疫苗组合物和选择抗原的方法

2022-04-30 08:13:31 来源：中国专利 TAG：

疫苗组合物和选择抗原的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2019年8月1日提交的美国临时申请第62/881,627号的权益，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。
3.政府支持
4.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的授权号ai107821、ai116969和ai131004在政府支持下进行的。政府享有本发明中的某些权利。
5.序列表
6.本技术含有序列表，所述序列表已经以ascii格式电子提交，并且通过引用以其整体在此并入。创建于2020年7月29日的所述ascii副本命名为“700355-095660wopt_sl.txt”，并且大小为91,331字节。
技术领域
7.本文所描述的技术涉及疫苗组合物、选择用于制备疫苗组合物的抗原或其片段的方法以及其用途。

背景技术：

8.疫苗用于刺激免疫系统以产生对病原性感染的有效应答。然而，现有的疫苗并不总能提供对微生物粘膜感染的预防。具体地，缺乏用于预防作为全球主要的公共卫生问题的如淋病、衣原体或梅毒等性传播感染(sti)的疫苗。发现用于疫苗组合物的新抗原将提供更有效的病原性感染预防和治疗，并且将大大减少与病原性微生物相关的疾病的传播。

技术实现要素：

9.本文所描述的方法和疫苗组合物部分地基于以下发现：先前未鉴定或考虑可能用作来自病原性微生物(例如，淋病奈瑟菌)的抗原的某些多肽可以在受试者中引发免疫应答。本文所描述的鉴定和选择抗原的方法部分地依赖于鉴定预测为免疫原性的多肽(例如，假定蛋白)的方法。
10.一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括源自病原性细菌的至少一种抗原或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段在宿主感染期间由细菌以与参考水平相比增加的水平表达。
11.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括源自病原性细菌的至少一种抗原或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段在宿主感染期间由细菌以与参考水平相比降低的水平表达。
12.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括源自病原性细菌的至少一种抗原或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段的每百万中转录物每千碱基的读段(rpkm)水平大于25。
13.在一个实施例中，所述rpkm水平来自鉴定为病原体的宿主受试者。
14.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括源自病原性细菌的至少一种抗原或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段的每百万中转录物每千碱基的读段(rpkm)水平大于50。
15.在这些方面中的任一方面的一个实施例中，所述rpkm水平来自鉴定为病原体的宿主受试者。
16.在另一个实施例中，所述病原性细菌是粘膜细菌。
17.在另一个实施例中，所述病原性细菌是淋病奈瑟菌。
18.在另一个实施例中，所述抗原选自由以下组成的组：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947。
19.在另一个实施例中，所述疫苗组合物包括两种或更多种抗原或对此类抗原进行编码的核酸，所述抗原选自由以下组成的组：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947。
20.在另一个实施例中，所述疫苗组合物包括至少一种抗原或对此类抗原进行编码的核酸，所述抗原选自由以下组成的组：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947，以及至少一种另外的抗原或对至少一种另外的抗原进行编码的核酸。
21.在另一个实施例中，所述至少一种另外的抗原选自由以下组成的组：孔蛋白、菌毛蛋白、tbpa、tbpb、los、metq、slic、mtre、bama、acp。
22.在另一个实施例中，所述抗原由多种淋病奈瑟菌菌株表达。
23.在另一个实施例中，所述细菌感染所述宿主受试者的粘膜。
24.在另一个实施例中，所述宿主受试者是哺乳动物。
25.在另一个实施例中，所述宿主受试者是人。
26.在另一个实施例中，所述细菌感染所述宿主受试者的生殖器、嘴巴、眼睑、鼻子、皮肤和/或直肠。
27.在另一个实施例中，所述疫苗组合物进一步包括佐剂。在另一个实施例中，所述疫苗组合物进一步包括外膜囊泡。在另一个实施例中，所述一种或多种抗原或其片段或对抗原或其片段进行编码的核酸的至少一部分存在于所述外膜囊泡之中或之上。在另一个实施例中，所述佐剂是明矾。
28.在另一个实施例中，至少一种抗原或其片段是假定蛋白。
29.在另一个实施例中，至少一种抗原或其片段是脂蛋白。
30.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo0416多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
31.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo0690多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
32.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo0948多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
33.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo1043多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
34.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo1215多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
35.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo1701多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1868、ngo2119-ngo0227、
ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
36.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括以下抗原多肽或对此类抗原多肽或其片段进行编码的核酸：ngo0416；ngo0690；ngo0948；ngo1043；ngo1215；和ngo1701。
37.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo0690多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及ngo1701多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
38.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括ngo690多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸、ngo0948多肽或其片段以及ngo1701多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
39.另一方面，本文描述了一种在受试者中引发对病原性细菌的免疫应答的方法，所述方法包括：向受试者施用如本文所描述的疫苗组合物。
40.在一个实施例中，所述受试者是哺乳动物。
41.在另一个实施例中，所述受试者是人。
42.在另一个实施例中，所述施用是通过注射、口服或鼻内施用进行的。
43.在另一个实施例中，所述细菌是淋病奈瑟菌。
44.在另一个实施例中，所述疫苗组合物引发针对多种细菌菌株具有保护性的免疫应答。
45.在另一个实施例中，所述疫苗组合物引发针对多种淋病奈瑟菌菌株具有保护性的免疫应答。
46.另一方面，本文描述了一种选择用于制备疫苗组合物的抗原的方法，所述方法包括：
47.(a)对来自感染有细菌的受试者的样品的rna进行测序，其中所述样品包括由所述细菌表达的rna；
48.(b)将在步骤(a)中获得的rna序列信息与从在培养物中生长的所述细菌中获得的rna序列信息进行比较，并且鉴定当与参考水平相比时在感染期间表达水平受到调节的一组候选转录物；
49.(c)检测在步骤(b)中鉴定的所述一组候选转录物的开放阅读框的以下性质中的一个或多个性质：
50.i.每百万中转录物每千碱基的读段(rpkm)水平大于25；
51.ii.免疫原性概率评分为至少0.4；
52.iii.经编码的多肽的细胞定位处于细胞膜、周质或细胞外膜内；
53.iv.所述经编码的多肽不具有在人与其它细菌物种之间保守的氨基酸序列；
54.v.所述经编码的多肽具有在多个细菌菌株中保守的氨基酸序列；并且
55.vi.所述经编码的多肽是假定蛋白，
56.其中选择包括所述性质中的一个或多个性质的经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。
57.在一个实施例中，选择包括步骤c中的所述性质中的两个或更多个性质的所述经
no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57、seq id no:58、seq id no:59、seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:64、seq id no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71和seq id no:72。
76.定义：
77.为了方便起见，以下提供了在本说明书、实例以及所附权利要求书中使用的一些术语与短语的意义。除非另外说明或从上下文中隐含，否则以下术语和短语包含以下提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定实施例，并且这些定义不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅受权利要求的限制。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。如果本领域中的术语使用与本文提供的该术语的定义有明显偏差，则以本说明书中提供的定义为准。
78.如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或野生动物。灵长类动物包含黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包含小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和野味动物包含牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐狸、狼)、禽类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)以及鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
79.优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除了人之外的哺乳动物可以有利地用作代表免疫和免疫应答的动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
80.受试者可以是先前已经被诊断出患有或被鉴定为患有或具有病状(例如已被诊断出患有感染)或与此类病状有关的一种或多种并发症的受试者，并且任选地，其已经接受过某种病状或与所述病状有关的一种或多种并发症的治疗。可替代地，受试者也可以是先前未被诊断为患有所述病状或与所述病状有关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是针对病状或与所述病状有关的一种或多种并发症表现出一种或多种危险因素的受试者，或者是不表现出危险因素的受试者。
81.针对特定病状的“需要治疗的受试者”可以是患有所述病状、被诊断为患有所述病状或处于发展所述病状(例如，感染)的风险中的受试者。
82.如本文所用，“宿主受试者”是已经感染有病原体、微生物或细菌的受试者。宿主受试者可以是有症状的或无症状的。宿主受试者也可以是微生物的载体。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，宿主受试者是哺乳动物。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，宿主受试者是人。
83.如本文所用，“免疫应答”是指免疫系统细胞，如b细胞、t细胞(cd4或cd8)、调节性t细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、nkt细胞、nk细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜中性粒细胞对刺激物(例如对疫苗组合物、抗原或其片段)的应答。在本文所描述的方面的一些实施例中，所述应答对至少一种特定抗原(例如，淋病奈瑟菌抗原)是特异性的，并且是指cd4 t细胞、cd8 t细胞或b细胞通过其抗原-特异性受体的应答。这些细胞的此类应答可以包含例如细胞毒性、增殖、抗体、细胞因子或趋化因子产生、运输或吞噬作用，并且可以取决于经历应答的免疫细胞的性质。
84.如本文所用，术语“引发免疫应答”是指刺激免疫应答、诱导或增加对病原性微生物的免疫应答。如本文所用，术语“引发免疫应答”可以意指以下中的任何一种或多种：(i)预防感染或再感染，如在传统疫苗中；(ii)减轻症状的严重程度或消除症状；以及(iii)基本或完全消除相关病原性微生物或病症。因此，引发免疫应答可以是预防性地(感染前)或治疗性地(感染后)引起的。在本文所描述的本发明方法中，预防性治疗是优选的模式。根据特定实施例，本文所描述的疫苗组合物和方法治疗，包含预防性和/或治疗性地免疫宿主动物以抵抗微生物感染(例如，细菌)。本发明技术的方法可用于赋予受试者预防性和/或治疗性免疫力。本文所描述的方法也可以在用于生物医学研究应用的受试者上实施。
85.如本文所用，术语“感染”或“宿主感染”或“传染性疾病”或“微生物感染”是指微生物在受试者中的生长、增殖、传播和/或存在。在一些情况下，感染可以引起宿主的免疫应答，从而导致与疾病相关的症状。感染可以通过接触、接触雾化液滴(咳嗽、打喷嚏等)、受污染的针头、受污染的体液或通过性传播从一个受试者传播到另一个受试者。感染可以以疾病的至少一种症状为特征，如疼痛、黏膜分泌物增多、出血、咳嗽、头痛、皮肤异常、发烧、喉咙痛、淋巴结肿大、脱发、肌肉酸痛、溃疡、或与感染相关的任何其它症状。示例性感染或传染性疾病包含但不限于淋病、梅毒、衣原体、获得性免疫缺陷综合征(aids)、肝炎、念珠菌病、人乳头瘤病毒(hpv)感染、滴虫病、疱疹、肺结核、链球菌感染(例如，链球菌性咽喉炎)、大肠杆菌感染、流感、肺炎、耳部感染、普通感冒、水痘、猫抓病、狂犬病、腺病毒、细支气管炎、哮吼、脑炎、第五种疾病、手足口病、脓疱疮、肉毒杆菌中毒、李斯特菌感染、mrsa感染、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、脊髓灰质炎、红眼病、落基山斑疹热、沙门氏菌感染、辛氏菌感染、带状疱疹、鼻窦炎、葡萄球菌感染、破伤风、扁桃体炎、中毒性休克综合征、尿路感染、疣、百日咳、寨卡病毒感染或由本领域已知的微生物引起的任何其它感染。
86.本文使用的术语“疫苗组合物”定义为用于引发或刺激针对组合物内的抗原或其片段的免疫应答以保护或治疗生物体免于疾病的组合物。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，疫苗组合物是减毒或杀死的微生物(例如，细菌、病毒或真菌)或抗原蛋白或源自所述抗原蛋白的核酸的悬浮液，用于预防、改善或治疗传染性疾病。术语“疫苗组合物”和“疫苗”可互换使用。
87.如本文所用，“病原性细菌(pathogenic bacteria)”或“病原性细菌(pathogenic bacterium)”是引起传染性疾病或感染的细菌微生物。示例性细菌包含但不限于淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitides)、梅毒螺旋体(treponema pallidum)、解脲脲原体(ureaplasma urealyticum)、阴道毛滴虫(trichomona vaginalis)、汉氏巴尔通体(bartonella henselae)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、幽门螺杆菌(helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(legionella pneumophilia)、分枝杆菌(mycobacteria sps)(如生殖支原体(m.genitalium)、人型支原体(m.hominis)、结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、堪萨斯分支杆菌(m.kansaii)、戈氏分支杆菌(m.gordonae))、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)(a族链球菌)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)(b族链球菌)、链球菌(草绿色族)、粪链球菌(streptococcus faecalis)、表皮链球菌
(streptococcus epidermidis)、链球菌(厌氧菌)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌(pathogenic campylobacter sp.)、肠球菌(enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、白喉杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌(corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringers)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、布鲁氏杆菌(brucella abortus)、多杀巴斯德菌(pasteurella multocida)、拟杆菌(bacteroides sp.)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(streptobacillus moniliformis)、雅司螺旋体(treponema pertenue)、钩端螺旋体(leptospira)、巴西诺卡氏菌(nocadia brasiliensis)、赫姆斯疏螺旋体(borrelia hermsii)、伯氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)和衣氏放线菌(actinomyces israelli)。
88.如本文所用，术语“抗原”是指源自病原性微生物(例如，细菌、病毒或寄生虫)的分子。通常，抗原与宿主受试者的抗体配体结合，并且能够在宿主受试者体内引发或引起抗体免疫应答。抗原可以是多肽、蛋白质、核酸或其它分子。术语“抗原决定簇”是指抗原上被抗原结合分子(例如，抗体、抗体试剂或其多肽片段)识别，并且更具体地被所述分子的抗原结合位点识别的表位。
89.如本文所用，术语“抗原片段”是指保留引发免疫应答能力的抗原的一个或多个部分。所述片段可以是对抗原或多肽的一部分进行编码的核酸。
