重组单纯疱疹病毒，所述肿瘤为眼内肿瘤，所述toll样受体激动剂为tlr3激动剂。
7.本发明所述的溶瘤病毒是指对眼内肿瘤特别是葡萄膜黑色素瘤具有一定溶瘤作用且会下调tlr3表达的溶瘤病毒，比如可以是溶瘤性1型单纯疱疹病毒或在所述溶瘤性1型单纯疱疹病毒基础上进行基因工程改造后得到的重组病毒。溶瘤性1型单纯疱疹病毒缺失神经毒力基因icp34.5和抗原呈递抑制剂icp47；当然本发明的溶瘤病毒还可以是缺失神经毒力基因icp34.5和抗原呈递抑制剂icp47、但存在糖蛋白us11，且编码胞嘧啶脱氨酶的基因插入神经毒力基因icp34.5位置的重组溶瘤单纯疱疹病毒等。
8.本发明所述的tlr3激动剂可以是市场有售的任何刺激tlr3表达的物质，也可以是通过基因编辑等手段刺激tlr3表达量上调的基因工具，该激动剂能够激活tlr3介导的信号通路。
9.在上述药物组合，作为一种优选实施方式，所述tlr3激动剂为poly(i:c)、rgc100、arnax中的至少一种。
10.本发明优选使用poly(i:c)作为tlr3激动剂，即聚肌苷酸-聚胞苷酸，是一种合成的双链rna(dsrna)类似物，poly(i:c)可被tlr3识别，诱导的活化和细胞因子的产生，引起下游细胞因子的释放和基因的转录，其具有双重作用，不仅能诱导dc细胞成熟，增强t细胞反应，还能直接促进肿瘤细胞凋亡。
11.由于三种激动剂起作用的原理类似，因此，下面仅以poly(i:c)作为实例阐述。
12.在上述药物组合，作为一种优选实施方式，所述眼内肿瘤为葡萄膜黑色素瘤。
13.在上述药物组合，作为一种优选实施方式，所述药物组合以溶瘤病毒和toll样受体激动剂的混合物的形式存在；优选地，所述药物组合还包括药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合的剂型为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或滴剂。
14.所述药物组合以溶瘤病毒和toll样受体激动剂各自独立包装的形式存在。在使用时，二者是分别施予到肿瘤细胞、肿瘤组织或者患者体内的。
15.本发明还提供了溶瘤病毒和toll样受体激动剂的组合在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中，所述溶瘤病毒为野生型单纯疱疹病毒或经基因工程改造的重组单纯疱疹病毒，所述toll样受体激动剂为tlr3激动剂，所述肿瘤为眼内肿瘤。
16.在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述溶瘤病毒为溶瘤性1型单纯疱疹病毒，或在所述溶瘤性1型单纯疱疹病毒基础上进行基因工程改造后得到的重组病毒。
17.在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述眼内肿瘤为葡萄膜黑色素瘤。
18.在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述tlr3激动剂为poly(i:c)或/和rgc100。
19.本发明具有如下有益效果：
20.本发明提供了一种新的肿瘤治疗组合，通过将tlr3激动剂poly(i:c)与ohsv-1结合，重新激活tlr3介导的信号通路并进一步提高巨噬细胞的抗肿瘤能力。rnaseq分析和体外分子生物学分析表明，联合治疗增强um细胞杀伤能力和巨噬细胞的抗肿瘤功效。此外，本发明还确定了在极化和增殖中刺激巨噬细胞，证明了ohsv-1与poly(i:c)联合治疗um的价值，可产生免疫反应并增强抗肿瘤功效。
附图说明
21.图1.ohsv-1诱导的负调节和tlr3下调的结果图。
22.a：用或不用ohsv-1(moi＝0.1，48小时)处理的mum2b和92.1(也可表示为92-1)um细胞的rnaseq分析，差异调节的基因使用metascape鉴定了最丰富的簇。b：ohsv-1感染相关基因中的分类基因，其中用箭头标记基因的上调或下调，颜色深浅表示上调或下调的程度。c：在mum2b、92.1和mp41细胞中有或没有ohsv-1处理的tlr3表达的蛋白质印迹分析，β-肌动蛋白(actin)用作内标。
23.图2.tlr3在不同um中表达并与密切相关性的图片。
24.a：梭型(spindle)、上皮型(epithelioid)和混合型(mix)um石蜡包埋切片中tlr3(即白色亮点)表达的代表性免疫荧光，比例尺，20μm。b：使用timer平台的tcga数据库分析显示tlr3和mrna水平之间的相关性，gapdh用作标准化基因。
