一种液基细胞保存液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于检测试剂制备技术领域，具体涉及一种液基细胞保存液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.世卫组织(who)推荐的早期发现癌变的方法，是“脱落细胞学检测”。此方法是将人体各部位的分泌物(如痰液等)、体液(如胸、腹水、脑脊液等)、代谢物(如尿液)以及人为提取的细胞(如刷取的宫颈细胞、细针穿刺样本、各类刷洗液等)中的脱落下的细胞进行有效收集，然后在显微镜下进行形态比对，发现病变。除了宫颈癌外，脱落细胞学技术也可应用于肺癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、胃癌等多种肿瘤的早筛、诊断。
3.1996年美国fda批准了第一代液基薄层细胞制片技术应用于妇科宫颈癌早期筛查，可以去除杂质、保存细胞形态和有效搜集细胞，极大提高诊断率。1999年液基细胞学技术正式进入中国，目前是国际上应用最广泛的一种脱落细胞筛查技术。
4.液基细胞学的关键技术部分，就是保存液。目前，虽然此类保存液技术的实施方案很多，但存在着处理粘液不彻底、红细胞残片残留、保存液功能单一、需要辅助试剂等诸多需要改进的问题。
5.很明显，液基细胞保存液技术，仍需要不断创新，不断优化，不断提升，不断探索出创新技术方案。


技术实现要素：

6.基于上述技术问题本发明的目的在于提供一种液基细胞保存液及其制备方法和应用。本发明提供的液基细胞保存液可快速有效去除细胞样本中的粘液、红细胞和细胞碎片，使有效细胞密集均匀分布。
7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.本发明提供了一种液基细胞保存液，以质量百分含量计，包括如下组分：羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物0.05％～0.2％、肽聚糖0.01％～0.1％、羧甲基壳聚糖0.01％～1.0％、酰胺二肽0.1％～0.5％、2-丙醇5％～40％、磷酸二氢钾0.02％～0.05％、磷酸氢二钠0.1％～0.5％、氯化钠0.5％～1.0％、氯化钾0.01％～0.05％和余量的水。
9.优选的，所述液基细胞保存液包括如下组分：羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物0.1％、肽聚糖0.025％、羧甲基壳聚糖0.05％、酰胺二肽0.25％、2-丙醇10％、磷酸二氢钾0.04％、磷酸氢二钠0.26％、氯化钠0.8％、氯化钾0.02％和余量的水。
10.优选的，所述羧甲基纤维素衍生物包括改性羧甲基纤维素或羧甲基纤维素盐。
11.本发明还提供了上述技术方案所述的液基细胞保存液的制备方法，包括：将所述羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物与肽聚糖和羧甲基壳聚糖混合，得到第一混合溶液；
12.将所述第一混合溶液与磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和酰胺二肽混合，得到第二混合溶液；
13.将所述第二混合溶液与2-丙醇混合，得到所述液基细胞保存液。
14.优选的，得到所述第一混合溶液前，还包括搅拌和静置。
15.优选的，所述搅拌和静置的次数均为2次；每次静置的时间均为24h。
16.本发明还提供了上述技术方案中的液基细胞保存液在制备用于检测细胞样本的试剂盒中的应用。
17.有益效果：
18.本发明提供了一种液基细胞保存液，以质量百分含量计，包括如下组分：羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物0.05％～0.2％、肽聚糖0.01％～0.1％、羧甲基壳聚糖0.01％～1.0％、酰胺二肽0.1％～0.5％、2-丙醇5％～40％、磷酸二氢钾0.02％～0.05％、磷酸氢二钠0.1％～0.5％、氯化钠0.5％～1.0％、氯化钾0.01％～0.05％和余量的水。
19.本发明创新性的将羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物、肽聚糖、羧甲基壳聚糖(cmcs)应用于液基细胞保存液中，且上述三者溶于水后，形成一定粘度的高分子聚合物溶液，可以清除粘液和细胞碎片等杂质；结合酰胺二肽去除红细胞的作用，2-丙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾所具备的固定细胞形态、维持保存液ph值及渗透压的作用，可以达到快速有效去除细胞样本中粘液、红细胞和细胞碎片杂质的作用，保证有效细胞密集均匀分布。