90.如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”和“经编码的多肽”在本文中可互换使用，以表示通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包含经过修饰的氨基酸(例如，磷酸化的、糖化的、糖基化的等)和氨基酸类似物，而不论其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”通常用于指相对较大的多肽，而术语“肽”通常用于指较小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠的。当提及基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包含基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述的其它等同物、变体、片段和类似物。
91.如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”是指掺入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选地为聚合物分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可以是变性双链dna的一条核酸链。可替代地，其可以是不源自任何双链dna的单链核酸。在一方面，所述核酸可以是dna。在另一方面，所述核酸可以是rna。合适的dna可以包含例如基因组dna或cdna。合适的rna可以包含例如mrna。
92.如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何基因元件。载体可以包含但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转位子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等。
93.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，可以对如本文所描述的多肽或核酸进行工程化。如本文所用，“工程化”是指通过人手进行操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如其序列，通过人的手进行操纵而不同于自然存在的方面时，则认为该多肽是“工
程化”的。如通常的实践并为本领域技术人员所理解的，即使实际的操纵是在现有实体上进行的，工程化的细胞的后代通常也仍被称为“工程化的”。
94.如本文所用，术语“源自”是指分子、物质、多肽、核酸、糖、脂质等来自亲本物质(例如，细胞或膜)或生物体(例如，微生物)的方面。在抗原及其片段的上下文中，术语“源自”涵盖由如本文所描述的微生物表达、纯化或分离的抗原或其片段。仅通过实例的方式，抗原ngo1701源自淋病奈瑟菌。
95.如本文所用，术语“药物组合物”是指如本文所描述的与药学上可接受的载体，例如医药工业中常用的载体进行组合的抗原或其片段。短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏性应答或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些抗原、化合物、材料、组合物和/或剂型。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是除水以外的载体。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是乳膏、乳剂、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是人工的或工程化的载体，例如，在自然界中不会发现活性成分存在的载体。
96.如本文所用，术语“施用”是指通过使疫苗组合物在期望位点至少部分递送的方法或途径将如本文所描述的疫苗组合物、抗原或其抗原片段置于受试者中。包括本文所描述的抗原或抗原片段的药物和疫苗组合物可以通过产生对受试者的有效治疗的任何合适的途径施用。
97.如本文所用，术语“多个”是指至少两个、超过两个或大于两个的数量。在细菌菌株的上下文中，多个是指本领域已知的给定细菌的两个或更多个菌株。
98.术语“减少(decreased)”、“降低(reduced、reduction)”或“抑制(inhibit)”在本文中全部用于表示统计学上显著的量的降低。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，“降低”、“减少”或“抑制”通常意味着与参考水平相比降低至少10％(例如，不存在给定的治疗或疫苗组合物)，并且可以包含例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低”或“抑制”不涵盖与参考水平相比的完全抑制或减少。“完全抑制”是与参考水平相比的100％的抑制。减少可以优选地为降低至无给定病症的个体的正常范围内所接受的水平。
99.术语“增加(increased、increase)”、“增强(enhance)”或“激活(activate)”在本文中全部用于表示统计学上显著的量的增加。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，术语“增加”、“增强”或“激活”可以表示与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或高达并且包含100％的增加或10-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比增加至少约2倍、至少约3倍、或至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍、或2倍到10倍或更大之间的任何增加。在标记或症状的情况下，“增加”是所述水平的统计学上显著的增加。
100.如本文所用，术语“调节(modulate)”或“调制(modulation)”是指包含增加或减少
diagnosis and therapy)》,第19版,默克夏普公司(merck sharp&dohme corp.)出版,2011(isbn 978-0-911910-19-3)；robert s.porter等人(编辑),《分子细胞生物学与分子医学百科全书(the encyclopedia of molecular cell biology and molecular medicine)》,布莱克威尔科学有限责任公司(blackwell science ltd.)出版,1999-2012(isbn 9783527600908)；以及robert a.meyers(编辑)，《分子生物学与生物技术：综合案头参考(molecular biology and biotechnology:a comprehensive desk reference)》，由vch出版有限公司出版,1995(isbn 1-56081-569-8)；werner luttmann的《免疫学(immunology)》,由elsevier出版,2006；《詹韦氏免疫生物学(janeway'simmunobiology)》,kenneth murphy,allan mowat,casey weaver(编辑),泰勒和弗朗西斯有限公司(taylor&francis limited),2014(isbn 0815345305、9780815345305)；《勒温基因xi(lewin's genes xi)》,由琼斯和巴特利特出版社(jones&bartlett publishers)出版,2014(isbn-1449659055)；michael richard green和joseph sambrook,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》,第4版,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),美国纽约州冷泉港(cold spring harbor,n.y.,usa)(2012)(isbn1936113414)；davis等人,《分子生物学的基本方法(basic methods in molecular biology)》,爱思唯尔科学出版有限公司(elsevier science publishing,inc.),美国纽约(2012)(isbn044460149x)；《酶学实验室方法：dna(laboratory methods in enzymology:dna)》,jon lorsch(编辑)爱思唯尔,2013(isbn 0124199542)；《分子生物学现代方法(current protocols in molecular biology，cpmb)》,frederick m.ausubel(编辑),约翰威利父子出版公司(john wiley and sons),2014(isbn 047150338x、9780471503385),《蛋白质科学现代方法(current protocols in protein science(cpps)》,john e.coligan(编辑),约翰威利父子出版公司,2005；以及《免疫学现代方法(current protocols in immunology(cpi))》(john e.coligan、adamkruisbeek、david h margulies、ethan m shevach、warren strobe(编辑)约翰威利父子出版公司,2003(isbn 0471142735、9780471142737)，所述文献的全部内容通过引用整体并入本文。
111.其它术语在本文所描述的疫苗组合物和方法的各个方面的描述内定义。
附图说明
112.图1示出了候选抗原选择策略(cass)：发现阶段1(dp-1)。在女性和男性受试者的天然粘膜感染期间表达的淋球菌基因编码163种假定蛋白*，在两个数据集中其mrna表达高于50rpkm(每百万映射读段中转录物每千碱基的读段数)。使用vaxijen对163名候选者进行计算机分析预测112种蛋白质具有抗原性；使用psort、protein predict和gneg-mploc进行的细胞定位分析预测43种蛋白质是胞质的，并且69种蛋白质是非胞质的。*rockhopper分析
113.图2示出了cass：发现阶段2(dp-2)。在万维网《violinet.org/vaxgen/index.php》和blastp(blast 2.2.26 )上使用vaxgen对来自dp-1的69种非胞质淋球菌假定蛋白进行计算机分析，预测11种假定蛋白共享与人、小鼠和大肠杆菌蛋白的高氨基酸序列相似性。blastp对其余58种假定蛋白的氨基酸序列分析预测了淋病奈瑟菌中的保守性。使用hmtmm进行的结构复杂性分析预测3种蛋白质具有》4个跨膜结构域(tm)，55种蛋白质具有0-4个tm。使用psort、protein predict和gneg-mploc进行的膜定位分析预测28种假定蛋白与内
膜(im)相关，9种与周质(p)相关，21种与外膜(om)相关(面向周质或细胞外空间(p/om/ex))。使用phobius、secretomep和signalp 5.0进行的拓扑和信号肽分析预测了9种具有胞质拓扑/功能的im假定蛋白、3种细胞外蛋白和7种假定的菌毛相关蛋白。最终的cass池由36种假定蛋白构成：在ncbi blast、uniprotkb、pfam分析中，20个与其它细菌蛋白具有推定的功能或保守结构域相似性，并且16个是功能未知的完全假定蛋白。
114.图3a-3b示出了对6种假定蛋白候选者的网络分析。图3a展示了淋球菌基因表达网络中的假定蛋白位置。图3b展示了网络中淋球菌基因的程度值(y轴)和介数(x轴)值。指示了ngo0690(黄点)和ngo0948(红点)的位置。
115.图4a-4f示出了淋球菌假定蛋白是免疫原性的。通过elisa在来自用其中明矾作为佐剂的图4a)ngo0416；图4b)ngo0690；图4c)ngo0948；图4d)ngo1043；图4e)ngo1215和图4f)ngo1701免疫的小鼠的血清中测量的总igg(μg/ml
±
sem)。示出了免疫前(pr)和免疫血清(第2周、第4周和第6周)。*p显著(0.001-0.05)通过图克多重比较测试的单向方差分析进行。
116.图5a-5b示出了与整个淋病奈瑟菌生物体的血清交叉反应性。图5a示出了ff淋病奈瑟菌菌株f62、fa1090、u80401和u80402(2-4
×
108个总生物体/槽)与合并的小鼠免疫血清(第6周)一起温育对6种假定蛋白(1:200稀释)中的每一种的免疫印迹。图5b示出了如图5a中的细菌的sds-page凝胶和考马斯染色。
117.图6a-6f示出了通过elisa与整个淋病奈瑟菌生物体的血清交叉反应性。通过elisa在来自用图6a)ngo0416；图6b)ngo0690；图6c)ngo0948；图6d)ngo1043；图6e)ngo1215和图6f)ngo1701(针对ff淋病奈瑟菌菌株f62(黑条)、fa1090(灰条)、u08401(条纹)和u08402(虚线)测试)免疫的小鼠的血清中测量总igg(μg/ml
±
sem)。免疫前血清(白条)和合并的免疫血清(第6周)(1:100)。*,****p著通过图克多重比较测试的单向方差分析进行。
118.图7a-7b示出了淋球菌假定蛋白在整个淋病奈瑟菌生物体中的膜定位和表面表达。图7a示出了来自淋病奈瑟菌f62和fa1090菌株(总蛋白含量为5μg)的omp的免疫印迹，点样在硝酸纤维素上，并与混合的小鼠免疫血清(第6周)温育为6种假定蛋白中的每一种和作为对照的孔蛋白(1:200稀释)。图7b示出了福尔马林固定(ff)淋病奈瑟菌菌株f62、fa1090、u80401和u80402与针对ngo0690(红线)、针对ngo0948(蓝线)和针对ngo1701(绿线)和免疫前血清(黑线)的免疫小鼠血清一起温育(1:200)。使用fitc标记的次级抗小鼠igg抗体通过流式细胞术检测抗体表面结合。未经染色的细菌对照(深灰色直方图)；fitc标记的抗小鼠次级抗体对照(浅灰色直方图)。荧光峰向右移位指示抗体结合。直方图代表一式三份的实验。
119.图8a-8c示出了血清杀菌活性(sba)。免疫小鼠血清与图8a)ngo0690和图8b)ngo1710；与抗ngo0690 抗ngo1701血清一起温育的图8c)一起温育的淋病奈瑟菌f62的存活百分比(t30/t0
±
sem下的cfu)。10％nhs对照：灰色条。佐剂对照血清：白条。免疫血清：黑条。
*,**,***,****
p显著通过单向方差分析通过未经校正的费希尔lsd测试进行。
120.图9示出了表2：对6种淋球菌假定蛋白候选者的cass汇总。
121.图10a-10c示出了针对pib(白色条)和ngo0690(图10a，灰色条)、ngo0948(图10b，灰色条)和ngo1701(图10c，灰色条)测量的人血清中的总抗原特异性igg。板用2μg/ml的纯化的天然淋球菌孔蛋白pib(阳性对照，白条)和纯化的重组a)ngo0690、b)ngo0948和c)
ngo1701(灰色条)包被。来自不同dgi患者(s1至s7)的血清以1:100的稀释度使用。用次级抗人ap连接的次级抗体测量蛋白质的总人igg，通过elisa检测并报告为从一式四份的孔中减去空白
±
sem的o.d.405读数)。
122.图11示出了来自用组合抗原免疫的小鼠的血清通过elisa比来自用单独蛋白免疫的小鼠的血清更好地识别淋病奈瑟菌f62生物体。通过elisa测量仅用明矾(白条)、ngo0690(虚线)、ngo1701(细条纹)、ngo0948(水平条纹)、ngo0690/ngo1701(方格条)和ngo0690/ngo0948/ngo1701(粗条纹条)针对抗ff淋病奈瑟菌菌株f62免疫的小鼠的合并血清的总igg(μg/ml
±
sem)。免疫前血清，灰条。*,**p显著通过克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩多重比较测试进行。
123.图12a-12c示出了血清杀菌测定(sba)。带有佐剂对照血清(白条)的淋病奈瑟菌f62存活率(％t30/t0
±
sem)；图12a：抗ngo0690/ngo1701小鼠血清(方格条)；图12b：抗ngo0948(灰色条)和图12c：指定稀释度的抗ngo0690/ngo1701/ngo0948(粗条纹条)。*,******p显著通过单向方差分析通过邓尼特多重比较测试与佐剂对照相比进行。
具体实施方式
124.传染性微生物是世界上导致死亡的主要原因之一，并且疫苗已成为减轻此负担的有希望的生物医学干预措施。疫苗还可以预防感染从一个宿主传播到另一个宿主。然而，使用传统抗原选择原理开发的疫苗对于某些微生物(例如，淋病奈瑟菌)在很大程度上失败了。尝试使用传统疫苗开发建议的抗原，如荚膜多糖抗原或其它表面蛋白，并没有产生有效的疫苗。如本文所描述的，这似乎部分是由于这些感染中的保护性免疫机制尚未完全了解，并且可用模型无法准确再现微生物和宿主免疫系统的相互作用。本文描述的是选择实际上具有免疫保护作用的抗原，通过鉴定在相关宿主感染期间其表达受到差异调节或高度表达(例如，在相关宿主感染期间)的蛋白质。具体地，目前被归类为假定的蛋白质已被证明是免疫保护性抗原的极好来源。
125.本文证明这些来自病原性微生物(例如，淋病奈瑟菌)的新抗原可以在受试者中引发免疫应答。本文所描述的鉴定和选择抗原的方法部分地依赖于鉴定预测为免疫原性和膜相关的在微生物的多个菌株中是保守的多肽(例如，假定蛋白)的方法。
126.淋病奈瑟菌是性传播感染(sti)淋病的病原体，这是一种在全世界发病率很高的疾病，其中估计每年有8700万例女性淋病奈瑟菌感染可能导致生殖道并发症(盆腔炎(pid))、异位妊娠、不孕症和播散性淋球菌感染(dgi)。目前针对淋病的治疗和药理学方法已因全球抗生素耐药性增加而受到损害，包含对fda批准的最后一种抗生素头孢克肟(cefixime)的耐药性。抗药性淋病奈瑟菌现已被疾病控制中心(cdc)列为紧急威胁类别。迫切需要一种针对淋病奈瑟菌的有效疫苗。此类疫苗的开发主要由于缺乏成功的抗原、模拟淋病奈瑟菌感染的动物模型不足以及缺乏免疫相关性而被推迟。
127.已发现如本文所描述的微生物感染在宿主受试者中具有环境决定的基因表达。因此，本文所描述的方法和疫苗组合物部分地涉及发现由淋病奈瑟菌表达的新抗原。
128.在任何实施例的一个方面，本文描述了一种基于体内基因表达或mrna转录物表达的每百万中转录物每千碱基的读段数大于25的选择抗原的方法。
129.一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括源自微生物(例如病原性细菌)、由微
生物表达或由微生物编码的至少一种抗原或其片段，或对此类抗原或其片段进行编码的核酸)，其中所述抗原或其片段在宿主感染期间由微生物(例如细菌)以与参考水平相比增加的水平表达。
130.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括源自微生物(例如病原性细菌)、由微生物表达或由微生物编码的至少一种抗原或其片段，或对此类抗原或其片段进行编码的核酸)，其中所述抗原或其片段在宿主感染期间由微生物(例如细菌)以与参考水平相比降低的水平表达。
131.另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括源自微生物(例如病原性细菌)、由微生物表达或由微生物编码的至少一种抗原或其片段，或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段的每百万中转录物每千碱基的读段数(rpkm)为25或更大。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，rpkm为25或更大、30或更大、35或更大、40或更大、45或更大、或50或更大。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，rpkm为50或更大。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，rpkm是宿主感染期间的rpkm。
132.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，源自微生物(例如病原性细菌)、由微生物表达或由微生物编码的至少一种抗原或其片段，或对此类抗原或其片段进行编码的核酸)，其中所述抗原或其片段的每百万中转录物每千碱基的读段数(rpkm)为25或更大，并且所述抗原或其片段在宿主感染期间由微生物(例如细菌)以与参考水平相比被调节的水平表达。
133.在宿主感染期间表达抗原的病原性微生物可以通过从宿主中分离或去除生物样品来收集。优选地从感染位点去除生物样品。生物样品可以取自宿主的任何区域(例如，生殖器、喉咙或任何其它粘膜区域)。仅通过实例的方式，可以收集受影响区域的拭子。