25.图3.联合治疗重新激活了tlr3介导的信号通路，并增强了um的抗肿瘤功效分析图。a&b：在poly(i:c)处理后，在arpe-19和mum2b细胞中进行细胞活力测定。c：用ohsv-1(实线表示)或ohsv-1 poly(i:c)联合(虚线表示)处理的mum2b细胞的细胞活力测定。d：对照、ohsv-1、poly(i:c)和ohsv-1 poly(i:c)组中mum2b、92.1和mp41细胞的细胞活力比较。e：对照(control)、ohsv-1、poly(i:c)和ohsv-1 poly(i:c)(缩写为o p)组中tlr3和表达的蛋白质印迹分析。使用了三种细胞系(mum2b、92.1和mp41)，β-肌动蛋白(actin)用作内标。
具体实施方式
26.为了能够更加清楚地理解本发明的技术内容，下面将结合附图和试验例对本发明的技术方案进行详细说明。应理解，这些具体实施例仅仅是用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
27.下面实施例中未注明的条件和方法，通常按照常规条件和方法操作，可参照sambrook等人编著的《分子克隆实验指南》中所述条件，或者按照销售厂商建议的试验条件和操作说明进行。未说明的化学试剂为常规市售产品。
28.试验材料
29.聚肌苷酸：聚胞苷酸(poly(i：c))和佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸(pma)的钠盐
购自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。
30.抗体及其各自的来源如下：抗tlr3单克隆抗体(ab13915，abcam，cambridge，uk)、抗单克隆抗体(4814，cell signaling technology，beverly，ma，usa)、抗单克隆抗体(2856，cell signaling technology)，抗β-肌动蛋白单克隆抗体(a5441，sigma-aldrich)，辣根过氧化物酶(hrp)连接的抗兔igg(#7074)抗体和抗小鼠igg(sc-2371)抗体分别来自cell signaling technology和santa cruz biotechnology(美国德克萨斯州达拉斯)。
31.细胞培养和分化本实验中使用了三种人um细胞系、两种人单核细胞/小胶质细胞系和一种人视网膜色素上皮细胞系。92.1细胞(人眼葡萄膜黑色素瘤细胞)是马萨诸塞州总医院的vavvas demetrios教授和efstathiou nikolaos的赠送。mum2b(人侵袭性葡萄膜黑色素瘤细胞)、mp41(人葡萄膜黑色素瘤细胞)和arpe-19(人视网膜上皮细胞)购自美国典型培养物保藏中心(atcc，rockville，md，usa)。mum2b和arpe-19在含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基中培养。92.1在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中培养。mp41细胞在含有20％胎牛血清的rpmi-1640培养基中培养。所有细胞均在37℃、含5％二氧化碳的环境中培养。
32.溶瘤病毒溶瘤病毒ohsv-1(即溶瘤性1型单纯疱疹病毒)由北京神经外科研究所张俊文及其同事提供，也可通过改造市售的病毒株hsv-1(f)来获得，即每个编码域的1,000bpγ134.5基因和icp47基因的拷贝被删除。所有病毒都在vero细胞中生长和滴定。病毒保存于-80℃，避免冻融循环。
33.肿瘤标本梭型(spindle)、上皮型(epithelioid)和混合型(mix)um石蜡包埋切片，根据赫尔辛基宣言的指导原则，获了得不同病理类型的肿瘤标本。本发明数据统计分析。
34.每个实验至少重复3次。使用学生t检验进行统计分析。所有数据均表示为平均值
±
标准差。graphpad prism 7.0用于准备所有图表并进行统计分析。p《0.05被认为是显著的。星号用于表示图中的显著性：*,p《0.05；**，p《0.005；***，p《0.0005；****，p《0.00005；ns，没有意义。
35.实施例1在rna水平和蛋白水平验证ohsv-1处理下调um细胞中的tlr3表达的试验
36.试验方法
37.(1)将mum2b细胞在含有10wt％胎牛血清的高糖dmem培养基(液体)中培养，培养至1
×
106细胞/皿。92.1在含有10wt％胎牛血清的rpmi-1640培养基中培养，培养至1
×
106细胞/皿；mp41细胞在含有20wt％胎牛血清的rpmi-1640培养基中培养，培养至1
×
106细胞/皿。
38.(2)取上述培养后的mum2b、92.1细胞培养液各7ml，然后分别向其中加入ohsv-1，感染指数moi＝0.1，然后于37℃、含5％二氧化碳的环境中继续孵育48小时，ohsv-1处理后的mum2b、92.1细胞用于转录组重测序。不同细胞的处理分别同时设置不加入ohsv-1处理的对照(control)。每个样品三个重复，共12个样品。
