角膜中伏立康唑的检测方法与流程

技术特征：
1.一种角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：s1：制备角膜供试品溶液；s2：在液相色谱-质谱联用设备上进样检测；其中，所述液相色谱中采用流动相的梯度洗脱；所述流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a和所述流动相b的体积比为70:30-10:90-70:30；所述流动相a为甲酸水溶液；所述甲酸水溶液中的甲酸占所述流动相a的总体积的0.01％-0.5％；所述流动相b为甲酸与乙腈的混合液；所述甲酸占所述流动相b的总体积的0.01％-0.5％；s3：绘制标准曲线并计算所述角膜供试品溶液中伏立康唑的浓度。2.如权利要求1所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，s1中，所述角膜供试品溶液的制备方法包括以下步骤：
①
将角膜剪碎，加入匀浆液，搅拌，研磨，得到角膜组织匀浆液；
②
将所述角膜组织匀浆液与内标物和蛋白沉淀剂涡旋混合、离心；
③
取上清液加入复溶液涡旋混合，即得所述角膜供试品溶液。3.如权利要求2所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，步骤
①
中，所述角膜为动物体的角膜，较佳地为新西兰大白兔的角膜；和/或，所述匀浆液包括meoh和h2o，所述meoh和h2o的体积比为1：(1-10)，较佳地为1：1；和/或，所述角膜与匀浆液的质量比为1：10；和/或，所述搅拌在匀浆均质仪上进行；所述搅拌的速度为8m/sec；所述搅拌的时间为40s；和/或，所述的研磨需要进行3次。4.如权利要求2所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，步骤
②
中，所述内标物为甲苯磺丁脲；和/或，所述离心的温度为4℃；所述离心的离心力为4700g；所述离心的时间为10min；和/或，所述蛋白沉淀剂为乙腈；和/或，所述蛋白沉淀剂与所述角膜的体积比为(1-20):1；较佳地为8:1；和/或，所述复溶液包括乙腈和水；较佳地，所述乙腈和水的体积比为1:4。5.如权利要求1所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，s2中，所述液相色谱-质谱联用设备的色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶，较佳地为x-bridge beh c18；所述色谱柱的规格为2.1mm
×
50mm，2.5μm；所述液相色谱柱温为20-30℃；较佳地为30℃；所述液相色谱进样量为1-20μl；较佳地为1μl；所述甲酸水溶液中的甲酸占所述流动相a的总体积的0.1-0.3％，较佳地为0.2％；所述甲酸水溶液中的甲酸占所述流动相b的总体积的0.1％-0.3％，较佳地为0.2％；所述梯度洗脱的程序为：0-0.30min内，流动相a的体积百分比为70％，流动相b的体积百分比为30％；0.31min-1.81min内，流动相a的体积百分比降低至10％，流动相b的体积百分比升高至90％；1.82min-2.29min内，流动相a的体积百分比为10％，流动相b的体积百分比为90％；2.30min-2.31min内，流动相a的体积百分比升高至70％，流动相b的体积百分比降低至30％；2.32min-2.60min内，流动相a的体积百分比为70％，流动相b的体积百分比为30％，百分比为占所述流动相a和所述流动相b的总体积的百分比；所述流动相的流速为0.5ml/min。
6.如权利要求1所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，s2中，所述质谱为ab sciex triple quadtm 6500plus的质谱仪；和/或，所述质谱的离子源为电喷雾电离esi；和/或，所述质谱的离子化模式为正离子化模式；和/或，所述质谱采用多反应监测模式；较佳地，所述多反应监测模式中，伏立康唑的母离子的质荷比为350.1，子离子的质荷比为281.1；当内标物为甲苯磺丁脲时，甲苯磺丁脲的母离子的质荷比为271.1，子离子的质荷比为155.0；和/或，所述质谱的扫描间隔时间为100ms。7.如权利要求1所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，s3中，所述标准曲线的绘制包括如下步骤：a.配制伏立康唑的标准品工作液和内标工作液；b.将a中的所述的标准品工作液与空白角膜基质混合后，即得标准样品溶液；c.向b中所述的标准样品溶液中加入a中所述的内标工作液和蛋白沉淀剂涡旋混合、离心，取上清液加入复溶液涡旋混合，涡旋混合，即得标准品待测液；所述蛋白沉淀剂为乙腈；所述复溶液包括乙腈和水；所述乙腈和水的体积比为1:4；d.采用s2中所述检测的方法分析c中所述标准品待测液，测得伏立康唑与所述内标工作液中内标物的峰面积比；e.根据所述标准样品溶液的伏立康唑与所述内标工作液中内标物的峰面积比和所述标准品工作液的浓度拟合，得到回归方程，并绘制所述标准曲线，即可。8.如权利要求7所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，步骤a中，所述标准品工作液的配制方法包括如下步骤：将所述伏立康唑与第一稀释液混合，得到标准品储备液；再将所述标准品储备液与第二稀释液混合，即可；和/或，所述内标工作液通过将甲苯磺丁脲与内标稀释液混合制得；较佳地，所述内标工作液的制备方法包括下列步骤：将所述甲苯磺丁脲与所述内标稀释液混合，即得内标储备液；将所述内标储备液与所述内标稀释液混合，即可；较佳地，所述第一稀释液为甲醇；所述第二稀释液为50％甲醇水溶液，所述内标稀释液为乙腈；和/或，所述内标工作液的浓度为400ng/ml；和/或，所述标准品工作液的浓度梯度依次为10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml和10000ng/ml。9.如权利要求7所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，步骤b中，所述标准样品溶液的浓度依次为0.5ng/ml、1.25ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml和500ng/ml。10.如权利要求7所述的角膜中伏立康唑的检测方法，其特征在于，步骤e中，所述回归方程为y＝0.0308x 0.0035(r＝0.9981，r2＞0.98)。

技术总结
本发明公开了一种角膜中伏立康唑的检测方法，包含以下步骤：S1：制备角膜供试品溶液；S2：在液相色谱-质谱联用设备上进样检测；其中，液相色谱中采用流动相的梯度洗脱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A和流动相B的体积比为70:30-10:90-70:30；流动相A为甲酸水溶液；甲酸水溶液中的甲酸占流动相A的总体积的0.01-0.5％；流动相B为甲酸与乙腈的混合液；甲酸占所述流动相B的总体积的0.01％-0.5％；S3：根据标准曲线计算所述角膜供试品溶液中伏立康唑的浓度。本发明中角膜中伏立康唑的检测方法分析用时短，准确性和可靠性高，专属性良好，并且具有较低的检测下限、灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。


技术研发人员：缪峰 李华 季金风 季中秋 刘楚乔 邢溪溪 耿家豪
受保护的技术使用者：益诺思生物技术南通有限公司
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2022/4/29