134.收集生物样品后，可以测量抗原的表达水平并与参考水平进行比较。可以使用本领域已知的用于测量核酸或多肽表达的任何方法。可以用于测量核酸或多肽表达的测定的非限制性实例包含dna和rna测序、下一代测序、rt-pcr、微阵列、蛋白质组学、荧光测定、转录组学、基因芯片测定、全基因组测序、甲基化特异性寡核苷酸阵列和微流体测定。
135.当与参考水平相比时，从受感染宿主受试者中分离的微生物的核酸或多肽表达水平可以表现出核酸或多肽的表达水平增加至少10％或更多，例如10％或更多、50％或更多、100％或更多、200％或更多、500％或更多或1000％或更多。
136.类似地，当与参考水平相比时，从受感染宿主受试者中分离的微生物的核酸或多肽表达水平可以表现出核酸或多肽的表达水平和/或活性减少至少10％或更多，例如10％或更多、50％或更多、100％或更多、200％或更多、500％或更多或1000％或更多。
137.在rna测序的背景下，每百万中转录物每千碱基的读段水平(rpkm)可以用于确定在宿主感染期间分离的微生物中核酸的表达水平。
138.本领域已知的是，当微生物感染宿主受试者时，宿主微环境中的铁水平可能会被耗尽并改变各种抗原的表达水平。本文设想的是，宿主微环境中的其它变化可以在感染期间调节微生物的基因表达(例如，ph、免疫细胞分泌物、渗透压、温度、氧气可用性、厌氧条件、其它微生物的存在等)。
139.本文所描述的参考水平可以来自体外培养的微生物。微生物的体外培养条件可以是本领域已知的允许所述微生物增殖和/或生长的培养条件。
140.例如，体外培养的微生物可以在营养肉汤中培养，包含但不限于淋球菌(gc)肉汤，或在化学限定的培养基(cdm)中培养。体外培养的微生物可以进一步在培养基中补充铁进行培养。培养基可以补充有本领域已知的允许微生物在体外增殖和/或生长的任何分子、试剂或化合物。微生物也可以与来自哺乳动物受试者的细胞一起培养。例如，微生物可以与来自人受试者的血细胞、免疫细胞(例如，多形核嗜中性粒细胞)或上皮细胞一起培养。
141.优选地，体外培养的微生物与如本文所描述的在宿主感染期间表达抗原的微生物基本上相同，用于比较影响给定抗原的表达的体外环境和体内环境。
142.病原性微生物可以表达许多抗原，包含但不限于与其感染宿主受试者和增殖的能力有关的抗原。例如，本文所描述的抗原可以用于检测宿主受试者中生物体的存在，产生针对抗原的抗体，或产生新的感染治疗剂。
143.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段源自病原性细菌。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段源自感染宿主受试者的粘膜的细菌。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段源自淋病奈瑟菌。
144.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段是由病原性细菌表达的多肽。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段是由感染宿主受试者的粘膜的细菌表达的多肽。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段是由淋病奈瑟菌表达的多肽。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原是由多种淋病奈瑟菌菌株表达的多肽。
145.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段由病原性细菌的基因组中的核酸编码。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段由感染宿主受试者的粘膜的细菌基因组中的核酸编码。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原或其片段由淋病奈瑟菌基因组中的核酸编码。
146.抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由多种细菌菌株(例如，淋病奈瑟菌)表达或编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大百分比的所有已知细菌菌株(例如，淋病奈瑟球菌)表达或编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大百分比的所有已知病原性细菌菌株(例如，淋病奈瑟菌)表达或编码的抗原。
147.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大百分比的已知在去年疾病病例中存在的所有细菌菌株表达或编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大百分比的已知在过去十年的疾病病例中存在的所有细菌菌株表达或编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大的
百分比的已知在2018年疾病病例中存在的所有细菌菌株表达或编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大百分比的已知在2009-2018年疾病病例中存在的所有细菌菌株表达或编码的抗原。
148.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大百分比的截至2019年4月pubmlst数据库中可用的4198个淋球菌基因组表达或编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更大百分比的截至2019年4月pubmlst数据库中可用的4198个淋球菌基因组和不存在于截至2019年4月pubmslt数据库中可用的288个乳糖发酵奈瑟菌基因组表达或编码的抗原。
149.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是通过全局方式表达或以全局方式编码的抗原。如本文所用，“全局方式”是指抗原在来自非洲、欧洲、亚洲、南美洲和北美洲的每一个的至少一种临床分离物中表达或编码。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是在过去一年内通过全局方式表达或以全局方式编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是过去十年内通过全局方式表达或以全局方式编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是2018年期间通过全局方式表达或以全局方式编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是2009-2018年通过全局方式表达或以全局方式编码的抗原。
150.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是通过多半球方式表达或以多半球方式编码的抗原。如本文所用，“多半球方式”是指抗原在来自至少两个半球的至少一种临床分离物中表达或编码。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是在过去一年内通过多半球方式表达或以多半球方式编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是在过去十年中通过多半球方式表达或以多半球方式编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是在2018年期间通过多半球方式表达或以多半球方式编码的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，抗原(或其片段，或对前述内容进行编码的核酸)可以是在2009-2018年通过多半球方式表达或以多半球方式编码的抗原。
151.当抗原被认为由基因组表达或编码在基因组中时，涵盖天然存在的等位基因。天然存在的等位基因可以是在抗原序列的整个长度上具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或更高的序列相似性或同一性的等位基因。具有小于60％的序列相似性或同一性的序列不被认为是天然存在的淋病奈瑟菌菌株中的等位基
因，并且也不能作为确定抗原由给定基因组表达或在给定基因组中编码的基础。
152.抗原和其片段可以在受试者中引发免疫应答。本文所描述的抗原或其片段包括被免疫系统识别的表位。术语“表位”是被结合蛋白结合的抗原的区域或部分，并且包含能够与免疫球蛋白或t细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施例中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可以具有特定三维结构特性和/或特定电荷特性。可以通过以下来确定表位：获得抗体：抗原复合物的x射线晶体结构，并且确定抗原上的哪些残基在所关注抗体上的残基的指定距离内，其中所述指定距离为或更小，例如或两者之间的任何距离。在一些实施例中，“表位”可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成在多肽上。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特的空间构象中，表位通常包含至少3个并且更常见地至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。“表位”包含通常由免疫球蛋白vh/v
l
对结合的结构单元。表位定义了抗体的最小结合位点，并因此代表了抗体的特异性靶标。在单结构域抗体的情况下，表位代表分离地由可变结构域结合的结构单元。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中也可以互换使用。在某些实施例中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可以具有特定三维结构特性和/或特定电荷特性。
153.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，至少一种抗原或其片段是脂蛋白。如本文所用，“脂蛋白”是指与脂质组合和/或转运脂质的任何可溶性蛋白质组。在细菌脂蛋白的上下文中，脂蛋白可以是细菌细胞壁的组分或表面抗原。
154.在所述方面中的任何方面的一些实施例中，至少一种抗原或其片段是假定蛋白。如本文所用，术语“假定蛋白”是指如通过核酸测序和生物信息学分析所确定的已预测由核酸编码但缺乏其翻译或功能活性的实验证据的蛋白质或多肽。关于淋病奈瑟菌，已经预测了许多具有可变水平的淋球菌假定蛋白的mrna转录。例如，可以在万维网pubmlst.org/neisseria上找到淋病奈瑟菌序列的完整列表。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，假定蛋白是截至本技术的提交日期没有预测多肽的翻译或功能的实验证据的蛋白质。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，假定蛋白是截至本技术的提交日期没有预测多肽的翻译或功能的实验证据的淋病奈瑟菌蛋白。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，假定蛋白是截至2019年4月1日没有预测多肽的翻译或功能的实验证据的淋病奈瑟菌蛋白。
155.本文所描述的假定蛋白可以表现出以下性质中的任何一种或多种性质：(i)每百万中转录物每千碱基的读段(rpkm)水平大于25；(ii)免疫原性概率为至少0.4；(iii)经编码的多肽的细胞定位处于细胞膜、周质或细胞外膜内；(iv)经编码的多肽不具有在人与其它细菌种类的细菌氨基酸序列之间保守的氨基酸序列；以及(v)所述经编码的多肽具有在多个细菌菌株中保守的氨基酸序列；以及(vi)假定蛋白具有少于4个跨膜结构域。
156.此类淋病奈瑟菌假定蛋白的实例在下文和可在万维网《pubmlst.org/neisseria》上获得的pubmlst和可在万维网《ncbi.nlm.nih.gov/geo》上获得的基因表达综合文件中提供。
157.用于淋病奈瑟菌的示例性假定蛋白和抗原以及对应的氨基酸和核苷酸序列识别号(seq id no)显示在下表中。
158.表1：淋病奈瑟菌抗原
[0159][0160]
不受限制地，本文所描述的疫苗组合物可以包括来自上表1(seq id no:1-36)的多肽抗原或其片段中的任一种。因此，本文所描述的疫苗组合物可以通过使用本领域已知的任何方法合成或翻译来自上表1(seq id no:37-72)的抗原或其片段中的任一种来制备。可替代地或另外地，本文所描述的疫苗组合物可以包括对来自上表1(例如，seq id no:37-72中的任一种的核酸)的多肽抗原或其片段之一进行编码的核酸。因此，本文所描述的疫苗组合物可以通过使用本领域已知的任何方法合成或转录对来自上表1(seq id no:37-72)的抗原或其片段中的任一种进行编码的核酸来制备。疫苗组合物可以包括如本文所描述的抗原或其片段或对抗原或其片段进行编码的核酸的任何组合。
[0161]
下表提供了可以使用的所有可能的抗原组合。预期的示例性抗原组合由“x”表示。
[0162]
[0163]
[0164]
[0165][0166]
在所述方面中的任何方面的一个实施例中，本文所描述的疫苗组合物包括选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802、ngo1947和其片段。在所述方面中的任何方面的一个实施例中，本文所描述的疫苗组合物包括选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947。
[0167]
在所述方面中的任何方面的另一个实施例中，本文所描述的疫苗组合物包括选自由以下组成的组的两种或更多种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802、ngo1947和其片段。在所述方面中的任何方面的另一个实施例中，本文所描述的疫苗组合物包括选自由以下组成的组的两种或更多种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947。
[0168]
在所述方面中的任何方面的另一个实施例中，本文所描述的疫苗组合物包括选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802、ngo1947和其片段；以及至少一种另外的抗原。
[0169]
在所述方面中的任何方面的另一个实施例中，本文所描述的疫苗组合物包括选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、
ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947；以及至少一种另外的抗原。
[0170]
关于疫苗组合物，本文提及的另外的抗原可以是本领域已知的抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，所述至少一种另外的抗原选自由以下组成的组：孔蛋白、菌毛蛋白、tbpa、tbpb、los、metq、slic、mtre、bama、acp和对前述抗原中的任何抗原进行编码的核酸。本领域已知的抗原的非限制性实例可以在以下中找到：edwards等人,《传染性疾病的最新观点(curr opin infect dis.)》(2018)；baarda等人《免疫学前沿(front immunol.)》(2018)；以及vincent等人《疫苗(vaccine.)》(2018)，所述文献通过引用整体并入本文。
[0171]
另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括i)ngo0416多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及ii)选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0172]
另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括i)ngo0690多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及ii)选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0173]
另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括i)ngo0948多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及ii)选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0174]
另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括i)ngo1043多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及ii)选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0175]
另一方面，本文描述了一种疫苗组合物，其包括i)ngo1215多肽或其片段或对此类
no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71和seq id no:72。
[0182]
本文所描述的抗原或其片段可以在载体(例如，表达载体)中表达。如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何基因元件。载体可以包含但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转位子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒体等。
[0183]
如本文所用，术语“表达载体”是指指导来自其中包含的与载体上的转录调控序列连接的核酸序列的rna或多肽(例如，如本文所描述的抗原或其片段)的表达的载体。表达的序列通常但并非必须与细胞异源。表达载体可以包括另外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如在人类细胞中进行表达并在原核宿主中进行克隆和扩增。
[0184]
术语“表达”是指参与产生rna和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时，其包含但不限于例如转录、转录物加工、转译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包含从基因转录的rna和通过翻译从基因转录的mrna所获得的多肽。术语“基因”是指当与合适的调控序列可操作地连接时在体外或体内转录(dna)为rna的核酸序列。基因可以包含或可以不包含在编码区域之前和之后的区域，例如5
′
未翻译的(5
′
utr)或“前导”序列和3
′
utr或“尾”序列、以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0185]
抗原(或其片段或对前述内容进行编码的核酸)可以在细胞、重组细胞或无细胞系统中产生。用于疫苗组分生产的示例性系统包含，例如，xpress cf
tm
平台(加利福尼亚州福斯特城sutrovax公司(sutrovax；foster city,ca))。
[0186]
如本文所描述，对抗原多肽进行编码的核酸可以用于疫苗组合物中。核酸疫苗的使用和其生产在本领域中是已知的，并且可以包含例如脂质体、经修饰的核苷和靶向部分的缀合。对于进一步的套路，参见例如servick,kelly(2017年2月1日)。“这家神秘的20亿美元生物技术正在揭示其新药和疫苗背后的秘密”《科学(science)》；所述文献通过引用整体并入本文。
[0187]
本文描述了一种综合的、高通量的计算机筛选方法(候选抗原选择策略或cass)，用于基于预测的免疫原性、膜缔合/表面暴露、保护以及有利于未来扩大规模和制造的结构特征来鉴定疫苗靶标。
[0188]
一方面，本文描述了包括通过本文所描述的方法产生的抗原或其片段的疫苗组合物。
[0189]
另一方面，本文描述了一种选择用于制备疫苗组合物的抗原的方法，其中所述方法包括：
[0190]
a.对来自感染有细菌的受试者的样品的rna进行测序或检测，其中所述样品包括由所述细菌表达的rna；
[0191]