20.其次，本发明提供的液基细胞保存液不仅可以处理宫颈和宫颈内膜等妇科样本，同时可以处理包括痰液、尿液、胸腹水、脑脊液、心包积液、腹腔冲洗液、肺泡灌洗液、细针穿刺和胆汁在内的众多非妇科样本，适用样本类型广泛。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
22.图1为采用实施例1中液基细胞保存液处理后的宫颈细胞制片效果图；
23.图2为采用实施例2中液基细胞保存液处理后的血性胸水制片效果图；
24.图3为采用实施例3中液基细胞保存液处理后的浓痰制片效果图；
25.图4为采用实施例4中液基细胞保存液处理后的甲状腺穿刺样本制片效果图；
26.图5为采用实施例5中液基细胞保存液处理后的乳腺穿刺样本制片效果图；
27.图6为采用实施例6中液基细胞保存液处理后的尿液样本制片效果图；
28.图7为采用实施例7中液基细胞保存液处理后的脑脊液样本制片效果图。
具体实施方式
29.本发明提供了一种液基细胞保存液，以质量百分含量计，包括如下组分：羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物0.05％～0.2％、肽聚糖0.01％～0.1％、羧甲基壳聚糖(cmcs)0.01％～1.0％、酰胺二肽0.1％～0.5％、2-丙醇5％～40％、磷酸二氢钾0.02％～0.05％、磷酸氢二钠0.1％～0.5％、氯化钠0.5％～1.0％、氯化钾0.01％～0.05％和余量的水。
30.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.05％～0.2％的羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物，更优选为0.08％～0.18％，进一步优选为0.1％～0.15％，在本发明在实施例中，将所述羧甲基纤维素的质量百分含量具体设置为0.05％、0.1％、
0.2％和0.15％，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
31.本发明所述的羧甲基纤维衍生物优选包括改性羧甲基纤维素或羧甲基纤维素盐。本发明所述的羧甲基纤维素及制备所述纤维素衍生物的羧甲基纤维素的粘性优选为600～1000mpa.s，更优选为800mpa.s。本发明对所述羧甲基纤维素盐没有特殊限定，任何羧甲基纤维素盐均可，如羧甲基纤维素钠。
32.本发明所述的改性羧甲基纤维素羧甲基纤维素的制备方法优选包括以水溶解羧甲基纤维素，依次与氢氧化钠和冰醋酸混合，静置，得到所述改性羧甲基纤维素。
33.本发明优选以水溶解羧甲基纤维素，得到羧甲基纤维素溶液。在本发明中，所述羧甲基纤维素溶液的质量浓度优选为0.05％～0.25％，更优选为0.1％。
34.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.01％～0.1％肽聚糖，优选为0.02％～0.85％，更优选为0.025％～0.75％，在本发明在实施例中，将所述肽聚糖的质量百分含量具体设置为0.04％、0.025％、0.05％、0.07％、0.08％、0.05％和0.02％，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。在本发明中，所述肽聚糖的性质稳定。
35.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.01％～1.0％的羧甲基壳聚糖，优选包括0.03％～0.80％，更优选为0.05％～0.70％，在本发明在实施例中，将所述羧甲基壳聚糖的质量百分含量具体设置为0.6％、0.05％、0.5％、0.4％、0.08％、0.01％和1.0％，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
36.在本发明中，所述羧甲基纤维素、肽聚糖和羧甲基壳聚糖溶于水后，形成一定粘度的高分子聚合物溶液，可以清除粘液、细胞碎片等杂质。
37.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.1％～0.5％的酰胺二肽，优选包括0.15％～0.45％，更优选为0.25％～0.40％，在本发明在实施例中，将所述酰胺二肽的质量百分含量具体设置为0.3％、0.25％、0.2％和0.4％、但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。在本发明中，所述酰胺二肽具备去除红细胞的作用。
