角膜中伏立康唑的检测方法与流程

1.本发明涉及一种角膜中伏立康唑的检测方法。


背景技术：

2.目前，常用的治疗眼部真菌感染的药物有三唑类、多烯类等，例如0.5％～1.0％氟康唑滴眼液；两性霉素b；5％那他霉素滴眼液。伏立康唑是新型第二代三唑类抗菌药，为氟康唑的衍生物；由于在氟康唑的丙基上增加1个甲基，故增加了对cyp酶的亲和力，同时嘧啶环及5位上的氟也增强了抗真菌的活性。因而，与其它三唑类相比，伏立康唑的抗菌谱更广、抗菌作用更强且耐受性较好，可作用于严重的真菌感染。
3.然而，由于存在个体差异和治疗窗较窄，伏立康唑容易引起一些不良反应，如视觉障碍、光敏性、神经毒性等。为了提高药物抗真菌治疗的有效性和安全性，需要检测角膜中的伏立康唑。
4.角膜组织约1毫米厚，主要由无血管的结缔组织构成，其从前到后可分为上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层五层结构。上皮层表面覆盖有一层稀薄的泪膜；前弹力层为无细胞结构的均匀的透明膜，由胶原纤维组成；基质层占角膜厚度的90％，主要由规则、均匀的胶原纤维束构成片状，层层紧密相叠而成；后弹力层为角膜内皮细胞的基底膜，由内皮细胞分泌形成，对理化损伤有较强的抵抗力，为角膜的防御屏障；内皮细胞层为一层单层的六角形内皮细胞构成。该组织质地坚硬，较难处理，为测定其中的药物浓度增加了难度。
5.目前，国内常使用lc-ms/ms法通过外标法测定生物样本中伏立康唑浓度，对于伏立康唑药代动力学以及毒代动力学的研究大部分局限于对血浆、血液、尿液、肝脏等生物样本。外标法，即保持外部环境条件一致情况，用待测组分的纯品作对照物质，通过已知浓度目标物响应值与未知浓度目标物响应值相比较，得到未知浓度目标物的相对浓度。但在很多情况下“外部环境条件”很难控制到一致，取样、制样和前处理、上机分析等都会导致环境条件偏离，使用外标法比对浓度就会出现失真。另外，外标法的分析时间长，灵敏度0.1μg/ml对于药代及毒代分析相对较低，无法达到检测要求。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于检测角膜中伏立康唑的难度较大，检测分析用时较长以及检测下限较高、灵敏度较低的缺陷，而提供了一种角膜中伏立康唑的检测方法。本发明的角膜中伏立康唑的检测方法分析用时短，准确性和可靠性高，专属性良好，并且具有较低的检测下限、灵敏度高。
7.本发明是通过以下方案来解决技术问题的：
8.本发明提供角膜中伏立康唑的检测方法，包括以下步骤：
9.s1：制备角膜供试品溶液；
10.s2：在液相色谱-质谱联用设备上进样检测；
11.其中，所述液相色谱中采用流动相的梯度洗脱；所述流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a和所述流动相b的体积比为70:30-10:90-70:30；所述流动相a为甲酸水溶液；所述甲酸水溶液中的甲酸占所述流动相a的总体积的0.01％-0.5％；所述流动相b为甲酸与乙腈的混合液；所述甲酸占所述流动相b的总体积的0.01％-0.5％；
12.s3：绘制标准曲线并计算所述角膜供试品溶液中伏立康唑的浓度。
13.s1中，所述角膜供试品溶液的制备方法优选包括以下步骤：
14.①
将角膜剪碎，加入匀浆液，搅拌，研磨，得到角膜组织匀浆液；
15.②
将所述角膜组织匀浆液与内标物和蛋白沉淀剂涡旋混合、离心；
16.③
取上清液加入复溶液涡旋混合，即得所述角膜供试品溶液。
17.步骤
①
中，所述角膜可为动物体的角膜，较佳地为新西兰大白兔的角膜。
18.步骤
①
中，所述匀浆液可包括meoh和h2o，所述meoh和h2o的体积比可为1：(1-10)，较佳地为1：1。
19.步骤
①
中，所述角膜与匀浆液的质量比可为1：10。
20.步骤
①
中，所述搅拌可在匀浆均质仪上进行。
21.步骤
①
中，所述搅拌的速度一般为8m/sec。
22.步骤
①
中，所述搅拌的时间一般为40s。
23.步骤
①
中，所述的研磨使用本领域常规手段，较佳地需要进行3次。
24.步骤
②
中，所述内标物可为本领域常规的内标物，较佳地为甲苯磺丁脲。
25.步骤
②
中，所述离心的温度可为4℃。
26.步骤
②
中，所述离心的离心力可为4700g。
27.步骤
②
中，所述离心的时间可为10min。
