一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的基因PeNHX1及其应用

一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的基因penhx1及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的基因penhx1及其应用。


背景技术：

2.蝴蝶兰作为一种重要的经济作物，是花卉市场最受欢迎的花卉之一。蝴蝶兰花瓣具有丰富的花色，例如红色到蓝紫色的变化，然而真正偏蓝的蝴蝶兰极少。经研究发现，液泡ph是影响花色偏蓝的重要因素，随着液泡ph的升高，部分花器官会出现由粉红到紫蓝的转变，这是由于不同状态的花色苷类物质吸收光谱有不同的红移或蓝移效应。基于目前的研究，寻找合适的基因手段对蝴蝶兰进行育种，培育出花瓣颜色偏蓝的蝴蝶兰受到了本领域技术人员的持续关注。


技术实现要素：

3.本发明提供一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的基因penhx1，通过基因工程的手段培育得到花瓣颜色偏蓝的蝴蝶兰，从而丰富蝴蝶兰花瓣颜色的种类，使其具有独特的观赏价值，并为今后定向改良花卉颜色提供理论依据和新的思路。
4.本发明第一方面提供一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的基因penhx1，所述基因具有以下核苷酸序列中的一种：
5.1)seq id no.1所示的核苷酸序列；
6.2)seq id no.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；
7.3)与seq id no.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。
8.本发明第二方面提供一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的蛋白，所述蛋白由本发明第一方面提供的基因编码得到。
9.本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组表达载体包含本发明第一方面提供的核苷酸序列。
10.本发明第四方面提供一种重组转化体，所述重组表达转化体包含本发明第三方面提供的重组载体。
11.进一步地，所述重组表达转化体为农杆菌。
12.本发明第五方面提供第一方面提供的基因在调控蝴蝶兰花瓣颜色中的应用。
13.本发明第六方面提供一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的方法，所述方法包括：将本发明第五方面提供的重组转化体注射至蝴蝶兰花瓣内。
14.进一步地，所述蝴蝶兰为小兰屿蝴蝶兰或大辣椒蝴蝶兰。
15.进一步地，当所述蝴蝶兰为小兰屿蝴蝶兰时，所述方法具体包括：
16.将所述核苷酸序列连接到cymmv病毒质粒上面，得到重组载体；然后将所述重组载体转入农杆菌，得到重组转化体；将所述重组转化体侵染小兰屿蝴蝶兰。
no.2所示的氨基酸序列，由543个氨基酸残基组成，分子量为60.05千道尔顿。
33.实施例2 penhx1在小兰屿蝴蝶兰发育的不同时期的表达谱验证
34.小兰屿蝴蝶兰作为兰科的模式植物，通过小兰屿蝴蝶兰对该基因进行验证，具体包括如下步骤：
35.1、使用试剂盒rnaplant(市售)提取图1中a所示的小兰屿蝴蝶兰不同发育时期的花苞的rna，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；
36.2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
37.3、以不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cdna为模板，对penhx1基因进行表达谱验证。
38.验证结果如图1中b所示，penhx1在不同发育时期的表达量不同，其中，在花苞全部盛开时(b5)表达量较高。
39.实施例3 penhx1在小兰屿蝴蝶兰的不同组织部位的表达谱验证
40.1、使用试剂盒为rnaplant(市售)提取图2中a所示的小兰屿蝴蝶兰的不同组织部位的rna，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；
41.2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
42.3、以不同组织部位的小兰屿蝴蝶兰反转录得到的cdna为模板，对penhx1基因进行表达谱验证。
43.验证结果如图2中b所示，penhx1基因在不同花器官中都有表达，与花瓣和萼片相比唇瓣中表达量更高，这可能因为野生型小兰屿蝴蝶兰花瓣、萼片呈偏红色，唇瓣偏黄色有关，说明penhx1基因表达影响花瓣颜色。
44.实施例4 cymmv病毒诱导小兰屿蝴蝶兰penhx1基因沉默
45.1、将penhx1基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于cymmv病毒载体，形成含有该基因片段的cymmv-nhx1载体，然后将该载体转入农杆菌gv3101，得到重组转化体；
46.2、将重组转化体，在5ml含有100μm的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，在28℃，200rpm培养16h；随后继续在50ml含有100μm的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的lb培养基中继代培养，在28℃，200rpm下孵育13-16h，直到od600达到0.8-1.0；
47.3、取步骤2中含有重组转化体的农杆菌菌液，转移至50ml离心瓶中，并在4℃，3000g下离心10分钟，离心后，除去上清液。加入300μl含100μm乙酰丁香酮的ms培养基，使细胞沉淀重悬，在室温下静置0.5h；
48.4、使用带有针头的1ml注射器吸取静置后的农杆菌转化液，注射于小兰屿蝴蝶兰花瓣中；
49.5、注射后培养30-40天，观察小兰屿蝴蝶兰花瓣，处理后的小兰屿蝴蝶兰为突变组，命名为pcymmv-penhx1，观察结果如图3所示，小兰屿蝴蝶兰沉默突变株系的花瓣颜色均明显变浅。