38.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括5％～40％的2-丙醇，优选为8％～35％，更优选为10％～25％，在本发明在实施例中，将所述2-丙醇的质量百分含量具体设置为20％、10％、15％、30％、35％和40％，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
39.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.02％～0.05％的磷酸二氢钾，优选为0.025％～0.045％，更优选为0.03％～0.04％，在本发明在实施例中，将所述磷酸二氢钾的质量百分含量具体设置为0.03％、0.04％、0.05％和0.02％，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
40.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.1％～0.5％的磷酸氢二钠，优选为0.15％～0.45％，更优选为0.20％～0.40％，进一步优选为0.26％～0.35％，在本发明在实施例中，将所述磷酸氢二钠的质量百分含量具体设置为0.3％、0.26％、0.2％、0.4和0.5％，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
41.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.5％～1.0％的氯化钠，优选为0.6％～0.9％，更优选为0.7％～0.8％，在本发明在实施例中，将所述氯化钠的质量百分含量具体设置为0.6％、0.75％、0.8％和0.9％，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
42.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液包括0.01％～0.05％的氯化钾，优选包括0.015％～0.04％，更优选为0.20％～0.03％。
43.在本发明中，所述2-丙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾起到固定细胞形态、维持液基细胞保存液ph及渗透压的作用。
44.以质量百分含量计，本发明提供的液基细胞保存液中包括余量的水。在本发明中，所述水优选为蒸馏水。
45.本发明还提供上述技术方案中所述液基细胞保存液的制备方法，包括：将所述羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物与肽聚糖和羧甲基壳聚糖混合，得到第一混合溶液；
46.将所述第一混合溶液与磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和酰胺二肽混合，得到第二混合溶液；
47.将所述第二混合溶液与2-丙醇混合，得到所述液基细胞保存液。
48.本发明在得到所述第一混合溶液前，优选还包括搅拌和静置；所述搅拌和静置的次数均优选为2次，每次静置的时间优选为24h，即，将所述羧甲基纤维素或羧甲基纤维素衍生物与肽聚糖和羧甲基壳聚糖混合后，搅拌，静置24小时，继续搅拌均匀，静置24小时，得到所述第一混合溶液。本发明对所述搅拌的具体操作方式没有特殊限定，本领域常规搅拌操作即可。
49.在本发明中，包括羧甲基纤维素与肽聚糖和羧甲基壳聚糖的第一混合溶液为具有分子空洞结构的胶体溶液，可以阻挡住粘液，使其不移动或移动很小，最终将被包括的细胞成分很容易地从粘液中脱离；本发明巧妙运用羧甲基纤维素、肽聚糖与羧甲基壳聚糖水溶液的自身物理特性，用物理方式将粘液中的细胞安全高效地收集起来，杜绝了传统的裂解液等化学方法对细胞的形态损害。
50.本发明采用分步混合制备原料的方式便于各组分有效溶解并形成稳定体系。
51.本发明还提供了上述技术方案中的液基细胞保存液在制备用于检测细胞样本的试剂盒中的应用。
52.在本发明中，所述细胞样本优选包括分泌物、体液、代谢物和人为提取细胞；在本发明中，所述细胞样本优选包括妇科样本和/或非妇科样本；所述妇科细胞样本优选包括但不限于宫颈样本、颈管细胞样本和子宫内膜细胞样本。在本发明中，所述非妇科细胞样本优选包括但不限于痰液、尿液、胸腹水、脑脊液、心包积液、腹腔冲洗液、肺泡灌洗液、细针穿刺样本、胆汁和血性胸水；所述细针穿刺样本优选包括但不限于乳腺穿刺和甲状腺穿刺。
53.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