28.步骤
②
中，所述蛋白沉淀剂为本领域常规；较佳地为乙腈。
29.步骤
②
中，所述蛋白沉淀剂与所述角膜的体积比可为(1-20):1；较佳地为8:1。
30.步骤
②
中，所述复溶液优选包括乙腈和水；较佳地，所述乙腈和水的体积比为1:4。
31.s2中，所述液相色谱-质谱联用设备可为本领域常规的液相色谱-质谱联用仪。
32.s2中，所述液相色谱的色谱柱固定相一般可为十八烷基键合硅胶，较佳地为x-bridge beh c18；所述色谱柱的规格可为本领域常规，例如2.1mm
×
50mm，2.5μm；其中，2.1mm为色谱柱内径，50mm为色谱柱柱长，2.5μm为色谱柱填料粒径。
33.s2中，所述液相色谱的柱温优选为20-30℃；较佳地为30℃。
34.s2中，所述液相色谱的进样量优选为1-20μl；较佳地为1μl。
35.s2中，较佳地，所述甲酸占所述流动相a的总体积的0.1-0.3％，更佳地为0.2％。
36.s2中，所述甲酸优选占所述流动相b的总体积的0.1％-0.3％，较佳地为0.2％。
37.s2，所述梯度洗脱的洗脱程序优选为：0-0.30min内，流动相a的体积百分比为70％，流动相b的体积百分比为30％；0.31min-1.81min内，流动相a的体积百分比降低至10％，流动相b的体积百分比升高至90％；1.82min-2.29min内，流动相a的体积百分比为10％，流动相b的体积百分比为90％；2.30min-2.31min内，流动相a的体积百分比升高至70％，流动相b的体积百分比降低至30％；2.32min-2.60min内，流动相a的体积百分比为70％，流动相b的体积百分比为30％，百分比为占所述流动相a和所述流动相b的总体积的百分比。
38.s2中，所述流动相的流速优选为0.5ml/min。
39.s2中，所述质谱可采用本领域常规的质谱仪，例如型号为ab sciex triple quad
tm 6500plus的质谱仪。
40.s2中，所述质谱的离子源可为电喷雾电离esi；
41.s2中，所述质谱的离子化模式可为正离子化模式；
42.s2中，所述质谱采用多反应监测模式；较佳地，所述多反应监测模式中，伏立康唑的母离子的质荷比为350.1，子离子的质荷比为281.1；当内标物为甲苯磺丁脲时，甲苯磺丁脲的母离子的质荷比为271.1，子离子的质荷比为155.0。
43.s2中，所述质谱的扫描间隔时间可为100ms。
44.s3中，所述标准曲线的绘制可以包括如下步骤：
45.a.配制伏立康唑的标准品工作液和内标工作液；
46.b.将a中所述的标准品工作液与空白角膜基质混合后，即得标准样品溶液；
47.c.向b中所述的标准样品溶液中加入a中所述的内标工作液和蛋白沉淀剂涡旋混合、离心，取上清液加入所述复溶液涡旋混合，即得标准品待测液；所述蛋白沉淀剂为乙腈；所述复溶液包括乙腈和水；所述乙腈和水的体积比为1:4；
48.d.采用s2中所述检测的方法分析c中所述标准品待测液，测得伏立康唑与所述内标工作液中内标物的峰面积比；
49.e.根据所述标准样品溶液的伏立康唑与所述内标工作液中内标物的峰面积比和所述标准品工作液的浓度拟合，得到回归方程，并绘制所述标准曲线，即可。
50.步骤a中，所述标准品工作液的配制方法可包括如下步骤：将所述伏立康唑与第一稀释液混合，得到标准品储备液；再将所述标准品储备液与第二稀释液混合，即可。
51.步骤a中，所述内标工作液可通过将甲苯磺丁脲与内标稀释液混合制得。
52.其中，所述内标工作液的制备方法优选包括下列步骤：将所述甲苯磺丁脲与所述内标稀释液混合，即得内标储备液；将所述内标储备液与所述内标稀释液混合，即可。
53.其中，所述第一稀释液可为甲醇；所述第二稀释液可为50％甲醇水溶液，所述内标稀释液可为乙腈。
54.步骤a中，所述内标工作液的浓度可为400ng/ml。
55.步骤a中，所述标准品工作液的浓度梯度可依次为10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml和10000ng/ml。
56.步骤b中，所述标准样品溶液的浓度可依次为0.5ng/ml、1.25ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml和500ng/ml。
57.步骤e中，所述回归方程可为y＝0.0308x 0.0035(r＝0.9981，r2＞0.98)。