39.(3)使用trizol试剂(invitrogen，carlsbad，ca，usa)从ohsv-1处理后的mum2b、92.1细胞中提取总rna。按照制造商的说明，使用illumina(美国加利福尼亚州圣地亚哥)的neb next ultra
tm
rna文库制备试剂盒测量了总共12个样品。feature counts v1.5.0-p3用于计算映射到每个基因的读数数量。使用deseq2 r包进行不同组的差异表达基因(degs)分
析。调整后的p值小于0.05的基因和基于log2倍数变化》3的deg被认为是差异表达的。metascape41用于基因个体发育(go)分析。
40.(4)蛋白质印迹取上述步骤(1)培养的mum2b、92.1细胞和mp41细胞培养液各7ml，然后分别向其中加入ohsv-1，感染指数moi＝0.1，然后于37℃、含5％二氧化碳的环境中继续孵育72小时。不同细胞的处理分别同时设置不加入ohsv-1处理的对照(control)。每个样品三个重复，共18个样品。孵育72小时后，将细胞培养皿置于冰上，将含有蛋白酶和磷酸酶溶剂的裂解缓冲液(thermo scientific，carlsbad，ca，usa)加入其中，裂解45分钟。使用bca(thermo scientific)定量蛋白质浓度，将蛋白质加入5
×
上样缓冲液(sds-page凝胶电泳上样缓冲液)并在90℃下煮沸10分钟。通过sds-page分离40μg蛋白质并印迹到硝酸纤维素膜(millipore，billerica，ma，usa)上。封闭后，将膜与一抗：抗tlr3单克隆抗体、抗单克隆抗体、抗单克隆抗体和抗β-肌动蛋白单克隆抗体，在4℃下孵育过夜。然后用tbst洗涤膜并孵育使用二抗：辣根过氧化物酶(hrp)连接的抗兔igg(#7074)抗体或抗小鼠igg(sc-2371)抗体。使用ecl增强化学发光溶液(thermo scientific)检测信号。imagej用于量化蛋白质印迹条带。
41.从转录组测序结果来看，mum2b和92.1细胞的rnaseq测序结果分析在所有样品中产生2093个差异表达基因。应用了p《0.05的显著性阈值和基于log2 fold change》3的degs作为差异表达基因的标准，与未处理的um细胞对照相比，用ohsv-1(moi＝0.1)处理48小时的um细胞呈现出不同的特征。在差异调节的基因中，使用metascape鉴定了最丰富的簇(参见图1a)。许多簇与负调控相关，包括mrna分解代谢过程的负调控、mirna对基因沉默的负调控以及激酶/信号传导的负调控。对hsv-1感染中的基因进行分类，发现tlr3基因被下调(参见图1b)。
42.从蛋白质印迹分析结果来看，参见图1c，ohsv-1处理后mum2b、92.1和mp41细胞中的tlr3下调。这些结果表明um治疗中的ohsv-1感染下调tlr3表达。
43.实施例2免疫细胞学分析不同um细胞系中tlr3的表达情况
44.试验方法：免疫组化
45.根据赫尔辛基宣言的指导原则，获得了不同病理类型：梭型(spindle)、上皮型(epithelioid)和混合型(mix)um石蜡包埋切片的肿瘤标本。免疫荧光染色步骤如参考文献s.liu,j.zhang,s.fang,x.su,q.zhang,g.zhu,l.zhu,m.zhao,andf.liu,antitumor efficacy of oncolytic hsv-1 expressing cytosine deaminase is synergistically enhanced by dpd down-regulation and emt inhibition in uveal melanoma xenograft.cancer lett 495(2020)中所述。简而言之，组织切片用山羊血清封闭，并与一抗：抗tlr3单克隆抗体，在4℃下孵育过夜。然后，将样本与alexa fluor 488或alexa fluor 594偶联，在室温下孵育60分钟，并使用prolong gold antifade reagent with dapi(thermo scientific)进行封固。使用leica aperio at2和leica dm irb仪器捕获荧光图像。使用imagej分析积分光密度(iod)。
46.使用timer平台确定了tlr3与信号通路上游和下游之间的相关性。
47.结果分析
48.从图2(a)可以看出，在不同的um表型(梭型、上皮型和混合型)中都检测了tlr3蛋
白质的表达。um组织的所有表型均发现tlr3染色阳性，均随机选择。此外，使用timer平台确定了tlr3与信号通路上游和下游之间的相关性，如图2(b)所示，观察到tlr3与mrna水平之间的显著关系(图2b)。
49.实施例3 ohsv-1和poly(i:c)联合治疗的试验