54.实施例1
55.液基细胞保存液的组分为：羧甲基纤维素0.1％、肽聚糖0.025％、羧甲基壳聚糖0.05％、酰胺二肽0.25％、2-丙醇10％、磷酸二氢钾0.04％、磷酸氢二钠0.26％、氯化钠0.8％、氯化钾0.02％和余量水。
56.液基细胞保存液的制备方法，具体为：
57.在1000ml玻璃烧杯中，加入350ml蒸馏水，加入0.5g市售600-1000mpa的羧甲基纤维素，再加入0.125g肽聚糖和0.25g羧甲基壳聚糖，搅拌后，静置24小时，搅拌均匀，静置24小时后，再次搅拌均匀，三者形成稳定胶体溶液。加入0.2g磷酸二氢钾、1.3g磷酸氢二钠、4g
氯化钠、0.1g氯化钾、1.25g酰胺二肽，搅拌溶解后，加入100ml的2-丙醇，搅拌溶解，加入蒸馏水至500ml，充分搅拌均匀后，完成配制。
58.实施例2
59.液基细胞保存液的组分为：羧甲基纤维素0.05％、肽聚糖0.04％、羧甲基壳聚糖0.6％、酰胺二肽0.3％、2-丙醇20％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸氢二钠0.3％、氯化钠0.75％、氯化钾0.02％和余量水。
60.液基细胞保存液的制备方法为：与实施例1相同，区别在于，各组分按本实施例配比加入。
61.实施例3
62.采用与实施例2的液基细胞保存液的制备方法，区别在于，液基细胞保存液的组分为：羧甲基纤维素0.2％、肽聚糖0.05％、羧甲基壳聚糖0.5％、酰胺二肽0.2％、2-丙醇15％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钠0.2％、氯化钠0.8％、氯化钾0.02％和余量水。
63.液基细胞保存液的制备方法为：与实施例1相同，区别在于，各组分按本实施例配比加入。
64.实施例4
65.采用与实施例2的液基细胞保存液的制备方法，区别在于，液基细胞保存液的组分为：羧甲基纤维素0.1％、肽聚糖0.01％、羧甲基壳聚糖0.07％、酰胺二肽0.4％、2-丙醇30％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸氢二钠0.3％、氯化钠0.8％、氯化钾0.02％和余量水。
66.液基细胞保存液的制备方法为：与实施例1相同，区别在于，各组分按本实施例配比加入。
67.实施例5
68.采用与实施例2的液基细胞保存液的制备方法，区别在于，液基细胞保存液的组分为：羧甲基纤维素0.15％、肽聚糖0.1％、羧甲基壳聚糖0.08％、酰胺二肽0.2％、2-丙醇30％、磷酸二氢钾0.04％、磷酸氢二钠0.4％、氯化钠0.8％、氯化钾0.02％和余量水。
69.液基细胞保存液的制备方法为：与实施例1相同，区别在于，各组分按本实施例配比加入。
70.实施例6
71.采用与实施例2的液基细胞保存液的制备方法，区别在于，液基细胞保存液的组分为：羧甲基纤维素0.15％、肽聚糖0.05％、羧甲基壳聚糖0.01％、酰胺二肽0.2％、2-丙醇40％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸氢二钠0.3％、氯化钠0.6％、氯化钾0.04％和余量水。
72.液基细胞保存液的制备方法为：与实施例1相同，区别在于，各组分按本实施例配比加入。
73.实施例7
74.采用与实施例2的液基细胞保存液的制备方法，区别在于，液基细胞保存液的组分为：羧甲基纤维素0.1％、肽聚糖0.02％、羧甲基壳聚糖1.0％、酰胺二肽0.4％、2-丙醇35％、磷酸二氢钾0.02％、磷酸氢二钠0.5％、氯化钠0.9％、氯化钾0.02％和余量水。
75.液基细胞保存液的制备方法为：与实施例1相同，区别在于，各组分按本实施例配比加入。
76.应用例1
77.将实施例1～7中制备得到的液基细胞保存液分别用于检测宫颈样本、血性胸水样本、浓痰样本、甲状腺穿刺样本、乳腺穿刺样本、尿液样本和脑脊液样本，检测的具体步骤包括：
78.将检测样本置于本发明中液基细胞保存液中，混匀，静置5分钟，常规制片，he染色，封片和镜检。
79.本发明中上述制片、he染色，封片和镜检均为本领域中的常规操作。
80.结果如图1～7所示，可见，采用本发明提供的液基细胞保存液可以有效清除检测样本中的粘液、红细胞和细胞碎片等杂质，使样本中有效细胞密集均匀分布。
81.由以上实施例可以看出，本发明将羧甲基纤维素、肽聚糖和羧甲基壳聚糖创新性地应用于液基细胞保存液中，采用此液基保存液可以有效清除妇科样本和非妇科样本中的粘液、红细胞和细胞碎片等杂质，处理效果优异，且适用细胞类型广泛。
82.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。