58.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
59.本发明所用试剂和原料均市售可得。
60.本发明的积极进步效果在于：
61.1)本发明的角膜中伏立康唑的检测方法，简单易操作、且用时短；从而能进一步分析伏立康唑在实验兔体中的药代/毒代动力学。
62.2)本发明的角膜中伏立康唑的检测方法，所需的样品的进样量小，所需的分析时
间较短；并且本发明的测试方法得到的标准曲线线性精准，保证了检测的准确性和可靠性较高；当至少67％质控样品溶液的回算浓度(每个浓度水平至少50％的样品)与其相应的实际值的偏差在
±
15.0％之内时，检测方法的专属性良好。
63.3)本发明的角膜中伏立康唑的检测方法，具有对伏立康唑较低的检测下限，为0.5ng/ml，灵敏度较高。
附图说明
64.图1为标准曲线中伏立康唑的定量下限(即0.5ng/ml)图谱。
65.图2为标准曲线中甲苯磺丁脲(即400ng/ml)在定量下限处的图谱。
66.图3为标准曲线中伏立康唑的定量上限(也就是500ng/ml)图谱。
67.图4为标准曲线中甲苯磺丁脲(即400ng/ml)在定量上限处的图谱。
68.图5为伏立康唑的标准曲线图。
具体实施方式
69.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
70.以下实施例中，“fa”是指甲酸；“h2o”是指水；“acn”是指乙腈；“ipa”是指异丙醇；“meoh”是指甲醇；tfa是指三氟乙酸。
71.实施例1
72.s1：制备角膜供试品溶液
73.1)将新西兰大白兔的角膜剪碎，向其中加入10倍质量的匀浆液(meoh:h2o＝1:1,v/v)，匀浆均质仪中以8m/sec的速度搅拌40s，研磨3次，得到样品；
74.2)吸取20μl样品(包括std、sst、qc、db、carryover、blank)转移至96孔板或聚丙烯离心管中；其中，std对应表3样品；qc对应表5样品；db：不含待测物不含内标物；carryover：不含待测物；blank：不含待测物仅含内标物。
75.3)向所有样品(除carryover、db外)中加入20μl内标工作液(400.000ng/ml甲苯磺丁脲)，carryover、db加入20μl内标工作液的稀释液acn；
76.4)涡旋混合后，向所有样品中加入160μl acn，作为蛋白沉淀剂；
77.5)涡旋混合，在4℃，4700g条件下离心10min；
78.6)取离心后的上清液100μl至96孔板或聚丙烯离心管中，加入100μl复溶液(acn:h2o＝1:4,v/v)封膜，1000rpm下涡旋混匀10min；得到角膜供试品溶液。
79.图1和图2为std1样品进样分析所测；图3和图4为std8样品进样分析所测；图1～图4均表明在本发明标准曲线中的浓度均可通过色谱-质谱联用法进行检测。
80.s2：在液相色谱-质谱联用设备上进样检测
81.液相色谱条件为：
82.进样量：1μl；
83.色谱柱：x-bridge beh c18,2.1mm
×
50mm,2.5μm，waters，其中，2.1mm为色谱柱内径，50mm为色谱柱柱长，2.5μm为色谱柱填料粒径；
84.柱温：30℃；
85.采用流动相a(mpa)(0.2％甲酸(fa)水溶液)和流动相b(mpb)(0.2％甲酸(fa)与乙腈(can)混合溶液)进行梯度洗脱，如表1所示；
86.运行时间：2.60min。
87.表1洗脱程序的参数
88.时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)0～0.300.570301.810.510902.300.510902.310.570302.600.57030
89.其中，所述的梯度洗脱程序为：从初始状态到0.30min的时间段内，流动相a的体积百分比为70％，流动相b的体积百分比为30％；在0.30min到1.81min的时间段内，流动相a的体积百分比改变为10％，流动相b的体积百分比改变为90％；在2.30min到2.31min的时间段内，流动相a的体积百分比逐渐升高到70％，流动相b的体积百分比逐渐降低到30％；在2.31min到2.60min的时间段内，流动相a的体积百分比维持在70％，流动相b的体积百分比维持在30％。(上述流动相a和b的体积百分比以流动相a和b的总体积为基准)。