50.细胞活力测定试验方法
51.按照试验材料部分提到的细胞培养和分化方法进行arpe-19细胞、mum2b细胞、92.1和mp41细胞培养，将四种细胞分别按照1
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103细胞/孔接种到含有相应培养基的96孔板中，然后按照如下几种方式进行试验：
52.(1)用arpe-19细胞、mum2b细胞分别设置6种试验，即加入不同浓度的poly(i:c)后于37℃过夜孵育48h，poly(i:c)在体系中的终浓度分别为：0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml；然后按照制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8(cck-8，dojindo molecular technologies，上海，中国)测定细胞活力。使用spectra microplate reader在450nm处检测样品吸光度。
53.(2)用mum2b细胞设置2组试验，一组试验为不同感染指数ohsv-1的试验组(结果参见图3c的实线图)，共6种感染指数，分别为moi＝0、0.001、0.01、0.1、1、10；另一组为不同感染指数的ohsv-1(moi＝0、0.001、0.01、0.1、1、10)配合终浓度为50μg/ml的poly(i:c)的试验组(结果参见图3c的虚线图)。试验方法和细胞活力检测方法同试验(1)。
54.(3)采用mum2b细胞、92.1和mp41细胞，按照每种细胞设置4种不同处理方式进行试验：对照(未作任何处理)、ohsv-1(moi＝0.1)、poly(i:c)(终浓度50μg/ml)和ohsv-1 poly(i:c)(moi＝0.1 终浓度50μg/ml)，加入处理剂后于37℃过夜孵育48h。然后按照制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8(cck-8，dojindo molecular technologies，上海，中国)测定细胞活力。使用spectra microplate reader在450nm处检测样品吸光度。
55.(4)为了阐明poly(i:c)和ohsv-1联合治疗的抗肿瘤活性的体外机制，还使用蛋白质印迹分析研究了细胞内信号通路(图3e)，采用使用蛋白质印迹分析研究了细胞内信号通路，采用mum2b细胞、92.1和mp41细胞，按照每种细胞设置4种不同处理方式进行试验：对照(未作任何处理)、ohsv-1(moi＝0.1)、poly(i:c)(终浓度50μg/ml)和ohsv-1 poly(i:c)(moi＝0.1 终浓度50μg/ml)，蛋白印迹操作与实施例1中试验(4)的方法相同。
56.试验(1)的结果参见图3a和图3b，本发明通过测试不同浓度的聚(i:c)对arpe-19细胞系活力的影响找到最合适的poly(i:c)浓度参见图3a，当激动剂浓度超过50μg/ml时表现出对arpe-19细胞毒性。因此，本发明中使用的聚(i:c)浓度为50μg/ml。poly(i:c)处理mum2b细胞时，结果显示出随着poly(i:c)浓度增加的剂量依赖性方式(参见图3b)。
57.试验(2)的结果参见图3c，poly(i:c)可以增强ohsv-1的抗肿瘤能力。单独使用ohsv-1时，ic
50
为1.399，而联合治疗时ic
50
降低至0.7801。
58.试验(3)的结果参见图3d，结果表明联合治疗能够增强不同um细胞系的抗肿瘤功效。ohsv-1 poly(i:c)试验组的细胞活力与单独使用ohsv-1或poly(i:c)的实验组的细胞活力相比有显著性差异。
59.试验(4)的结果参见图3e，结果表明相对于对照，tlr3在ohsv-1处理后下调，在ohsv-1处理后上调。在poly(i:c)刺激下，可以在mum2b、92.1和mp41细胞系看到tlr3的表
达上调、的表达下调；而在ohsv-1和poly(i:c)的联合治疗下，相对于单独ohsv-1处理，tlr3的表达量有所上调，表达量有所下调。在um细胞系中发现了类似的效果。可见联合治疗相对于单独使用ohsv-1处理，增加了tlr3的表达，降低了表达量，进而提高nfkb转录活性。由此表明，poly(i:c)增强了ohsv-1在治疗um细胞系中的抗肿瘤功效。
60.本发明的研究表明，ohsv-1可以降低um中的tlr3表达，因此，本发明提供了一种基于tlr3激动剂poly(i:c)的联合治疗，以重新激活tlr3信号通路，进一步增强巨噬细胞的抗肿瘤能力。这种双重作用增强了ohsv-1的抗肿瘤功效。ohsv-1和poly(i:c)联合治疗通过重新激活tlr3介导的通路增强溶瘤病毒的细胞毒性功效，联合治疗可以产生局部抗肿瘤免疫反应，弥补溶瘤病毒诱导的抑制作用。