b.将在步骤(a)中获得的rna信息与从在培养物中生长的相同物种(或任选地，相同菌株)的细菌中获得的rna序列信息进行比较以建立参考水平，并且鉴定当与参考水平相比时在感染期间表达水平受到调节的一组候选转录物；
[0192]
c.检测、测量或确定在步骤(b)中鉴定的一组候选转录物(或其开放阅读框)的一
个或多个以下性质：
[0193]
i.每百万中转录物每千碱基的读段(rpkm)水平大于25；
[0194]
ii.免疫原性概率评分为至少0.4；
[0195]
iii.经编码的多肽的细胞定位处于细胞膜、周质或细胞外膜内；
[0196]
iv.所述经编码的多肽不具有在人与其它细菌物种之间保守的氨基酸序列；
[0197]
v.所述经编码的多肽具有在多个细菌菌株中保守的氨基酸序列；并且
[0198]
vi.所述经编码的多肽是假定蛋白，
[0199]
其中选择包括所述性质中的一个或多个性质的经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。
[0200]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，选择包括步骤c中的所述性质中的两个或更多个性质的所述经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，选择包括步骤c中的所述性质中的三个或更多个性质的所述经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，选择包括步骤c中的所述性质中的四个或更多个性质的所述经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，选择包括步骤c中的所述性质中的五个或更多个性质的所述经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，选择包括步骤c中的所述性质中的每个性质的所述经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。
[0201]
可以通过本领域已知的方法对来自感染有微生物(例如细菌)的受试者的样品中的核酸(例如rna)进行测序或检测。参见例如，mcclure r等人《公共科学图书馆
·
综合(plosone.)》(2015)；以及美国专利第6,271,002b1号；第6,518,019b2号；第8,206,913b1号；第6,524,829b1号；和第2016/0122753a1号，所述文献通过引用整体并入本文。
[0202]
将在步骤(a)中获得的核酸(例如，rna)序列信息与从微生物(例如，培养物中生长的细菌)中获得的序列信息进行比较，并且鉴定在感染期间表达水平与参考水平相比被调节的一组候选转录物可以通过rna测序或本领域已知的检测核酸或多肽的表达水平的任何方法(例如，dna和rna测序、下一代测序、rt-pcr、微阵列、蛋白质组学、荧光测定、转录组学、基因芯片测定、全基因组测序、甲基化特异性寡核苷酸阵列和微流控测定)进行。
[0203]
每百万中转录物每千碱基的读段数(rpkm)是转录表达的单位。仅来自测序测定的原始读段计数可能会受到如转录长度、读段总数和测序偏差等因素的影响。测量rpkm(每百万读段中外显子模型每千碱基的读段数)是一种去除了特征长度和文库大小的影响的样品内标准化方法。rpkm的计算方法是首先确定一组序列数据中的百万总读段数，将读段计数除以总百万读段数以产生每百万读段，然后除以以kb为单位的基因长度。此度量以及其后续派生fpkm(每百万映射读段中外显子模型每千碱基的片段数)、一种类似于rpk的样品内标准化转录物表达度量，以及tpm(每百万中的转录物数)是最常报告的rna-seq基因表达值。
[0204]
一种用于鉴定和选择抗原或其片段作为疫苗组合物的候选抗原的方法是通过选择rpkm水平大于25、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50的转录物进行的。
[0205]
步骤c的性质，特别是元素ii.和iii.可以预测(例如，基于序列信息)或实验确定。几种生物信息学分析和预测工具可以用于分析和优先考虑具有步骤c中的性质的候选抗
原。本领域技术人员会知道基于特定候选抗原期望的性质而使用哪种预测工具。
[0206]
例如，vaxijen可以用于预测抗原性、免疫原性概率和保护潜力(截止值为0.4)；psortbv3.0、predictprotein和gneg-mploc用于蛋白质亚细胞定位(52-54)；vaxgen可在万维网《www.violinet.org/vaxgen/index.php》和blastp(blast 2.2.26 )上找到，用于蛋白质序列分析。还可以评估与人/小鼠/大肠杆菌蛋白、淋病奈瑟菌和乳糖发酵奈瑟菌蛋白的氨基酸序列相似性。
[0207]
如本文所用，术语“免疫原性概率”是指给定抗原或其片段具有多个表位(例如，t细胞和b细胞表位)和/或可引发免疫应答的概率。参见例如，jain r等人,《理论生物学杂志(jtheor biol.)》2016；410:36-43，所述文献通过引用整体并入本文。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，免疫原性概率是如由vaxijen计算的免疫原性概率。在一些实施例中，免疫原性概率为至少0.4。
[0208]
可以使用hmtmm检查蛋白质结构特征以预测跨膜结构域的存在和数量，使用phobius预测拓扑结构，并且使用signalp v5.0和secretomep预测信号肽、切割位点和翻译后修饰的存在/类型。可以使用blast、uniprotkb、pfam和pubmed记录进一步评估蛋白质功能分析。
[0209]
可以使用在万维网《pubmlst.org》上找到的pubmlst检查病原性细菌(例如，淋病奈瑟菌(4198个菌株)和乳糖发酵奈瑟菌(288个菌株))的基因存在、等位基因分布和序列保守性。蛋白质序列保守性可以从ncbi中的blastp推导出来。
[0210]
通常，当所选多肽或对多肽进行编码的核酸(例如，抗原)的序列与另一个多肽或对多肽进行编码的核酸的序列具有至少50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高或100％或更高的同源性时，氨基酸或核酸序列被认为是保守的。
[0211]
在所述方面中的任何方面的各个实施例中，经考虑涵盖所描述的任何特定抗原多肽的(天然存在或以其它方式存在的)变体、等位基因、同源物、经保守修饰的变体和/或经保守取代的变体。关于氨基酸序列(例如，seq id no:1-36)，本领域的普通技术人员将认识到，改变经编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独取代、缺失或添加是“经保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代并且保留了多肽的期望活性。此类经过保守修饰的变体是与本公开一致的对多态变体、种间同系物和等位基因的补充，并且不排除其。
[0212]
给定的氨基酸可以被具有相似的理化特征的残基代替，例如，用一个脂肪族残基替换另一个(如ile、val、leu或ala)，或用一个极性残基替换另一个(如lys与arg之间；glu与asp之间；或gln与asn之间)。其它此类保守取代，例如对具有类似疏水性特征的整个区域的取代，是众所周知的。可以在本文所描述的任何一种测定法中测试包括保守性氨基酸取代的多肽，以证实保留了期望的活性，例如，天然多肽或参考多肽的配体介导的受体活性和特异性。
[0213]
氨基酸可以根据其侧链的性质的相似性进行分组(a.l.lehninger,《生物化学(biochemistry)》,第二版,第73-75页,《宏观经济学(worth publishers)》,纽约(1975))：(1)非-极性：丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、苯丙氨酸(p)、脯氨酸(f)、色氨酸(w)、蛋氨酸(m)；(2)不带电荷的极性：甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、半胱氨酸(c)、酪氨酸(y)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；(3)酸性的：天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；(4)基本
的：赖氨酸(k)、精氨酸(r)、组氨酸(h)。可替代地，可以基于共同的侧链性质将天然存在的残基分为几类：(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水的：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性的：天冬氨酸、谷氨酸；(4)基本的：组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守取代将需要将这些类别中的一个类别的成员交换为另一个类别。特定的保守取代包含，例如；丙氨酸变为甘氨酸或变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为丙氨酸或变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或变为谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或变为缬氨酸；亮氨酸变为异亮氨酸或变为缬氨酸；赖氨酸变为精氨酸、变为谷氨酰胺或变为谷氨酸；蛋氨酸变为亮氨酸、变为酪氨酸或变为异亮氨酸；苯丙氨酸变为蛋氨酸、变为亮氨酸或变为酪氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸；和/或苯丙氨酸变为缬氨酸、变为异亮氨酸或变为亮氨酸。
[0214]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，如本文所描述的抗原多肽或其片段可以是如本文所描述的多肽或抗原的变体。在一些实施例中，变体是经过保守修饰的变体。可以通过例如天然核苷酸序列的突变获得保守取代变体。如本文所指，“变体”是与天然多肽或参考多肽基本上同源的多肽，但是由于一个或多个缺失、插入或取代，其具有与天多肽然或参考多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。对dna序列进行编码的变体多肽涵盖这样的序列：当与天然或参考的dna序列相比时，所述序列包括一种或多种核苷酸的添加、缺失或取代，但是对保留非变体多肽的活性的变体蛋白或其片段进行编码。多种基于pcr的位点特异性诱变方法在本领域中是已知的，并且可以被普通技术人员应用。
[0215]
变体氨基酸或dna序列可以与天然序列或参考序列(例如seq id no:1-72)具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性。可以例如通过使用万维网上通常用于此目的的免费计算机程序(例如具有默认设置的blastp或blastn)比较天然序列和突变序列来确定两个序列之间的同源性程度(同一性百分比)。
[0216]
可以通过本领域已知的许多技术中的任何技术来完成对天然氨基酸序列的改变。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸而在特定的基因座处引入突变，所述寡核苷酸的侧翼是允许与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得到的重建序列对具有期望的氨基酸插入、取代或缺失的类似物进行编码。可替代地，可以采用寡核苷酸定向的位点特异性诱变方法，以提供具有根据取代、缺失或插入而改变的特定密码子的经过改变的核苷酸序列。进行这种改变的技术已经完善，并且包含例如以下文献中所公开的技术：walder等人(《基因(gene)》42:133,1986)；bauer等人(《基因》37:73,1985)；craik(《生物技术(biotechniques)》,一月1985,12-19》)；smith等人(《基因工程：原理和方法(genetic engineering:principles and methods)》,普莱纽姆出版社(plenum press),1981)；以及美国专利第4,518,584和4,737,462号，所述文献通过引用整体并入本文。不参与维持多肽的适当构象的任何半胱氨酸残基通常也可以被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加到多肽中以改善其稳定性或促进寡聚。
[0217]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的方法进一步包括从受试
者中分离生物样品。生物样品可以通过本领域已知的方法如拭子、抽血或手术方法获得或分离。
[0218]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，所述生物样品是表皮组织、粘膜组织、粘液、体液、血液、血沉棕黄层、唾液或下生殖道液。
[0219]
如本文所描述的，可以从任何受试者中去除生物样品。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，受试者是哺乳动物。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，受试者是人。
[0220]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的方法进一步包括将抗原或其片段克隆到表达载体中。
[0221]
克隆方法是本领域众所周知的。仅通过实例的方式，可以将对本文所描述的候选抗原或其片段进行编码的核酸克隆到质粒(例如，pet17b)中。质粒可以具有抗生素抗性盒(例如，氨苄青霉素(ampicillin)或卡那霉素(kanamycin))。然后将质粒转化到细菌(例如，大肠杆菌bl21(de3))中进行重组表达。然后可以将经转化的细菌培养物接种在含有适当抗生素的培养基中，然后进行诱导(例如，通过异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg))以评估抗原或抗原片段的表达。
[0222]
也可以使用制备、表达、递送或制备抗原或其片段的其它方法。例如，可以使用mrna疫苗组合物。参见美国专利第9,192,651 b2号和第10,022,435b2号，所述美国专利已经通过引用整体并入本文。还参见，us 2018/0333484 a1和2019/0192645 a1中的多肽-抗原缀合物，所述文献已经通过引用整体并入本文。
[0223]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，所述方法进一步包括表达和分离所述候选抗原或其片段。
[0224]
仅通过实例的方式，在诱导之后，可以通过离心收集细菌，并且然后可以通过本领域已知的方法(例如，柱纯化)纯化蛋白质。斑点印迹可以用于使用抗体和检测试剂验证抗原阳性部分。然后可以通过本领域已知的方法定量蛋白质浓度。
[0225]
可以通过用纯化的重组蛋白使动物模型或受试者免疫并测量对抗原的免疫应答来测试和验证所得抗原或其片段。测量免疫应答的方法是本领域已知的。免疫应答可以通过评估来自暴露于抗原或其片段的受试者的生物样品中的免疫分子或细胞的水平来实验确定。检测免疫应答的方法包含但不限于抗体elisa(例如，igg抗体)、细胞因子elisa(例如，测量如il-4、il-12、il-6、ifn-γ或tnf-α等细胞因子)、流式细胞术或杀菌测定(sba)。
[0226]
本文所描述的疫苗组合物和方法引发免疫应答，例如保护免于一种或多种微生物感染的免疫应答。
[0227]
术语“微生物”或“病原性微生物”或“传染性微生物”在本文中可互换使用以指代可以感染受试者并导致传染性疾病或病症的任何生物体，特别是微观生物体。传染性生物体或病原体的实例包含但不限于病毒、细菌、原生动物、支原体和真菌。传染性疾病可以影响任何身体系统，可以是急性(短效)或慢性/持续性(长效)，伴有或不伴有发烧，影响任何年龄组，并与其它传染性生物体重叠。
[0228]
如本文所用，术语“病原体”是指在受试者中引起疾病或病症的生物体。例如，病原体包含但不限于病毒、真菌、细菌、寄生虫和其它传染性生物体或来自其的分子，以及在藻类、真菌、酵母、原生动物等类别中的分类学相关的宏观生物体。在一些实施例中，病原体是
人病原体。
[0229]
如本文所用，“细菌感染”是指由细菌引起的任何感染。如本文所描述的细菌感染可以由目前已知或尚未发现的导致病原性疾病的任何细菌类型引起。病原性细菌和疾病在本领域中是众所周知的。
[0230]
哺乳动物根据本领域已知的任何标准方法被诊断为具有感染，并且描述于例如美国专利第6,368,832号、第6,579,854号和第6,808,710号以及美国专利申请公开第20040137577号、第20030232323号、第20030166531号、第20030064380号、第20030044768号、第20030039653号、第20020164600号、第20020160000号、第20020110836号、第20020107363号和第20020106730号中，所有这些申请均通过引用整体并入本文。
[0231]
另一方面，本文描述了一种在受试者中引发对微生物(例如，病原性细菌)的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所描述的疫苗组合物。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，疫苗组合物引发针对病原性细菌具有保护性的免疫应答。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，所述疫苗组合物引发针对多种细菌菌株具有保护性的免疫应答。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，所述疫苗组合物引发针对多种淋病奈瑟菌菌株具有保护性的免疫应答。示例性淋病奈瑟菌菌株包含但不限于f62、fa1090、u08401和u08402。
[0232]
免疫应答可以表征为对任何免疫细胞的任何刺激，如抗体、细胞因子的释放、免疫细胞的增殖、吞噬作用或本领域已知的免疫细胞的任何已知功能。引发如本文所描述的免疫应答可以包含抗体的存在或b细胞产生的抗体增加，其中在施用本文所描述的抗原、其片段或疫苗组合物后，抗体可以与表达或感染病原体的抗原结合，并且由此靶向微生物进行杀灭或灭活。
[0233]
如本领域技术人员所知，术语“抗体”泛指包含四条多肽链、两条重(h)链和两条轻(l)链的任何免疫球蛋白(ig)分子和免疫球蛋白分子(即，含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)的免疫活性部分，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留了ig分子的基本表位结合特征。抗体或免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类，如本领域技术人员所理解。
[0234]
与参考水平相比，受试者中抗体产生的存在或增加可以通过本领域已知的任何方法测量，包含酶联免疫吸附测定(elisa)。另外，与参考水平相比，免疫细胞产生的细胞因子的存在或增加可以通过本领域已知的任何方法测量，包含elispot测定。
[0235]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的疫苗组合物和方法用于抵抗细菌感染，即当抗原或其片段包括源自细菌的分子时。
[0236]
细菌是通过二元裂变无性繁殖的单细胞生物。基于细菌的形态、染色反应、营养和代谢要求、抗原结构、化学组成和基因同源性对其进行分类和命名。细菌可以基于其形态形式分为三组：球形(球菌)、直杆(芽孢杆菌)和弯曲或螺旋杆(弧菌、弯曲杆菌、螺旋菌和螺旋体)。细菌也更常见地基于其对两类生物体(革兰氏阳性和革兰氏阴性)的染色反应来表征。革兰氏是指微生物实验室常用的染色方法。革兰氏阳性菌在染色程序后保留染色剂并呈现深紫色。革兰氏阴性菌不会保留染色剂，而是吸收复染剂，并且因此呈粉红色。
[0237]
细菌的非限制性实例包含：淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、梅毒螺旋体、解脲脲原体、