90.洗针程序：
91.冲洗类型：仅外部；
92.冲洗模式:抽吸前后，浸入时间:2s；
93.冲洗泵方式:冲洗泵，然后停止，时间:2s；
94.冲洗设置:冲洗速度:35μl/s；
95.冲洗体积:1000μl；
96.测量管路吹扫量:500μl
97.质谱条件为：
98.仪器型号：ab sciex triple quad
tm 6500plus；
99.离子源：esi；
100.离子化模式：正离子；
101.mrm离子对信息如表2所示；
102.质谱的仪器参数如表3所示。
103.表2 mrm离子对
104.分析物q1质荷比q3质荷比扫描间隔(ms)伏立康唑350.100281.100100甲苯磺丁脲271.100155.000100
105.表3质谱的仪器参数
106.[0107][0108]
s3：根据标准曲线计算所述角膜供试品溶液中伏立康唑的浓度
[0109]
1、试剂的配制
[0110]
强洗溶液(snw)：2％tfa，其中，乙腈(acn)：水(h2o)：甲醇(meoh)：异丙醇(ipa)体积比为1:1:1:1。
[0111]
弱洗溶液(wnw)：0.1％甲酸(fa)水溶液。
[0112]
内标稀释液：乙腈。
[0113]
第一稀释液：meoh。
[0114]
第二稀释液：meoh:h2o体积比为1:1。
[0115]
2、标准品工作液的配制
[0116]
储备液和工作液均储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
[0117]
2.1标准品储备液的配制
[0118]
精密称取适量伏立康唑标准品于棕色玻璃样品瓶中，加入适量第一稀释液meoh溶解、摇匀，配制成浓度为1.000mg/ml的标准品储备液。(伏立康唑标准品的纯度为99.8％(通过hplc测得)。(由于伏立康唑标准品本身纯度不是100％或带有水或盐，meoh的体积通过标准品储备液的浓度以及经折算的伏立康唑质量计算得到，其中，经折算的伏立康唑的质量通过所称取的伏立康唑质量乘以伏立康唑的质量折算因子99.8％计算得到)
[0119]
2.2标准品工作液和sst(系统适应性样品)工作液的配制
[0120]
使用标准品储备液，依照下表4配制，得到标准品工作液和sst工作液：
[0121]
表4标准品工作液和sst工作液的配制参数
[0122][0123]
2.3标准样品溶液的配制
[0124]
使用表4的工作液，依照下表5配制，得到标准样品溶液，表中角膜溶液按第二稀释液与空白角膜基质的体积比为10:1混合所得，例如100μl第二稀释液与10μl空白角膜基质。
[0125]
表5标准样品溶液的配制参数
[0126][0127]
标准样品溶液储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
[0128]
3、内标工作液配制
[0129]
3.1内标储备液的配制
[0130]
精密称取适量甲苯磺丁脲于透明样品瓶中，加入适量acn溶解、摇匀，配制成浓度为1.000mg/ml的内标储备液。
[0131]
3.2内标工作液的配制(稀释液：acn)
[0132]
使用内标储备液，依照下表6配制，得到内标工作液：
[0133]
表6内标工作液的配制参数
[0134][0135]
4、标准品待测液配制
[0136]
将配制得到的内标工作液加入前一步得到的标准样品溶液中，再加入蛋白沉淀剂涡旋混合、离心，取上清液加入复溶液涡旋混合，得到标准品待测液。
[0137]
5、测定伏立康唑与内标物的峰面积比
[0138]
采用步骤s2中的色谱条件分析标准品待测液。
[0139]
测得500ng/ml伏立康唑的响应值为4.6e6，如图3所示。
[0140]
测得400ng/ml甲苯磺丁脲的响应值为3.4e5，如图4所示。
[0141]
6、根据标准样品溶液的伏立康唑与内标工作液中内标物的峰面积比和标准品工作液的浓度拟合，采用回归方法，并绘制所述标准曲线。
[0142]
6.1回归方法
[0143]
提取mrm色谱图，拟合标准曲线，标准曲线以标准品工作液浓度为横坐标，以标准品工作液与内标工作液中内标物的峰面积比值为纵坐标，设置权重为1/x2，忽略原点，拟合线性标准曲线。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。