50.实施例5 cymmv病毒诱导小兰屿蝴蝶兰突变株系中，penhx1基因在花瓣中的的表达验证
51.1、选取如图3中对照组和突变组的花瓣，提取花萼和花瓣的总rna，提取试剂盒为rnaplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；
52.2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
53.3、以cdna为模板，对penhx1进行基因沉默效率验证。
54.验证结果如图4所示，penhx1基因的表达在突变组显著降低，penhx1沉默效率较高，也进一步验证了penhx1参与了小兰屿蝴蝶兰花瓣颜色的形成。
55.实施例6 cymmv病毒诱导小兰屿蝴蝶兰沉默株系中花瓣颜色cie值
56.cie(commission international eclairage)是一种根据测定颜色标准建立起来的色彩模式，通过这种色彩模式来表达花瓣的颜色变化。
57.cie中的一个要素是亮度(l*)，a*和b*是两个颜色通道。a*的颜色是从深绿色(低亮度值)到灰色(中亮度值)再到亮粉红色(高亮度值)；b*的颜色是从亮蓝色(低亮度值)到灰色(中亮度值)再到黄色(高亮度值)。
58.1、选取如图3中实验组和突变组的花瓣，以对照组作为标准样品，突变组的花瓣作为处理样品，标准样品和处理样品取样三次，其中每个样品测量三个生物学重复，最后获得平均值做标准曲线。
59.2、如表一所示，实验组与对照组的花瓣相比，在lip(唇瓣)中，l*增大，表明唇瓣色彩亮度增大；a*增大，表明唇瓣色彩红色增大；b*增大，表明唇瓣色彩黄色加深。在petal(花瓣)中，l*减小，表明唇瓣色彩亮度减小；a*减小，表明唇瓣色彩红色减淡；b*增大，表明唇瓣色彩黄色加深。以上结果说明penhx1基因对小兰屿蝴蝶兰颜色的变化有显著影响。
60.表一实验组和对照组在30-40d天后的花瓣cie测定值
[0061][0062]
rhscc royal horticultural society color chart；l*lightness；a*,b*chromatic component；c*brightness；h(hue angle)＝arctan(b*/a*)
[0063]
因为小兰屿蝴蝶兰花色苷种类以及含量比起其他蝴蝶兰要少，所以我们又通过以大辣椒蝴蝶兰为实验材料过表达penhx1基因发现可以使花瓣颜色偏蓝，具体阐述如下：
[0064]
实施例7 ubi1300载体诱导大辣椒蝴蝶兰penhx1基因瞬时过表达
[0065]
1、将penhx1基因的开放阅读框1632bp可操作地连接于ubi1300-gfp表达载体，形成含有该基因片段的ubi1300-gfp-penhx1载体，然后将载体转入农杆菌gv3101，得到重组转化体；
[0066]
2、将重组转化体，在5ml含有100μm的乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和10μg/ml利福平的lb培养基中，在28℃，200rpm培养过夜；
[0067]
3、取步骤2中含有重组表达转化体的农杆菌菌液，转移至离心瓶中，并在4℃，3700rpm下离心10分钟，离心后，除去上清液并用0.5m的mgcl2反复吹打重悬三次；
[0068]
4、取步骤3中重悬后含有重组表达转化体的农杆菌菌液，用0.5m的mgcl2稀释菌液，控制菌液的od值在0.6左右。然后加入总体积1.5倍的100μm乙酰丁香酮和总体积20倍的
mes(吗啉乙磺酸)，使细胞沉淀重悬，在室温下静置3-4h；
[0069]
5、使用带有针头的1ml注射器吸取静置后的农杆菌转化液，注射于大辣椒蝴蝶兰花瓣；
[0070]
6、注射后培养2-3天，观察大辣椒蝴蝶兰花瓣，如图5所示，处理后的大辣椒蝴蝶兰为突变组，命名为ubi1300-nhx1，可以看出，突变组的花瓣颜色结构中均出现蓝色沉积。
[0071]
实施例8大辣椒蝴蝶兰的penhx1基因瞬时过表达，penhx1基因在花瓣中的表达验证
[0072]
1、使用试剂盒为rnaplant(市售)提取实施例7突变组和对照组新长出的花瓣的总rna，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；
[0073]
2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
[0074]
3、以步骤1反转录得到的cdna为模板，对penhx1进行基因表达效率验证。
[0075]
验证结果如图6所示，penhx1的表达量在突变株系的花瓣中的表达量明显升高。
[0076]
实施例9大辣椒蝴蝶兰的penhx1基因瞬时过表达后花瓣颜色cie值测定
[0077]
1、如实施例6cie值测定方法所示，对瞬时过表达后大辣椒蝴蝶兰花瓣颜色进行测定。选取实施例8提供的突变组和对照组的花瓣，以对照组作为标准样品，突变组的花瓣作为处理样品，标准样品和处理样品取样三次，其中每个样品测量三个生物学重复，最后获得平均值做标准曲线。
[0078]
2、如表二所示，实验组与对照组的花瓣相比，颜色少红并偏蓝，说明penhx1基因对大辣椒蝴蝶兰花瓣颜色的变化有显著影响。
[0079]
表二实验组和对照组在3天后的花瓣cie测定值
[0080][0081]
rhscc royal horticultural society color chart；l*lightness；a*,b*chromatic component；c*brightness；h(hue angle)＝arctan(b*/a*)
[0082]
实施例10大辣椒蝴蝶兰的penhx1基因瞬时过表达后花瓣提取物的ph值测定和显著性分析
[0083]
1、选取如实施例8突变组和对照组提供的花瓣直接研磨，在13000rpm下离心15分钟，然后立即使用ph电极测量上清液。对照组和实验组的花瓣分别取三个生物学重复进行测量，通过绘图分析软件graphpad prism对所测ph值进行显著性分析。
[0084]
2、如图7-8所示，突变组花瓣提取物相较于对照组花瓣提取物颜色明显偏蓝偏暗，ph值有所升高，表明penhx1基因可能通过提高大辣椒蝴蝶兰液泡ph值来影响花瓣颜色。
[0085]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽
管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。