阴道毛滴虫、汉氏巴尔通体、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌、伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、分枝杆菌(如生殖支原体、人型支原体、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分支杆菌、戈氏分支杆菌)、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增生李斯特菌、化脓性链球菌(a族链球菌)、无乳链球菌(b族链球菌)、链球菌(草绿色族)、粪链球菌、表皮链球菌、链球菌(厌氧菌)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、布鲁氏杆菌、多杀巴斯德菌、拟杆菌、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、雅司螺旋体、钩端螺旋体、巴西诺卡氏菌、赫姆斯疏螺旋体、伯氏疏螺旋体和衣氏放线菌。
[0238]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，细菌可以感染宿主受试者的粘膜。
[0239]
如本文所用，“粘膜细菌”是指可以定殖或感染宿主受试者的粘膜的任何细菌。粘膜细菌可以是共生菌(例如，非致病菌)或病原性细菌(例如，致病菌)。示例性粘膜细菌包含淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、梅毒螺旋体、解脲脲原体、阴道毛滴虫、汉氏巴尔通体、大肠杆菌、分枝杆菌(如生殖支原体、人型支原体、结核分枝杆菌)。
[0240]
本文所描述的方法和疫苗组合物可以用于预防和治疗宿主受试者的粘膜感染。由微生物(例如，细菌)引起的粘膜感染可以包含性传播感染(sti)(例如，淋病)。示例性sti包含衣原体、淋病、hiv感染、滴虫病、生殖器疱疹或梅毒。如果不加以治疗，sti会导致产生或获得其它感染(例如，hiv)的风险增加，导致长期盆腔和腹部不适，或无法怀孕或导致妊娠并发症。
[0241]
被诊断或有患sti风险的个体可能有症状或无症状。如果受试者暴露于另一个患有sti的个体，所述受试者就有患sti的风险。sti可以通过如性传播、与受感染的个体接触、暴露于受污染的针头、暴露于受污染的生物液体等若干种方式从一个个体传播到另一个个体。与sti相关的症状(例如淋病)包含疼痛、排尿时疼痛、黏膜分泌物增多、出血、头痛、皮肤异常、发热、淋巴结肿大、脱发、肌肉酸痛、溃疡等。sti的诊断可以由医生或从业者使用实验室测试，如尿检或受影响区域的拭子进行。
[0242]
感染的受影响区域可以定位于受试者的粘膜内。如本文所用，术语“粘膜”是指衬在身体的各个腔内并覆盖内部器官表面的生物膜层。器官的粘膜可以包括一个或多个分泌粘液的上皮细胞层和疏松结缔组织的底层固有层。具有粘膜的器官的非限制性实例包含生殖器、嘴、嘴唇、耳朵、眼睑、鼻子、皮肤、支气管、舌头、胃肠道和/或直肠。
[0243]
除了细菌微生物之外，经考虑选择用于制备本文所描述的疫苗组合物的抗原的方法可以用于鉴定来自其它微生物如寄生虫、病毒或真菌的候选抗原。
[0244]
寄生虫是依赖其它生物体才能生存的生物体，并且因此必须进入或感染另一种生物体以继续其生命周期。受感染的生物体，即宿主，为寄生虫提供营养和栖息地两者。尽管从最广泛的意义上讲，术语寄生虫可以包含所有传染原(即，细菌、病毒、真菌、原生动物和蠕虫)，但一般而言，所述术语仅用于指原生动物、蠕虫和体外寄生虫节肢动物(例如，蜱、螨虫等)。原生动物是既可以在细胞内又可以细胞外，特别是在血液、肠道或组织的细胞外基质中复制的单细胞生物体。蠕虫是多细胞生物体，几乎总是在细胞外的(旋毛虫例外)。蠕虫通常需要从主要宿主退出并传输到次级宿主才能进行复制。与上述这些类别相比之下，外寄生节肢动物与宿主体的外表面形成寄生关系。
[0245]
寄生虫包含细胞内寄生虫和专性细胞内寄生虫。寄生虫的实例包含但不限于恶性
疟原虫(plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(plasmodium ovale)、疟疾疟原虫(plasmodium malariae)、间日疟原虫(plasmdodium vivax)、诺氏疟原虫(plasmodium knowlesi)、小巴贝虫(babesia microti)、发散巴贝虫(babesia divergens)、克氏锥虫(trypanosoma cruzi)、刚地弓形虫(toxoplasma gondii)、旋毛虫(trichinella spiralis)、大利什曼原虫(leishmania major)、多诺瓦尼利什曼原虫(leishmania donovani)、巴西利什曼原虫(leishmania braziliensis)、热带利什曼原虫(leishmania tropica)、冈比亚锥虫(trypanosoma gambiense)、罗得西亚锥虫(trypanosoma rhodesiense)和曼氏血吸虫(schistosoma mansoni)。
[0246]
病毒是小型感染因子，通常含有核酸核心和蛋白质外壳，但不是独立的活生物体。病毒也可以采取缺乏蛋白质的传染性核酸的形式。在没有活的宿主细胞的情况下，病毒就无法复制。病毒通过内吞作用或直接注射dna进入特定的活细胞并繁殖，从而引起疾病。然后可以释放繁殖的病毒并感染其它细胞。一些病毒是含dna的病毒，并且其它病毒是含rna的病毒。
[0247]
在人中发现的病毒的具体实例包含但不限于：逆转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒，如hiv-1(也被称为htlv-iii、lav或htlv-iii/lav或hiv-iii；和其它分离物，如hiv-lp)；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如，引起肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；肝炎病毒(丙型肝炎病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、静脉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒、轮状病毒和轮状病毒)；双rna病毒科(birnaviridae)；嗜肝dna病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；巴波多病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(hsv)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv))；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；以及未经分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体、三角洲肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)、非甲非乙型肝炎的病原体(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播)；诺瓦克(norwalk)和相关病毒，以及星状病毒。
[0248]
真菌是真核生物体，其中只有少数会导致脊椎哺乳动物感染。由于真菌是真核生物，它们在大小、结构组织、生命周期和繁殖机制上与原核细菌有显著不同。真菌通常基于形态特征、繁殖方式和培养特性进行分类。虽然真菌可以在受试者中引起不同类型的疾病，如吸入真菌抗原后的呼吸道感染或过敏，由于摄入有毒物质引起的真菌中毒，如毒鹅膏菌毒素和有毒蘑菇产生的鬼笔毒素和曲霉菌产生的黄曲霉毒素，并不是所有的真菌都会引起传染性疾病。
[0249]
传染性真菌可以引起全身或浅表感染。原发性全身感染可以发生在正常健康受试者中，并且机会性感染最常见于免疫功能低下的受试者。引起原发性全身感染的最常见真菌剂包含芽生菌、球孢子菌和组织胞浆菌。在免疫功能低下或免疫抑制的受试者中引起机会性感染的常见真菌包含但不限于白色念珠菌、新型隐球菌和各种曲霉。全身性真菌感染
是内脏器官的侵袭性感染。微生物通常通过肺、胃肠道或静脉导管进入人体。这些类型的感染可以由原发性病原性真菌或机会性真菌引起。
[0250]
浅表真菌感染涉及真菌在外表面上的生长而不侵入内部组织。典型的浅表真菌感染包含涉及皮肤、头发或指甲的皮肤真菌感染。
[0251]
与真菌感染相关的疾病包含曲霉病、芽生菌病、念珠菌病、色素芽生菌病、球孢子菌病、隐球菌病、真菌性眼部感染、真菌毛发、指甲和皮肤感染、组织胞浆菌病、分枝菌病、足菌肿、耳霉菌病、副球孢子菌病、播散性马尔尼菲青霉菌、嗜丝菌病、鼻孢子虫病以及接合菌病。
[0252]
其它医学相关微生物已在文献中广泛描述，例如参见c.g.a thomas,《医学微生物学(medical microbiology)》,拜里尔
·
廷德尔,英国1983，所述文献的全部内容通过引用特此并入。上述列表中的每一个都是说明性的，并且不旨在是限制性的。
[0253]
已经开发了若干种用于治疗感染(例如，细菌或病毒感染)的药物。感染的治疗可以包含(1)包括灭活细菌细胞的疫苗，(ii)含有经基因操作的病毒的活减毒疫苗，(iii)融合蛋白或多肽内的病原体脂多糖缀合物，(iv)感染后施用的抗生素和抗病毒药物。
[0254]
具体地，sti的治疗可以在以下中找到：workowski ka等人《性传播疾病治疗指南(sexually transmitted diseases treatment guidelines)》,2015,《发病率和死亡率周报建议和报告(mmwr recomm rep.)》2015；64(rr-03):1-137。
[0255]
术语“治疗剂”是本领域公认的并且是指作为在受试者中局部或全身起作用的生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。在熟知的参考文献中描述了治疗剂(也被称为“药物”)的实例，如《默克索引(merck index)》、《医师案头参考(physician's desk reference)》和《治疗学的药理学基础(the pharmacological basis of therapeutics)》，并且所述治疗剂的实例包含但不限于：药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或疾患的物质；影响身体的结构或功能的物质；或者在置于生理环境中后变得具有生物活性或更具活性的前药。可以使用各种形式的治疗剂，它们在施用于受试者时能够从受试者组合物中释放到邻近组织或体液中。
[0256]
用于感染的示例性治疗剂和疫苗包含但不限于青霉素、头孢曲松、阿奇霉素、阿莫西林、强力霉素、头孢氨苄、环丙沙星、克林霉素、甲硝唑、阿奇霉素、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、脑膜炎球菌多糖疫苗、破伤风类毒素、霍乱疫苗、伤寒疫苗、肺炎球菌7价疫苗、肺炎球菌13价疫苗、肺炎球菌23价疫苗、嗜血杆菌b缀合物、炭疽疫苗、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、西多福韦、康比韦、多替拉韦、地拉韦定、去羟肌苷、恩曲他滨、恩替卡韦、法米洛韦、福沙那韦、伊莫诺韦、茚地那韦、肌苷、洛匹那韦、洛伐利、马拉维罗、奈韦拉平、核苷类似物、奥司他韦、喷昔洛韦、金刚乙胺、嘧啶、沙奎那韦、司他夫定、替诺福韦、三协唯、曲曼他定、特鲁瓦达、伐昔洛韦、西拉脒、扎那米韦、齐多夫定、mmr疫苗、dtap疫苗、肝炎疫苗、hib疫苗、hpv疫苗、流感疫苗、脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、带状疱疹疫苗、tdap疫苗、破伤风疫苗、氟康唑、酮康唑、两性霉素b和磺胺多辛/乙胺嘧啶。
[0257]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述抗原或其片段与药学上可接受的载体和任选地佐剂或外膜囊泡一起调配。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的组合物包括抗原(或其片段或对抗原或片段进行编码的核酸)、药学上可接受的载体、佐剂和外膜囊泡中的至少一种。
[0258]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的组合物包括抗原(或其片段或对抗原或片段进行编码的核酸)并且不包括佐剂。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的组合物包括抗原(或其片段或对抗原或片段进行编码的核酸)并且不包括明矾。
[0259]
一方面，本文描述了一种使受试者免疫的方法，所述方法包括施用通过本文所描述的方法制备的疫苗组合物。另一方面，本文描述了疫苗组合物，其包括如本文所描述的抗原或其片段中的任何抗原或其片段，或对如本文所描述的此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0260]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，疫苗或疫苗组合物包括至少一种抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，疫苗或疫苗组合物包括多种抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，施用多种抗原。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，施用多种疫苗或疫苗组合物。多种疫苗或疫苗组合物可以是例如相同或不同的，例如包括不同抗原或抗原组合的两种不同疫苗，或包括相同抗原或抗原组合的两种疫苗组合物(例如，在加强疫苗或重复免疫方案中)。
[0261]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，疫苗是或可以包括减毒疫苗。减毒疫苗包括微生物的弱化或受损版本或变体。减毒疫苗可以包含微生物的突变或工程化菌株和/或已经在培养中传代的菌株，从而导致致病性丧失。
[0262]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，疫苗组合物可以是或可以包括亚单位疫苗，包含重组亚单位疫苗。亚单位疫苗不包括整个致病微生物，而仅包括从致病微生物中获得或衍生的抗原子集。亚单位疫苗可以包括多种不同的抗原。通过重组技术产生抗原的亚单位疫苗被称为重组亚单位疫苗。
[0263]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，至少一种抗原包括在缀合物疫苗中。在缀合物疫苗中，来自病原性微生物的多糖(例如，在微生物的表面发现的多糖)与受试者的免疫系统已经识别或受试者的免疫系统将容易作出应答的抗原组合(例如，缀合)施用。这增加了患者对多糖和抗原的应答，并且提供了针对活的病原性微生物版本的增强保护。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的疫苗组合物进一步包括多糖。
[0264]
如本文所描述的疫苗组合物可以用于例如保护或治疗受试者免于疾病。术语“免疫”和“接种”在所述领域往往可以互换使用。然而，关于施用本文所描述的疫苗组合物以提供针对疾病的保护，例如由表达抗原的病原体引起的传染病，应当理解的是术语“免疫”是指由施用的疫苗组合物赋予的被动保护。
[0265]
对于本文所描述的方法的临床使用，本文所描述的抗原或其抗原片段的施用可以包含调配成用于肠胃外施用，例如静脉内；粘膜，例如鼻内；眼部或其它施用模式施用的药物组合物或药物调配物。在一些实施例中，本文所描述的抗原或抗原片段可以与产生对受试者的有效治疗的任何药学上可接受的载体化合物、材料或组合物一起施用。因此，用于本文所描述的方法的药物调配物可以含有本文所描述的抗原或抗原片段以及一种或多种药学上可接受的成分。
[0266]
短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文所用，短语“药学上可接受的载体”意
指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂包封材料(涉及维持抗原或其片段的稳定性、溶解度或活性)。在与调配物的其它成分相容并且对患者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。术语“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。
[0267]
本文所描述的抗原或其片段可以特别调配以将化合物以固体、液体或凝胶形式施用于受试者，包含适用于以下的那些：(1)肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放的调配物通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(2)经皮；或(3)经粘膜。另外地，可以将抗原或其抗原片段植入到患者中或使用药物递送系统注射。参见例如，urquhart等人,《药理学和毒理学年评(ann.rev.pharmacol.toxicol.)》24:199-236(1984)；lewis编辑,“农药和药物的控制释放(controlled release of pesticides and pharmaceuticals)”(纽约普莱南出版社,1981)；美国专利第3,773,919号；以及美国专利第35 3,270,960号，所述文献通过引用整体并入本文。
[0268]
本文所描述的抗原或其片段的治疗制剂可以通过将具有期望纯度的抗原或抗原片段与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存(《雷明顿药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》第16版,osol,a.编辑(1980))，以冻干调配物或水溶液的形式。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包含缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苄烷铵、苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。示例性冻干抗原或抗原片段调配物描述于通过引用明确并入本文的wo97/04801中。
[0269]
任选地，但优选地，包括本文所描述的疫苗组合物的调配物含有药学上可接受的盐，通常例如氯化钠，并且优选地为约生理浓度。任选地，本文所描述的疫苗组合物的调配物可以含有药学上可接受的防腐剂。在一些实施例中，防腐剂浓度在0.1到2.0％的范围内，通常为v/v。合适的防腐剂包含制药领域已知的那些。苯甲醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯是防腐剂的实例。任选地，本文所描述的疫苗组合物的调配物可以包含浓度为0.005到0.02％的药学上可接受的表面活性剂。
[0270]
如本文所描述的包括抗原或其片段的疫苗组合物的治疗调配物还可以含有一种以上的活性化合物，优选地具有彼此不会不利影响的互补活性的那些，这对于所治疗的特定适应症是必要的。可替代地，所述组合物可以包括例如细胞毒剂、细胞因子或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地组合在一起存在。
[0271]
还可以将本文所描述的包括抗原或其片段的疫苗组合物的活性成分包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳
米颗粒和纳米胶囊)中、或粗乳液中。此类技术公开于《雷明顿氏药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》第16版,osol,a.编辑，(1980)中。
[0272]
在一些实施例中，可以使用缓释制剂。缓释制剂的合适实例包含含有本文所描述的抗原或其片段的固体疏水性聚合物的半渗透基质，其中所述基质呈例如薄膜或微胶囊等成形制品的形式。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、l-谷氨酸和y-乙基-l-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如lupron depot
tm
(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。虽然如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当包封时，抗原或其片段可以长时间保留在体内，由于暴露在37℃的湿气中，会变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。根据所涉及的机制，可以设计合理的策略以实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物交换形成分子间s-s键，则可以通过改变巯基残基，从酸性溶液中冻干，控制水分含量，使用适当的添加剂以及开发具体聚合物基质组合物来实现稳定化。