[0144]
样品中分析物的实测浓度由以下回归方程计算：
[0145]
y＝ax b
[0146]
其中，y＝分析物与内标峰面积比
[0147]
a＝标准曲线之斜率
[0148]
x＝分析物浓度(单位ng/ml)
[0149]
b＝标准曲线之截距(权重因子为1/x2)
[0150]
6.2分析批接收标准
[0151]
1)标准曲线各浓度点的回算值与标示值之间的偏差应在
±
15.0％范围内(定量下限处的偏差在
±
20.0％范围内)。
[0152]
2)至少75％的标准曲线样品，且每个浓度点至少50％的样品应符合接受标准。
[0153]
3)回归方程的相关系数(r2)必须大于等于0.98。
[0154]
4)当至少67％的质控样品结果(每个浓度至少50％)与它们相应标示值的偏差在
±
15.0％之内时，该分析批认为可接受。
[0155]
结果如图3所示(根据表3样品所测)，标准曲线回归方程为：y＝0.0308x 0.0035(r＝0.9981，r2＞0.98)，标准曲线如图5所示。
[0156]
效果实施例：
[0157]
分析上述角膜中伏立康唑检测方法的偏差：
[0158]
1、质控储备液的配制
[0159]
与标准品储备液相同。
[0160]
2、质控工作液的配制(稀释液：meoh:h2o＝1:1，v/v)
[0161]
使用质控储备液，依照下表7配制，得到质控工作液。
[0162]
表7质控工作液的配制参数
[0163][0164]
3、质控样品溶液的配制
[0165]
使用质控工作液，依照下表8配制，得到质控样品溶液。表中角膜溶液按第二稀释液与空白角膜基质的体积比为10:1混合所得，例如100μl第二稀释液与10μl空白角膜基质。
[0166]
表8质控样品溶液的配制参数
[0167][0168][0169]
质控样品溶液储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
[0170]
4、质控样品溶液分析角膜供试品溶液中伏立康唑的浓度的偏差
[0171]
标准品样品溶液、质控样品溶液与标示值回算偏差结果如表9、表10所示，满足分析的接受标准。综上，本方法可以用于测定实验兔角膜中的分析物(即为伏立康唑)的浓度。
[0172]
表9质控样品溶液的标准曲线的计算参数
[0173][0174]
表10标准样品溶液的标准曲线的计算参数
[0175][0176]
由表9和10中数据可知检测的准确性和可靠性较高，至少67％质控样品溶液的回
算浓度(每个浓度水平至少50％的样品)与其相应的实际值的偏差在
±
15.0％之内，该检测方法的专属性良好；另外，本发明的测试方法对伏立康唑具有较低的检测下限，为0.5ng/ml。
[0177]
对比例1
[0178]
检测对象：血浆样品；
[0179]
流动相a：甲酸、甲酸铵和水的混合溶液，其中，甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为2mmol/l；
[0180]
流动相b：乙腈；
[0181]
表11为对比例1的液相色谱的梯度洗脱参数。
[0182]
表11梯度洗脱程序的参数
[0183]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～350503～42984～4.52984.5～55050
[0184]
其他条件如实施例1，测得4.0μg/ml伏立康唑和2.0μg/ml内标物的响应值分别为5.72e6、2.91e6。
[0185]
本技术实施例1的伏立康唑与内标物的检测浓度远小于对比例1的伏立康唑与内标物的检测浓度，但本技术与对比例1的两个响应值都差别不大，可见，本技术降低了伏立康唑的检测下限。
[0186]
对比例2
[0187]
检测对象：血浆样品；
[0188]
流动相a：体积分数为0.1％甲酸水溶液；
[0189]
流动相b：甲醇；
[0190]
表12为对比例2的液相色谱的梯度洗脱参数。
[0191]
表12梯度洗脱程序的参数
[0192][0193][0194]
其他条件如实施例1，测得0.2μg/ml伏立康唑和200μg/ml内标物的响应值分别为1.8e3、1.8e4。
[0195]
采用对比例2的方法，测得的伏立康唑和内标物响应值均较小。