[0273]
在本文所描述的方法中用于体内施用(例如肠胃外施用)的治疗制剂可以是无菌的，这很容易通过无菌过滤膜过滤或本领域技术人员已知的其它方法来完成。
[0274]
抗原或其片段或疫苗组合物可以以符合良好医学实践的方式调配、给药和施用。在此上下文中考虑的因素包含被治疗的特定病症、被治疗的特定受试者、个体受试者的临床病状、病症的起因、疫苗组合物的递送部位、施用方法、施用时间安排以及执业医师已知的其它因素。要施用的抗原或其片段或疫苗组合物的“治疗有效量”受此类考虑支配，并且是指改善、治疗或稳定感染所必需的最小量；增加直至进展的时间(无进展生存期)或治疗或预防感染或肿瘤的发生或复发。例如，在一些实施例中，抗原或其片段或疫苗组合物可以任选地与一种或多种目前用于预防或治疗感染的另外治疗剂一起调配。此类其它药剂的有效量取决于调配物中存在的抗原或抗原片段的量、病症或治疗的类型以及上文所讨论的其它因素。这些通常以与如本文之前使用的相同剂量和施用途径使用，或为迄今采用剂量的约1％都99％。
[0275]
疫苗组合物的剂量范围取决于效力，并且涵盖足以产生期望效果的量。剂量不应太大，以免引起不可接受的不良副作用。通常，剂量将随患者的年龄、病情和性别而变化，并且可以由本领域的技术人员确定。在发生任何并发症的情况下，可以由个别医生调整剂量。在一些实施例中，剂量的范围为0.001mg/kg体重到100mg/kg体重。在一些实施例中，剂量范围为5μg/kg体重到100μg/kg体重。可替代地，可以将剂量范围滴定以保持血清水平介于1μg/ml与1000μg/ml之间。对于全身性施用，可以向受试者施用治疗量，如例如，0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。这些剂量可以通过一次或多次单独施用，或通过连续输注施用。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病状，治疗持续到例如，如通过上文所描述的或本领域已知的方法测量的感染被治疗。然而，其它剂量方案可以是有用的。
[0276]
本文所描述的疫苗组合物可以施用于需要接种、免疫和/或刺激免疫应答的受试者。在所述方面中的任何方面的一些实施例中，本文所描述的方法包括例如向受试者施用有效量的本文所描述的疫苗组合物，以刺激免疫应答或提供针对抗原来源的相关病原体或
systemically)”、“外周施用(peripheral administratio)”和“外周地施用(administered peripherally)”是指施用治疗剂而不是直接施用到靶部位、组织或器官，如肿瘤部位，使得其进入受试者的循环系统，并且因此经受新陈代谢和其它类似过程。在其它实施例中，当感染的病症或定位允许时，局部施用抗体或其抗原结合片段，例如通过直接注射，并且可以周期性重复注射。
[0281]
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止与疾病或病症相关的病状的进展或严重程度。术语“治疗”包含减少或减轻与感染相关的病状、疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果减轻了一种或多种症状或临床标志，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果减轻或停止了疾病的进展，则治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包含改善症状或标志物，还包含停止或至少减慢在没有治疗的情况下预期的病情进展或恶化。有益的或期望的临床结果包含但不限于：改善一种或多种症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。疾病的术语“治疗”还包含缓解疾病的症状或副作用(包含姑息治疗)。
[0282]
如本文所用，“预防(preventing或prevention)”是指其中由于所述方法学的作用(例如，施用本文所描述的抗原或其片段或疫苗组合物)而不会出现疾病状态的任何方法学。一方面，应当理解，预防也可以意味着疾病没有建立到未治疗的对照中发生的程度。因此，疾病的预防涵盖相对于未经治疗的受试者(例如未用本文所描述的方法或组合物治疗的受试者)降低受试者可能患上疾病的可能性。
[0283]
使用本文所描述的方法的疗法的持续时间将持续至医学上指示的时间或直到实现期望的治疗效果(例如，本文所描述的那些)。在某些实施例中，本文所描述的疫苗组合物的施用持续1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、20年，或持续至多受试者的寿命的若干年时间段。
[0284]
如本领域技术人员将理解的，给定疫苗组合物的适当给药方案可以包括单次施用/免疫或多次。随后的剂量可以在一定时间段内重复给予，例如，在受试者的整个生命周期中，约两周或更长，例如，以提供持续的预防效果。在初次免疫之后，随后的剂量可以间隔例如约两周、约三周、约四周、约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月、约八个月、约九个月、约十个月、约十一个月或约一年。
[0285]
调配物中使用的精确剂量也取决于施用途径，并且应当根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。最终，从业者或医师将决定向特定受试者施用的抗原、抗原片段或疫苗组合物的量。
[0286]
在本文所描述的这些方法和所有此类方法的一些实施例中，抗原或其抗原片段以有效提供针对感染的短期保护的量施用。在一些实施例中，感染是细菌感染。在一些实施例中，细菌感染由淋病奈瑟菌引起。
[0287]
如本文所用，“短期保护”是指对感染如疟疾感染的保护，持续至少约2周、至少约1个月、至少约6周、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月，或至少约12个月。此类保护可能涉及重复给药。
[0288]“减轻持续感染的症状”是改善与持续感染相关的任何病状或症状。可替代地，减
轻持续感染的症状可以涉及相对于未经治疗的对照中的此类负荷减少受试者中的感染性微生物(例如，病毒、细菌、真菌或寄生虫)负荷。与等效的未经治疗的对照相比，此类降低或预防程度为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％，如通过任何标准技术测量的。期望地，如通过本领域已知的任何标准方法检测到的，持续感染被完全清除，在这种情况下，持续感染被认为已被治疗。正在接受持续感染治疗的患者是医生诊断为患有此类病状的患者。可以通过任何合适的方式进行诊断。诊断和监测可以涉及，例如，检测生物样品中的微生物负荷水平(例如，组织活检、血液检测或尿液检测)，检测生物样品中微生物感染的替代标志物的水平，检测与持续感染相关的症状，或检测涉及持续感染典型免疫应答的免疫细胞(例如，检测无反应性和/或功能受损的抗原特异性t细胞)。正在预防持续感染发展的患者可能已接受或未接受此类诊断。本领域技术人员将理解，这些患者可能已经接受了与上文所描述相同的标准测试，或者可能在没有检查的情况下被鉴定为由于存在一种或多种风险因素(例如家族史或接触传染源)而处于高风险中。
[0289]
对于如本文所描述的疾病或感染的治疗，抗原或其片段的适当剂量将取决于如上定义的要治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程，无论是施用抗原或其片段用于预防或治疗目的、先前的治疗适应症、受试者的临床病史和对抗原或其片段的反应以及主治医师的判断。本文所描述的抗原或其片段或疫苗组合物适合一次或在一系列治疗中施用于受试者。在组合治疗方案中，抗原或其片段和本文所描述的一种或多种另外的治疗剂以治疗有效量或协同量施用。如本文所用，治疗有效量使得抗原或其片段和一种或多种其它治疗剂的共同施用，或本文所描述组合物的施用使降低、抑制或预防如本文所描述的疾病或病症。治疗协同量是协同或显著降低、预防或消除与特定疾病相关的病状或症状所必需的抗原或其片段和一种或多种其它治疗剂的量。在一些情况下，抗原或其片段可以与一种或多种另外的治疗有效剂共同施用以产生使减少、预防或消除与特定疾病相关的病状或症状的累加效应，但由于一种或多种另外的治疗有效药剂的剂量较低，毒性特征大大降低。
[0290]
一方面，本文所描述的疫苗组合物可以进一步包括佐剂或外膜囊泡。
[0291]
如本文在免疫、免疫应答和疫苗接种的上下文中使用的，术语“佐剂”是指与特异性抗原组合使用时产生比单独抗原更强烈的免疫应答的任何物质。当掺入到疫苗调配物中时，佐剂通常起到加速、延长或提高对疫苗抗原的特异性免疫应答的作用。
[0292]
佐剂促进辅助细胞的积累和/或活化以增强抗原特异性免疫应答。佐剂用于增强疫苗的功效，即用于诱导针对抗原的保护性免疫的含抗原组合物。
[0293]
佐剂通常包含产生贮库效应的佐剂、免疫刺激佐剂和产生贮库效应并刺激免疫系统的佐剂。如本文所用，产生长效作用的佐剂是使抗原在体内缓慢释放从而延长免疫细胞对抗原的暴露的佐剂。这类佐剂包含但不限于明矾(例如，氢氧化铝、磷酸铝)；基于乳液的调配物，包含矿物油、非矿物油、油包水或油包水包油乳液、水包油乳液，例如seppic isa系列montanide佐剂(例如，montanide isa 720；法国巴黎液化空气集团(airliquide,paris,france))；mf-59(用span 85和吐温80稳定的水包角鲨烯乳液；加利福尼亚州埃默里维尔希龙公司(chiron corporation,emeryville,calif.))；以及provax
tm
(含有稳定洗涤剂和胶束形成剂的水包油乳液；加利福尼亚州圣地亚哥idec制药公司(idec pharmaceuticals corporation,san diego,calif.))。
[0294]
免疫刺激佐剂是引起免疫系统的细胞活化的佐剂。例如，所述免疫刺激佐剂可能
导致免疫细胞产生和分泌细胞因子。这类佐剂包含但不限于从皂角树皮中纯化的皂苷，例如qs21(通过hplc分离在第21个峰中洗脱的糖脂；马萨诸塞州伍斯特阿奎拉生物制药有限公司(aquila biopharmaceuticals,inc.,worcester,mass.))；聚[二(羧基苯氧基)磷腈(pcpp聚合物；美国病毒研究所(virus research institute,usa))；脂多糖的衍生物，如单磷酰脂质a(mpl；蒙大拿州汉密尔顿瑞比免疫化学研究公司(ribi immunochem research,inc.,hamilton,mont.))、胞壁酰二肽(mdp；ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-mdp；ribi)；om-174(与脂质a相关的氨基葡萄糖二糖；瑞士梅林欧姆制药有限公司(om pharma sa,meyrin,switzerland))；以及利什曼原虫延长因子(纯化的利什曼原虫蛋白；华盛顿州西雅图科雷莎公司(corixa corporation,seattle,wash.))。这类佐剂还包含cpg dna。
[0295]
产生长效效果和刺激免疫系统的佐剂是具有上述两种功能的那些化合物。这类佐剂包含但不限于iscoms(免疫刺激复合物，其含有混合皂苷、脂质并形成带有可以容纳抗原的孔的病毒大小的颗粒；澳大利亚墨尔本csl公司(csl,melbourne,australia))；sb-as2(史克必成(smithkline beecham)佐剂系统#2，其是含有mpl和qs21的水包油乳液：比利时里克森萨特史克必成生物制剂公司[sbb](smithkline beecham biologicals[sbb],rixensart,belgium))；sb-as4(史克必成佐剂系统#4，其含有明矾和mpl；比利时sbb)；形成胶束的非离子嵌段共聚物，如crl 1005(这些含有侧接有聚氧乙烯链的疏水性聚氧丙烯的直链；佐治亚州诺克罗斯vaxcel公司(vaxcel,inc.,norcross,ga.))；以及syntex佐剂调配物(saf，含有吐温80和非离子嵌段共聚物的水包油乳液；科罗拉多州博尔德辛太克斯化学品公司(syntex chemicals,inc.,boulder,colo.))。
[0296]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，佐剂是明矾。
[0297]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，疫苗组合物与外膜囊泡一起调配。
[0298]
如本文所用，“外膜囊泡”或“omv”是指来自微生物(例如，细菌)外膜的脂质囊泡。omv由微生物释放，以与环境中的其它微生物和宿主进行交流。omv涉及细菌信号传导和将细菌生化物质运输到靶细胞。
[0299]
由细菌天然释放或在基于omv的疫苗(例如，脑膜炎球菌疫苗)中诱导的外膜囊泡(omv)。外膜囊泡可以用于增强对感染的免疫应答。因此，omv可以用于代替佐剂或与另一种佐剂组合使用。
[0300]
在所述方面中的任何方面的一些实施例中，所述一种或多种抗原或其片段或对抗原或其片段进行编码的核酸的至少一部分存在于所述外膜囊泡之中或之上。可以通过混合过程将抗原添加到omv中，或者在产生omv的细胞或系统中表达抗原。
[0301]
本文所描述的各个方面的一些实施例可以描述为以下段落：
[0302]
1.一种疫苗组合物，其包括源自病原性细菌的至少一种抗原或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段在宿主感染期间由细菌以与参考水平相比增加的水平表达。
[0303]
2.一种疫苗组合物，其包括源自病原性细菌的至少一种抗原或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段在宿主感染期间由细菌以与参考水平相比降低的水平表达。
[0304]
3.一种疫苗组合物，其包括源自病原性细菌的至少一种抗原或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，其中所述抗原或其片段的每百万中转录物每千碱基的读段
(rpkm)水平大于50。
[0305]
4.根据段落1到3中任一项所述的疫苗组合物，其中所述病原性细菌是粘膜细菌。
[0306]
5.根据段落1到4中任一项所述的疫苗组合物，其中所述病原性细菌是淋病奈瑟菌。
[0307]
6.根据段落1到5中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原选自由以下组成的组：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947。
[0308]
7.根据段落1到5中任一项所述的疫苗组合物，其包括选自由以下组成的组的两种或更多种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947。
[0309]
8.根据段落1到5中任一项所述的疫苗组合物，其包括选自由以下组成的组的至少一种抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947以及至少一种另外的抗原。
[0310]
9.根据段落1到8中任一项所述的疫苗组合物，其中所述至少一种另外的抗原选自由以下组成的组：孔蛋白、菌毛蛋白、tbpa、tbpb、los、metq、slic、mtre、bama、acp以及对前述抗原中的任何抗原进行编码的核酸。
[0311]
10.根据段落1到9中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原由多种淋病奈瑟菌菌株表达。
[0312]
11.根据段落1到10中任一项所述的疫苗组合物，其中所述细菌感染所述宿主受试者的粘膜。
[0313]
12.根据段落1到11中任一项所述的疫苗组合物，其中所述宿主受试者是哺乳动物。
[0314]
13.根据段落1到12中任一项所述的疫苗组合物，其中所述宿主受试者是人。
[0315]
14.根据段落1到13中任一项所述的疫苗组合物，其中所述细菌感染所述宿主受试者的生殖器、嘴巴、眼睑、鼻子、皮肤和/或直肠。
[0316]
15.根据段落1到14中任一项所述的疫苗组合物，其进一步包括佐剂或外膜囊泡。
[0317]
16.根据段落1到15中任一项所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种抗原或其片段或对抗原或其片段进行编码的核酸的至少一部分存在于所述外膜囊泡之中或之上。
[0318]
17.根据段落15所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是明矾。
[0319]
18.根据段落1到17中任一项所述的疫苗组合物，其中至少一种抗原或其片段是假定蛋白。
[0320]
19.根据段落1到18中任一项所述的疫苗组合物，其中至少一种抗原或其片段是脂蛋白。
[0321]
20.一种疫苗组合物，其包括ngo0416多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0322]
21.一种疫苗组合物，其包括ngo0690多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo0948、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0323]
22.一种疫苗组合物，其包括ngo0948多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0324]
23.一种疫苗组合物，其包括ngo1043多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0325]
24.一种疫苗组合物，其包括ngo1215多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1251、ngo1438、ngo1701、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1043、ngo1428、ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0326]
25.一种疫苗组合物，其包括ngo1701多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及选自由以下组成的组的抗原：ngo0188、ngo0449、ngo0914、ngo1332、ngo1377、ngo1543、ngo1549、ngo1607、ngo1880、ngo1948、ngo2057-ngo0416、ngo0571、ngo0757、ngo1215、ngo1251、ngo1438、ngo1868、ngo2119-ngo0227、ngo0354、ngo0588、ngo0648、ngo0678、ngo0690、ngo0694、ngo0768、ngo0861、ngo0891、ngo1043、ngo1428、
ngo1729、ngo1802和ngo1947多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0327]
26.一种疫苗组合物，其包括以下抗原多肽或对此类抗原多肽或其片段进行编码的核酸：ngo0416；ngo0690；ngo0948；ngo1043；ngo1215；和ngo1701。
[0328]
27.一种疫苗组合物，其包括ngo0690多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸，以及ngo1701多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0329]
28.一种疫苗组合物，其包括ngo690多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸、ngo0948多肽或其片段以及ngo1701多肽或其片段或对此类抗原或其片段进行编码的核酸。
[0330]
29.一种在受试者中引发对病原性细菌的免疫应答的方法，所述方法包括：向受试者施用根据段落1到28中任一项所述的疫苗组合物。
[0331]
30.根据段落29所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[0332]
31.根据段落29到30中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0333]
32.根据段落29所述的方法，其中所述施用是通过注射、口服或鼻内施用进行的。
[0334]
33.根据段落29所述的方法，其中所述细菌是淋病奈瑟菌。
[0335]
34.根据段落29到33中任一项所述的方法，其中所述疫苗组合物引发针对多种细菌菌株具有保护性的免疫应答。
[0336]
35.根据段落29到34中任一项所述的方法，其中所述疫苗组合物引发针对多种淋病奈瑟菌菌株具有保护性的免疫应答。
[0337]
36.一种选择用于制备疫苗组合物的抗原的方法，所述方法包括：
[0338]
a.对来自感染有细菌的受试者的样品的rna进行测序，其中所述样品包括由所述细菌表达的rna；
[0339]
b.将在步骤(a)中获得的rna序列信息与从在培养物中生长的所述细菌中获得的rna序列信息进行比较，并且鉴定当与参考水平相比时在感染期间表达水平受到调节的一组候选转录物；
[0340]
c.检测在步骤(b)中鉴定的所述一组候选转录物的开放阅读框的以下性质中的一个或多个性质：
[0341]
i.每百万中转录物每千碱基的读段(rpkm)水平大于25；
[0342]
ii.免疫原性概率评分为至少0.4；
[0343]
iii.经编码的多肽的细胞定位处于细胞膜、周质或细胞外膜内；
[0344]
iv.所述经编码的多肽不具有在人与其它细菌物种之间保守的氨基酸序列；
[0345]
ii.所述经编码的多肽具有在多个细菌菌株中保守的氨基酸序列；并且
[0346]
iii.所述经编码的多肽是假定蛋白，
[0347]
其中选择包括所述性质中的一个或多个性质的经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。
[0348]
37.根据段落36所述的方法，其中选择包括步骤c中的所述性质中的两个或更多个性质的所述经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。
[0349]
38.根据段落36所述的方法，其中选择包括步骤c中的所述性质中的三个或更多个性质的所述经编码的多肽作为疫苗组合物的候选抗原。
[0350]
39.根据段落36所述的方法，其中选择包括步骤c中的所述性质中的四个或更多个
no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:64、seq id no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71和seq id no:72。
[0367]
应当理解，前述描述和以下实例仅是说明性的，并且不应被视为对本发明范围的限制。在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本领域技术人员显而易见的对所公开的实施例进行各种改变和修改。进一步地，出于描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法的目的，所有专利、专利申请和出版物明确地通过引用并入本文。仅提供这些出版物在本技术的提交日期之前的公开内容。这方面的任何事物都不应被解释为承认发明人有权借助于先前发明或出于任何其它原因而先于这些公开内容。关于这些文件的日期或内容的所有陈述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的承认。
[0368]
出于描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法的目的，所有鉴定的专利和其它出版物明确地通过引用并入本文。仅提供这些出版物在本技术的提交日期之前的公开内容。这方面的任何事物都不应被解释为承认发明人有权借助于先前发明或出于任何其它原因而先于这些公开内容。关于这些文件的日期或内容的所有陈述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的承认。
[0369]
实例
[0370]
实例1：使用综合生物信息学方法发现在天然黏膜感染期间表达的新淋病奈瑟菌疫苗抗原
[0371]
在过去十年中，世界范围内报道了抗生素耐药性淋病奈瑟菌菌株的日益严重的趋势，强调需要新的治疗策略来治疗这种性传播感染。迫切需要开发一种疫苗来预防淋球菌感染。不幸的是，由于缺乏合适的疫苗抗原，以及人类保护性免疫相关性的难以捉摸以及用于测试保护作用的淋球菌生殖道感染动物模型不足，这已被推迟。在目前的研究中，使用类似“反向疫苗学”的方法连同用于发现新候选者疫苗抗原的生物信息学工具来挖掘在天然人类粘膜感染期间与体外生长期间表达的假定蛋白。设计了候选抗原选择策略(cass)，分为发现阶段dp-1和dp-2。此策略允许鉴定36种淋球菌假定蛋白，这些蛋白预计具有免疫原性和膜相关性，在淋病奈瑟菌菌株中保守，并且具有适合重组表达和制造的结构特征。选择了六种抗原用于小鼠的免疫表征，显示在淋病奈瑟菌实验室菌株和临床相关菌株之间诱导交叉反应性免疫应答。三种假定蛋白的抗血清对所有测试的淋球菌菌株均表现出杀菌活性，并且另外一种抗血清表现出菌株依赖性细菌杀伤。这些结果支持cass作为一种工具，用于在人类天然感染期间表达的淋球菌假定蛋白中发现新抗原，并将其包含在改进淋球菌疫苗的候选者疫苗库中。
[0372]
简介
[0373]
淋病奈瑟菌是性传播感染(sti)淋病的病原体，这是一种多方面的疾病，在全球范围内发病率很高，估计每年有8700万例病例(1)。男性淋病奈瑟菌感染大多有症状(尿道炎)，而女性淋病通常无症状，导致生殖道并发症(盆腔炎(pid)、异位妊娠和不孕症)和播散性淋球菌感染(dgi)(1)。目前治疗淋病奈瑟菌感染的治疗和药理学方法曾经很容易通过标准抗生素疗程进行治疗，但现在由于氟喹诺酮类药物耐药性的出现和对fda批准的最后一种抗生素头孢克肟的耐药性水平上升而变得复杂(2-7)。目前，cdc建议使用头孢曲松和阿奇霉素进行治疗，但对头孢克肟和头孢曲松的耐药性已经在美国以外形成，导致无法治愈
的淋病的潜在传播。迫切需要开发一种疫苗来预防淋球菌感染。抗生素治疗失败的替代性选择包含疫苗接种。不幸的是，天然黏膜感染中保护性免疫的相关性难以捉摸，加上淋球菌生殖道感染动物模型不足以测试保护作用，重要的是，合适的疫苗抗原的稀缺延迟了疫苗的开发(8)。
[0374]
现有淋球菌女性生殖道感染小鼠模型的主要局限性包含需要激素/抗生素治疗、小鼠品系特异性和基因操作以确保细菌定植和存活(9-12)。人类志愿者男性尿道感染模型已被用于解决急性感染阶段，然而，它的局限性在于它不能复制慢性女性生殖道感染(13-16)。已在动物模型和人类男性志愿者模型中测试的历史亚基抗原仅显示出有限的保护作用(通常仅限于同源菌株)，由产生具有杀菌活性(sba)的抗体定义。人类的保护相关性和保护性免疫机制尚不清楚，可能与小鼠不同，影响体内疫苗评估。在人类中再次感染有同源菌株和异源菌株两者表明记忆应答不令人满意。此外，还显示了免疫逃避或免疫抑制机制，例如诱导低滴度的非保护性甚至阻断性抗体(即抗rmp抗体)(17))。
[0375]
淋病奈瑟菌不具有由密切相关的生物体脑膜炎奈瑟菌表达的高度免疫保护荚膜多糖抗原(cps)(18)迄今为止，仅两种蛋白抗原疫苗在临床试验中进行了测试，未能显示出对异源感染的保护作用(8)。其它淋球菌表面蛋白已被探索为小鼠感染模型中的抗原，但大多数仍然几乎不能防止异源菌株感染。这主要是由于高氨基酸序列和相位变异性(即菌毛蛋白、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白tbpa和tbpb、外排泵蛋白(mtrc-mtrd-mtre、fara/b)(19-25))。最近的候选者包含metq(26)、mrsa/b(27)、bama(28)和acp(29)。基于2c7 los表位的疫苗已成为保护性候选者疫苗(30-33)，并且由于基于脑膜炎球菌omv的疫苗对淋病奈瑟菌具有交叉反应保护的证据，对外膜囊泡疫苗的兴趣也重新燃起(34-39)。
[0376]
先前基于反向疫苗学的方法(最初为脑膜炎奈瑟氏菌血清组b疫苗4cmenb(40-42)开发)，基于基因组学和蛋白质组学的策略已经研究了以前传统方法未发现的抗原(43-48)。当检查来自天然感染的人类尿道和宫颈阴道受试者的灌洗样本时，发现：1)淋球菌通过不同水平的基因表达对男性和女性生殖道环境产生特异性反应；以及2)淋球菌在体外以不同的方式表达和调节基因表达。检测到体内表达水平高于体外表达的基因被称为体内表达因子(ivef)。另外地，在人类感染期间表达的约30％的淋球菌基因编码假定蛋白。
[0377]
在当前专注于淋球菌假定蛋白的研究中，设计了一种全面、高通量的计算机筛选方法(候选抗原选择策略或cass)，用于基于预测的免疫原性、膜缔合/表面暴露、保护以及有利于未来扩大规模和制造的结构特征来鉴定新疫苗靶标。两个发现阶段(dp)用于鉴定36个假定蛋白靶标。这36种假定蛋白中的六种被重组表达并用于使小鼠免疫。免疫表征揭示了针对淋病奈瑟菌实验室和临床菌株的交叉反应抗体的诱导，以及菌株特异性血清杀菌活性。这些研究支持通过cass方法发现新的淋球菌抗原，并基于自然人粘膜感染期间淋球菌的转录组分析。
[0378]
材料和方法。
[0379]
候选抗原选择策略(cass)和计算工具。以下生物信息学分析和预测工具用于分析和优先考虑候选抗原：vaxijen用于预测抗原性和保护潜力(截止值为0.4)(44，51)psortb v3.0、predictprotein和gneg-mploc用于蛋白质亚细胞定位(52-54)；vaxign可在万维网《violinet.org/vaxgen/index.php》和blastp(blast 2.2.26 )(55，56)上找到，用于蛋白质序列分析，与人类/小鼠/大肠杆菌蛋白、淋病奈瑟菌和乳糖发酵奈瑟菌蛋白的氨基酸序列
相似性。使用hmtmm检查蛋白质结构特征以预测跨膜结构域的存在和数量(57)，使用phobius预测拓扑结构(58)，并且使用signalp v5.0和secretomep(59-61)预测信号肽、切割位点和翻译后修饰的存在/类型。用blast、uniprotkb(62)、pfam(63)并且通过pubmed记录评估蛋白质功能分析。使用可在万维网《pubmlst.org/neisseria》上获得的pubmlst在淋病奈瑟菌(4198个菌株)和乳糖发酵奈瑟菌(288个菌株)中检查基因存在、等位基因分布和序列保守性(64)。通过ncbi中的blastp检查蛋白质序列保守性(从淋病奈瑟菌fa1090(gen bank登录号ae004969)推断)。
[0380]
细菌菌株和生长条件。淋病奈瑟菌菌株f62和fa1090用作实验室参考菌株。还使用了从南京队列菌株选择中分离出的两种代表性菌株(49)：淋病奈瑟菌菌株u08401和u08402，分别从受感染的男性和其自我报告的一夫一妻制女性伴侣中获得。细菌在37℃下通过5％co2在补充有1％isovitalex的gc琼脂板上生长过夜，或在cdm中的液体培养中培养1到3小时(od
600
为1＝1-2
×
109细菌/ml)，并且以每次实验期望的浓度重新悬浮。对于福尔马林固定(ff)，将细菌与1％多聚甲醛在4℃下一起温育1小时，洗涤并重新悬浮在pbs中。大肠杆菌菌株bl21在37℃下通过5％co2在lb琼脂板上生长，或在lb液体培养基中生长，使用卡那霉素(50μg/ml)或羧苄青霉素(100μg/ml)作为选择抗生素。
[0381]
重组淋球菌假定蛋白的克隆和表达。将ngo0416、ngo0690、ngo1043、ngo1215和ngo1701克隆到具有氨苄青霉素抗性盒的pet17b质粒中，将ngo0948克隆到具有卡那霉素抗性的pet30a质粒中(新泽西州皮斯卡塔韦金思特科技公司(genscript,piscataway,nj))，并且随后转化到大肠杆菌bl21(de3)中以进行重组表达。基于淋病奈瑟菌fa1090的可用蛋白质序列对引物进行密码子优化。所有结构都包含c端6x his标签；ngo0948被克隆为全长蛋白，并且ngo0416、ngo0690、ngo1043、ngo1215和ngo1701被克隆为没有信号序列的截短蛋白。接种在含有适当抗生素的lb肉汤中的经转化的大肠杆菌培养物在存在1mm iptg的情况下在22℃下生长过夜，用于ngo0416和ngo1043表达，或在37℃下过夜培养，然后第二天在37℃下诱导iptg持续4小时以用于ngo0690、ngo0948、ngo1215和ngo1701表达。
[0382]
重组假定蛋白的色谱纯化。诱导之后，通过以5000rpm离心15分钟收集细菌。在4℃下，每克细胞重悬于3ml缓冲液a(50mm磷酸钠，300mm nacl，ph 7.8，1x蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司(sigma)))中，并且用溶菌酶和脱氧胆酸盐(0.1mg/ml和4mg/g细胞沉淀)在室温下直至粘稠。然后添加dna酶i(0.02mg/g的细胞)直到悬浮液恢复为非粘性，然后离心(10,000x rpm，4℃下持续20分钟)以分离可溶性蛋白质部分和包涵体。使用aktaprime plus色谱系统(ge)在ni

快速流动琼脂糖(赛默科技公司(thermoscientific))柱上纯化所有蛋白质。ngo1043、ngo1215和ngo1701产生50％或更多的可溶性，并从缓冲液a和10-300mm咪唑梯度中的可溶性部分中纯化。将ngo0416、ngo0690和ngo0948包涵体溶解在变性缓冲液a(含有10mm咪唑和6m胍)中。在变性缓冲液b(50mm磷酸钠、300mm nacl、ph 7.8、1x蛋白酶抑制剂混合物、10mm咪唑和8m尿素)和10-300mm咪唑梯度中进行纯化。通过sds-page/考马斯染色检查柱流过、洗涤和洗脱级分以评估蛋白质纯度。使用小鼠抗his标签hrp缀合抗体(英杰公司(invitrogen))和1-步tnb检测(赛默科技公司)使用斑点印迹来验证阳性部分。将合并的级分针对pbs/0.02％nan3进行广泛透析，并通过bca测定法(皮尔斯(pierce))测量蛋白质浓度。
[0383]
对小鼠进行免疫。雌性balb/c小鼠(4周大)(杰克逊实验室(jackson labs))根据
美国国立卫生研究院(nih)和塔夫茨大学的规程进行饲养和照料。每组八只小鼠以两周间隔，使用与明矾(imject)(赛默科技公司)以1:1v/v比率调配的纯化重组蛋白(10μg/小鼠/免疫)以总体积为100μl/免疫皮下(s.c.)免疫三次。如上用pbs和明矾免疫对照组(佐剂对照)。在第一次免疫之前收集免疫前血清并且在每次免疫后两周收集免疫血清。血清保存在-80℃下直到使用。
[0384]
免疫印迹。使用狭缝印迹设备(霍弗(hoefer))在硝酸纤维素过滤器上发现使用肌氨酰(sarkosyl)(26)分离的福尔马林固定(ff)细菌(总共2-4
×
108cfu)或外膜蛋白(omp)级分(总共5μg)。将膜风干，用tbs/吐温20(tbs-t)中的1％bsa封闭，并在4℃下与等分的合并免疫小鼠血清(1:200稀释)一起温育过夜。使用抗小鼠igg次级ap缀合抗体(南方生物技术公司(southern biotech))检测具有nbt/bcip显色底物(伯乐公司(biorad))的免疫反应点。
[0385]
抗体elisa。对于经纯化的抗原，高结合elisa板用2μg//孔的每种假定蛋白在碳酸盐缓冲液ph 9.0中包被，在pbs中在4℃过夜。洗涤板，在室温下用pbs/0.05％吐温-20中的1％bsa封闭2小时，并在4℃下用连续稀释的小鼠免疫前和免疫血清温育过夜。第二天，洗涤板，与ap缀合的次级抗小鼠总igg、igg1或igg2a抗体(南方生物技术公司)一起温育，然后在od
405
下进行1步pnpp试剂(赛默科技公司)和分光光度检测。对于整个细菌，elisa板用ff淋病奈瑟菌(1-1.5
×
107个细菌/孔)包被，用1:100稀释度的血清与如上所述的次级抗体一起温育。在一式两份的孔中测试来自单个小鼠的血清，并在一式四份的孔中测试合并的小鼠血清等分试样。参考标准曲线用于定量总igg和igg亚类(以μg/ml为单位)，具有线性回归函数(65)。th2/th1比率确定为igg1/igg2a。
[0386]
细胞因子elisa。根据制造商的规格使用opt-eia试剂盒(bd生物科学公司(bd biosciences))通过elisa测量小鼠血清中的il-4和il-10(th2细胞因子)、il-12和ifn-γ(th1细胞因子)、il-6和tnf-α(促炎细胞因子)。如上所述测试来自个体小鼠或合并的血清等分试样的免疫前和免疫血清。细胞因子以pg/ml表示并标准化为免疫前血清。
[0387]
流式细胞术。将ff淋病奈瑟菌(108/ml)与合并的免疫前和免疫小鼠血清(1:200)在2％fbs/pbs中于4℃下温育30分钟，洗涤并用抗小鼠igg fitc-标记的次级抗体(e生物科学公司(ebioscience))(1:1000)在4℃下染色30分钟。阴性对照包含单独的细菌和仅用fitc标记的次级抗体温育的细菌。使用cellquest采集软件(加利福尼亚州山景城碧迪公司(becton dickinson,mountain view,ca))在facscan
(tm)
流式细胞仪上检查样品，并用flowjo软件(塔夫茨大学流式细胞仪核心(tufts university flow cytometry core))分析。门控用于排除细胞碎片。示出的直方图代表至少两个单独的实验。
[0388]
杀菌测定(sba)。sba在75μl总体积的96孔u型底板中进行。耗竭igg和igm的正常人血清用作补体来源(佩尔-弗里兹生物制剂公司(pel-freez biologicals))。简而言之，将od
600
为0.2＝2-4
×
108cfu/ml的淋病奈瑟菌液体培养物连续稀释以获得2-4
×
104cfu/ml。对于每个实验条件，每孔将12.5μl的细菌接种在含有0.15mm cacl2和1mm mgcl2(hbss

)的hbss中，并在室温下温育持续20分钟，并连续稀释热灭活(56℃持续30分钟)的合并小鼠免疫前和免疫血清先前已耗竭的igm部分。对于fa1090，将20％nhs添加到每孔中，并且对于f62、u08401和u08402，使用10％nhs。立即将10μl等分的细菌悬浮液接种到isovitalex-gc琼脂板上(时间0)。将96孔板在37℃下温育30分钟，其中轻轻振荡，并按上述方法接种等分
试样(时间30)。次日，通过cfu计数评估细菌杀伤；存活率表示为t30/t0
±
sem时细菌存活率的百分比。杀菌滴度定义为30分钟之后杀伤率≥50％的最低血清稀释度的倒数(32)。对照包含单独的细菌、单独与nhs温育的细菌(阴性对照)和来自pbs/明矾免疫小鼠的血清(佐剂对照)。
[0389]
统计分析。使用非配对t测试比较两个样品/条件，并使用单向方差分析(anova)来检查统计显著性，以确定使用图克多重比较(tukey's multiple comparison)或未校正的fisher lsd测试的多组之间的显著性。如正文和附图说明中所示，在最小p值为0.05时差异被认为是显著的。
[0390]
结果
[0391]
淋球菌候选抗原选择策略(cass)。
[0392]
在先前的一项研究中，对来自中国南京std控制中心(ncstd)的一组天然感染的受试者的尿道和宫颈阴道灌洗液样本进行了rna-seq分析(49，50)。从受感染的男性及其女性伴侣中分离出的淋球菌菌株通过全dna测序与淋病奈瑟菌fa1090具有高度同源性，具有相同的dna序列同一性，并且比在美国分离的菌株具有更高的抗生素耐药性(淋球菌分离物监测项目(gisp)(6，66，67))对天然人粘膜感染期间表达的淋球菌转录组的分析表明，大约30％的总表达基因编码假定蛋白(49)。这些在来自受感染男性的样本中总共有678个基因，在女性样本中总共有655个基因(图1)。这些是通过多管齐下的候选抗原选择策略(cass)进行挖掘的，所述策略被设计成通过以下两个发现阶段(dp)优先考虑男性和女性感染期间体内表达的假定蛋白，以及潜在的免疫原性、表面暴露和非高变蛋白质。
[0393]
发现阶段(dp)1：通过应用50rpkm的基因表达单位截止值(rna-seq基因表达＝rpkm中的转录表达单位或每百万映射读段中转录物每千碱基的读段数)将假定蛋白分为低表达组或高表达组。rpmk《50的蛋白质被排除(女性数据集中469个，男性数据集中394个)(图1)，rpkm》50(女性数据集中186个，男性数据集中284个)的蛋白质被匹配以鉴定存在于两个数据集中的那些，从而产生了163个共享的假定蛋白池(图1)。
[0394]
朝着可管理数量的候选者迈进，使用高通量生物信息学工具过滤了163种假定蛋白。首先，使用vaxijen(51)检查了这些具有免疫原性的概率，它基于氨基酸序列分配了无偏置的抗原概率评分。设定0.4的截止阈值(44)，此分析预测112种假定蛋白是推定的抗原(图1)。接下来，使用psortb v3.0、predictprotein和gneg-mploc(52-54)分析蛋白质细胞分布预测了43种假定蛋白为胞质；这些被排除在外。预测为非胞质的其余69种假定蛋白被推进到发现阶段2(dp-2)(图1)。
[0395]
发现阶段(dp)2：使用万维网《violinet.org/vaxgen/index.php》上提供的vaxign和blastp(blast 2.2.26 )检查69种假定蛋白的氨基酸序列与人、小鼠和大肠杆菌蛋白质的保守性)(55，56)(图2)。与人/小鼠基因相比，e值》1e-10的假定蛋白质被认为是潜在的自身抗原并被排除在外(3种蛋白质)。大肠杆菌中具有》40％序列相似性》70％基因长度的蛋白质，被认为是广泛存在的细菌管家基因，也被排除在外(8种蛋白质)。剩余的58种假定蛋白通过blast搜索在ncbi中可用的淋病奈瑟球菌基因组内评估氨基酸序列保守性，并且在多个淋病奈瑟菌菌株中》70％的氨基酸序列中都具有》40％的序列相似性(图2)。
[0396]
通过使用tmhmm server v.2.0(57)分析跨膜结构域(tm)的存在和数量，预测58个候选者蛋白质中的3个假定蛋白具有》4个tm，并且被认为具有潜在的高结构限制的蛋白质；
预测23个候选者具有1-4个tm(考虑为低/中等结构限制)，32个候选者不具有tm结构域(图2)。同时，详细解析了与细菌膜隔室相关的假定蛋白，还借助phobius、signalp和secretomep的拓扑和分泌预测(58-61)：28种假定蛋白可能与内膜(im)相关，9种与周质(p)相关，21种与外膜相关，面向周质或细胞外空间(p/om/ex)(图2)。im预测的蛋白质由psi-blast修改并手动整理以排除那些可能参与细胞溶质过程的蛋白质(9种蛋白质)。翻译后结构修饰，如信号肽(sp)的存在和类型，表明20种假定蛋白预测不含有sp；16种假定蛋白含有经典sp，11种具有典型的外膜暴露脂蛋白sp(内膜脂蛋白在切割位点之后的 2位具有天冬氨酸(d))；7种假定蛋白含有tatp预测的sp，5种是非经典输出的膜蛋白(特殊折叠要求或大蛋白质复合物的一部分)(未示出)。基于这些结果，排除了预测为细胞外的3种假定蛋白，以及7种推定的菌毛相关蛋白(图2)。总体而言，dp-2的完成产生总共36种假定蛋白，其中16种是完全假定的，20种与ncbi blast、uniprotkb、pfam分析中的其它细菌蛋白质具有推定的功能或保守结构域相似性(图2)。
[0397]
在这项研究中，选择了六种初始假定蛋白候选者进行免疫学表征。表2(图9)总结了这些候选者的cass特征。ngo0416是一种预测的周质蛋白，与lamb糖孔蛋白的n端结构域具有推定的保守结构域(cd)相似性(68)；ngo0690是一种推定的脂蛋白，预测与周质和om(p/om)相关；ngo0948也是一种p/om推定脂蛋白，可能是nlpb/dapx家族(cog3317)的成员，与bamc(一种潜在的脑膜炎球菌疫苗抗原)具有同源性(69-71))；ngo1043是一种推定的p/om脂蛋白，可能是糖基化的，与脑膜炎球菌抗原ag473同源(42，72)；ngo1215是一种预测的周质蛋白，与铜伴侣pcu(a)c超家族(cog2847)(潜在毒力因子)具有cd同源性(73)，并且ngo1701是一种膜蛋白，预测与duf326超家族的tat_cys_富集四螺旋束铜结合蛋白具有cd同源性。
[0398]
假定蛋白候选者的序列分析和保存。
[0399]
通过评估pubmlst数据库中总共4198个淋球菌基因组中的基因存在和序列保守性，对这些候选者进行了详细的基因和蛋白质序列分析，所述数据库可在万维网《pubmlst.org/neisseria/》(64)(2019年4月访问))上获得。这是跨越6个十年(1960-2018)的全球代表性淋病奈瑟菌菌株集合，并且包含来自南京集合的菌株。这6种假定蛋白存在于所有检查的淋球菌中，并且是淋球菌核心基因组(ng cgmlst v1.0)的一部分。这些蛋白质的对应neis命名法是neis0782(ngo0416)、neis0906(ngo0948)、neis1164(ngo0690)、neis1474(ngo1215)、neis2446(ngo1043)和neis2720(ngo1701)(表3)。鉴定了不同数量的等位基因，表明一些序列多样性。最保守的蛋白质是ngo0416，只有6个等位基因(p距离＝0.006)，而最多样化的是ngo0948(p距离＝0.005)，有55个等位基因，尽管由于序列数据不完整，无法为8个菌株分配等位基因，因为基因定位于重叠群的末端。2个分离物中的ngo1215也是如此。共有27个菌株也具有不完整的ngo1043基因，并且在nt 127(5'-gccgccgagtctgcggcttct-3')处的21bp重复区域在等位基因138中出现3次，在等位基因137中出现两次，在除等位基因141之外的其余等位基因中出现一次。由于某些基因的等位基因数量众多，因此仅显示了与代表最多的基因相对应的基因，特别是在总菌株中具有5％以上代表性的基因(表3)。例如，3069个淋病奈瑟菌菌株具有ngo0416等位基因17，相当于4198个分离物总数的73％。最具代表性的等位基因中的非同义氨基酸序列突变也在表3中指示。
[0400]
表3：淋病奈瑟菌中的假定蛋白等位基因分布(pubmlst中的4198个菌株)。
[0401][0402][0403]1数量最高的菌株中最常见的等位基因。
[0404]2在检查的分离物总数中表达给定等位基因的菌株的百分比。数据从于2019年4月访问的万维网《pubmlst.org/bigsdb？db＝pubmlst_neisseria_isolates》中收集。
[0405]
在pubmlst的乳糖发酵奈瑟菌(总共288个基因组)中也评估了6种假定蛋白的分布。在所有乳糖发酵奈瑟菌基因组中均不存在ngo0416，并且对于其它5个假定蛋白基因，未观察到与淋球菌的等位基因重叠。比较来自每个物种的每个基因座的最普遍等位基因显示低保守性(表4)。对ncbi中可用乳糖发酵奈瑟菌蛋白的6个候选者的氨基酸序列进行blastp分析显示，仅ngo1043在整个蛋白质长度上共享最多60％的氨基酸序列同一性。在分析由cass衍生的所有36种淋球菌假定蛋白的蛋白质保守性后，除了ngo1043之外，仅4种另外的蛋白质与乳糖发酵奈瑟菌蛋白具有最大60％的序列相似性(未示出)。
[0406]
表4：对乳糖发酵奈瑟菌中的6个假定蛋白候选者等位基因的pubmlst分析1[0407]
[0408][0409]1数量最高的菌株中最常见的等位基因。
[0410]2在检查的分离物总数中表达给定等位基因的菌株的百分比。数据从于2019年4月访问的万维网《pubmlst.org/bigsdb？db＝pubmlst_neisseria_isolates》中收集。
[0411]
网络-对靶基因的中心性分析。
[0412]
作为对与生长条件和环境相关的基因表达的进一步分析，转录组数据与源自不同和多个淋病奈瑟菌实验的另外rna-seq数据集的集合合并(74-77)。生成了一个通过它们的共表达连接基因的网络(mcclure等人)，其中每个基因代表由一个节点表示，并且两个节点之间高度相关的每个实例由一条边表示。在这些网络内，基因相对于总基因的位置反映了其中心性，以度数和介数来测量。度数是指一个节点与其它节点的边数，介数是测量单个节点连接两个较大节点集群的程度。为淋病奈瑟菌推断的网络含有约1000个基因(图3a)。检查了此网络中6个假定蛋白候选者的中心性分数，结果显示ngo0948具有高度和高介数值，ngo690具有高介数值(图3b)，并且其余4个基因在两次测量中都具有平均中心值(未示出)。有关基因中心性的信息增加了其作为推定疫苗目标的潜力，尽管较低甚至缺乏中心性并不是排除标准。
[0413]
6种假定蛋白候选者的克隆、表达和纯化。
[0414]
ngo0416、ngo0690、ngo0948、ngo1043、ngo1215、ngo1701被克隆为没有sp的截短蛋白，并且ngo0948被克隆为全长蛋白。ngo1043、ngo1215和ngo1701的可溶性为50％或更多，并在自然条件下通过ni

亲和色谱法纯化；ngo0416、ngo0690和ngo0948在变性条件下从包涵体中纯化。用小鼠抗his抗体通过斑点印迹分析鉴定阳性部分，并且基于每种蛋白质的预测分子量(未示出)通过sds-page和考马斯染色检查蛋白质纯度。
[0415]
淋球菌假定蛋白在小鼠中具有免疫原性。
[0416]
纯化的蛋白质用于以明矾作为佐剂皮下免疫雌性balb/c小鼠。通过elisa测试免疫前血清(pr)和免疫血清的抗原特异性抗体的存在和量。用ngo0416、ngo0690、ngo0948、ngo1215和ngo1701(图4a-c和3e-f)免疫诱导抗原特异性igg的强烈产生，而ngo1043诱导显著较低的igg量(图4d)。通过图克多重比较测试的单向方差分析，p的值在0.001与0.05之间被认为存在显著差异，通过*指示。对igg亚类的分析和定量揭示了丰富的igg1水平，通常在使用明矾作为佐剂时引发的th2型反应中观察到(表5)。igg1/igg2比率表明ngo0690和ngo1043(比率》10)有很强的th2偏差，并且ngo1701可能有更平衡的th2/th1偏差(igg1/igg2a比率接近1)。
[0417]
表5：igg亚类。血清igg1和igg2a(μg/ml
±
sem)和igg1/igg2a比率。
[0418]
组igg1igg2aigg1/igg2ango041616.6
±
0.8a2.86
±
0.4》1bngo069017
±
0.3a0.007
±
0.002》》1ango094816
±
2.4a4.2
±
0.6》1bngo10430.42
±
0.151.9
·
10-5
±
6.4
·
10-6
》》1ango12158.3
±
0.09a0.89
±
0.3》1bngo170130.6
±
0.835.3
±
1.37约1c[0419]a强th2偏差
[0420]
b th2偏差
[0421]c均衡th1/th2
[0422]
淋球菌假定蛋白诱导小鼠产生血清细胞因子。
[0423]
通过elisa测量血清细胞因子并以pg/ml表示，归一化为免疫前血清。用ngo0416和ngo0690免疫诱导最高水平的il-4，而ngo1043诱导低水平的il-4和il-10(表6)。所有抗原诱导的il-12p70水平相当，而ngo0416和ngo1701诱导的ifn-γ比其它抗原更高。用ngo0690和ngo1701免疫诱导高il-6水平，并且tnf-α响应于ngo0416、ngo0948和ngo1701升高(表6)。总体而言，尽管与相同的佐剂一起使用，但每种抗原诱导的血清细胞因子水平的变异性表明对免疫引发的炎症谱有潜在的抗原特异性贡献。
[0424]
表6：血清细胞因子。il-4、il-10、il-12p70、ifn-γ、il-6和tnf-α(pg/ml，与免疫前血清的比率
±
sem)
[0425]
基因il-4il-10il-12p70ifn-γil-6tnf-αngo041614.6
±
1.6a8.7
±
2.5b2.2
±
0.6d5.6
±
0.5a1.8
±
0.64
±
0.7ngo06909.5
±
0.4a4.4
±
0.61.2
±
0.11.8
±
0.26.4
±
20.8
±
0.2cngo09482.2
±
0.73.6
±
0.70.8
±
0.10.9
±
0.41.4
±
0.3c3.4
±
0.5ngo10430.5
±
0.11.7
±
0.2c1.4
±
0.11.2
±
0.1
c1±
0.1c1.1
±
0.2cngo12151.7
±
0.22.1
±
0.21.3
±
0.081
±
0.2c1.2
±
0.1
c1±
0.2cngo17012.8
±
0.35.6
±
0.71.6
±
0.33.2
±
111
±
7.25.5
±
2.9
[0426]a通过图克多重比较测试与所有组相比的单向方差分析显著；
[0427]b对ngo1215；c对ngo1701；d对ngo0948
[0428]
淋球菌假定蛋白在多种淋病奈瑟菌菌株中表达并引发交叉反应性抗体。
[0429]
为了确认整个细菌中6种假定蛋白的免疫识别，通过狭缝印迹法对福尔马林固定(ff)淋病奈瑟菌菌株f62和fa1090以及来自南京队列收集的两个菌株u08401和u08402进行了测试(49，50)。针对每种假定蛋白的混合小鼠免疫小鼠血清识别这四种菌株，表明整个细菌中六种候选者中的每一种的存在和免疫反应性(图5a)。通过sds-page和等效细菌体积的考马斯染色验证点样细菌等分试样中相同的总蛋白质含量，显示所有样品中一致的条带分布和强度(图5b)。
[0430]
然后通过ff细菌的全细胞elisa对血清交叉反应性进行量化，并将igg表示为μg/ml
±
sem。与测试的其它三种菌株相比，针对淋病奈瑟菌菌株u08401检测到显着更高的抗ngo0416和抗ngo0948 igg量，并且还观察到抗ngo0690的类似趋势(图6a-c，条纹条)。对ngo1043的igg水平较低，但在四种菌株中是一致的(图6d)，最后，观察到针对淋球菌f62和fa1090菌株的ngo1215和ngo1701的igg量高于临床分离菌株的趋势(图6e-f，黑色和灰色条)特别适用于抗ngo1215血清。总体而言，狭缝印迹分析和elisa结果表明，这6种假定蛋白
在不同的完整淋病奈瑟菌菌株中被相应的小鼠抗血清表达和识别，具有明显的菌株特异性。这可能是由于这些特定蛋白质在四种淋病奈瑟菌菌株中的体外表达不同。
[0431]
淋球菌假定蛋白质定位在细菌膜中。
[0432]
为了验证蛋白质定位预测，来自淋病奈瑟菌f62和fa1090的外膜蛋白(omp)部分通过免疫印迹分析用小鼠免疫血清对每种假定蛋白进行了检查。图7a示出了omp的代表性免疫印迹(5μg总蛋白质含量)；假定蛋白在来自两种淋病奈瑟菌菌株的omp中被识别，强度不同。ngo0416在两种菌株中的免疫反应性最低，这可能是由于omp组分中仅部分存在/暴露和/或低表达水平，特别是在淋病奈瑟菌fa1090中。类似地，ngo0948在来自淋病奈瑟菌fa1090的omp中也显示出明显较低的免疫反应性，而ngo0690、ngo1043、ngo1215和ngo1701在两种菌株中是一致的(图7a)。抗孔蛋白小鼠抗体用作omp含量的对照，并在两种omp级分中显示出高免疫反应性(孔蛋白代表》60％的奈瑟氏球菌omp)。
[0433]
为了检查整个完整细菌表面上假定蛋白的免疫识别，通过流式细胞术使用针对每种假定蛋白的小鼠抗血清检查ff淋病奈瑟菌f62、fa1090、u08401和u08402菌株。免疫前血清用作阴性对照(图7，细线直方图)，另外的对照包含仅与fitc缀合的抗小鼠次级抗体温育的细菌(图7，灰色直方图)并且没有任何抗体(图7，深灰色直方图)。在所检查的四种淋病奈瑟菌菌株中的任何一种中，用抗ngo0416血清、抗ngo1043和抗ngo1215血清均未检测到表明抗体与细菌表面结合的荧光位移(未示出)。相比之下，用抗ngo0690血清(图7b，红线直方图)、抗ngo0948血清(图7b，蓝线直方图)和抗ngo1701血清(图7b，绿线直方图)检测在所有四个菌株中与细菌表面结合的抗体。与图7a中的免疫印迹结果一致，在淋病奈瑟菌f62中检测到的与ngo0948结合的抗体比在fa1090中以及在菌株u08401和u08402中更强的抗体结合(图7b，蓝线)。然而，ngo1701的表面识别在淋病奈瑟菌fa1090中似乎比在f62和临床菌株(图7b，绿线)中更高，尽管免疫印迹没有检测到这种差异。这些结果证实了抗体对不同淋病奈瑟菌菌株的交叉反应性，并支持在细菌表面识别ngo0690、ngo0948和ngo1710。
[0434]
淋球菌假定蛋白的抗体具有杀菌作用。
[0435]
通过血清杀菌测定(sba)研究了抗体杀死淋病奈瑟菌的能力。对于所有菌株，仅通过nhs未检测到杀伤(未示出)(报告为t30/t0时的细菌存活率％)。来自用pbs/明矾(佐剂对照)免疫的小鼠的血清在1/10稀释度下诱导0-15％的杀伤，这被认为可以忽略不计(表7)。用抗ngo0416血清检测到任何测试的淋病奈瑟菌菌株均未检测到显著的细菌杀伤活性(表7)。抗ngo1215血清检测到显著的菌株依赖性杀伤活性，其仅以1/10的滴度杀死淋病奈瑟菌菌株u80401(杀伤滴度代表杀死50％或更多细菌的血清稀释度的倒数)。抗ngo1043血清对菌株f62、u80401和u80402的杀伤效价也为1/10，但也未能杀死淋病奈瑟菌菌株fa1090(表7)。抗ngo0948血清对淋病奈瑟菌f62、u80401和u80402菌株显示一致的1/10杀伤滴度，对fa1090显示出一致的1/5滴度。抗ngo0690和抗ngo1701血清显示了类似的结果，针对淋病奈瑟菌f62的滴度达到1/40(表7)。进一步研究这两种抗血清以确定血清组合是否增强了细菌杀伤。如图8c所示，抗ngo0690和抗ngo1701血清在1/40稀释度的组合增加了对淋病奈瑟菌菌株f62的杀灭至1/80滴度，这表明存在累加效应。
[0436]
表7：血清杀菌滴度。细菌杀灭百分比(t30/t0时的cfu)和血清稀释度(括号内)
[0437][0438]
实验结果的汇总
[0439]
使用为抗原发现而设计的定制化高通量计算机管道，被称为候选抗原选择策略(cass)，在天然人黏膜淋球菌感染期间挖掘和表达了600多种淋球菌假定蛋白，以确定新的疫苗靶点。cass建立在与生物信息学相结合的反向疫苗学方法之上，并分为2个发现阶段(dp)，最终产生了36个假定蛋白候选者库。这些候选者的主要属性之一是在男性和女性自然感染期间稳定和持续的表达，以及免疫原性和膜表面暴露等传统属性。
[0440]
根据淋球菌转录组研究的结果，在男性和女性样本中表达低于50rpkm截止水平的假定蛋白被排除在外，因为它们潜在的稀缺表达可能不仅会影响体内抗体识别，而且在基于体外的平台中测试免疫应答时也可能不足。然而，不排除当免疫应答被疫苗接种强制时，此组中的蛋白质仍将充当免疫抗原。另外，在rpkm《50下表达的基因组涵盖假定蛋白，所述假定蛋白在男性和女性受试者的天然黏膜感染期间以不同的方式受到调节；例如，男性数据集中rpkm《50和女性数据集中》50表示的那些，并且反之亦然。此前有报道称，在天然人感染期间，抗菌素耐药性基因表达存在性别相关的变异性(49，50)。
[0441]
cass将重点放在发现通用候选疫苗上，起点是在男性和女性数据集中以rpkm》50表达的169种假定蛋白，并将候选蛋白缩小到36种假定蛋白，这是用于体外和体内测试的可管理的抗原数量。cass计算机模拟分析收敛于疫苗候选者的关键要求，如免疫原性和细菌细胞定位的预测。一旦消除了非免疫原性和胞质蛋白，就检查了剩余候选者的氨基酸序列保守性，旨在排除在人和小鼠中保守的蛋白质，以避免自身反应性抗原。这些对人造成了明显的问题，但小鼠的自身反应性也对临床前疫苗研究不利。另外，与大肠杆菌具有高度保守性的蛋白质也被排除在外，以避免对广泛的管家因素产生免疫力。在奈瑟菌中，抗原保护是一把双刃剑：这两种非常保守和高度可变的蛋白质都不能作为疫苗候选者，因为它们要么不能诱导强大的适应性和保护性免疫应答，要么不能防止异源菌株感染。blastp对ncbi中可用的淋病奈瑟菌蛋白质序列的氨基酸序列保守性分析表明，cass候选者存在于淋病奈瑟菌菌株数据库中，并且共享不同程度的保守性。
[0442]
考虑的下一个主要cass属性是抗原结构复杂性，基于此类假设，即限制重组蛋白表达和纯化的结构约束对于未来的可制造性来说是不可取的，并且候选者将仅限于临床前分析。实例是衣原体外膜蛋白momp，它是衣原体感染实验模型中最好的保护性抗原之一，但由于重折叠问题不适合重组生产(78)。具有高结构层次和跨膜结构域数量的蛋白质被排除在外，从而丰富了cass列表中具有低到中等结构约束的候选者。通过排除预测定位于内膜/胞质界面处的蛋白质和通过预测细胞定位、拓扑结构和分泌途径而分泌的蛋白质，进一步巩固了所述池。最佳疫苗候选者应进行表面表达，以便于获得中和抗体。然而，那些被预测为周质的也被包含在内，原因有两个：1)预测不是100％准确，以及2)周质蛋白包含在外膜
囊泡(omv)中，它们都是由细菌自然释放或在基于omv的疫苗，如脑膜炎球菌疫苗这是非常相关的，因为最近观察到在接种疫苗的受试者和动物模型中诱导了对淋病奈瑟菌的部分交叉反应性免疫，这可能归因于保守和交叉反应性抗原(34-39)。出于同样的原因，可以考虑预测蛋白质与内膜但面向周质的缔合。最终的cass池由36种假定蛋白组成，其中16种是完全假定的，20种与其它细菌蛋白具有某种保守的结构域和基序同源性。
[0443]
从cass池中选择六种假定蛋白用于免疫学表征。这六个基因被分配到淋病奈瑟菌核心基因组中，所述基因组在pubmlst数据库中的全球广泛的淋病奈瑟菌菌株群体中定义，所述数据库可从万维网《pubmlst.org/neisseria/》(64)获得，所述数据库包含实验室适应菌株和临床菌株。对等位基因分布的分析表明，ngo0948和ngo1043是最大可变候选者，并且ngo0416在整个淋病奈瑟菌群体(超过4000个菌株)中最保守，携带此基因的6个等位基因中没有非同义突变。这6个候选者的氨基酸序列在ncbi数据库中可用的淋病奈瑟菌菌株中也显示出保守性，表明在广泛的淋病奈瑟菌菌株中具有识别和交叉反应的潜力。虽然交叉反应性对于对病原性奈瑟菌的“普遍”免疫可能是可取的，但对共生奈瑟菌可能不太期望。例如，早期鼻咽部的乳糖发酵奈瑟菌定植被认为有助于诱导对脑膜炎奈瑟菌的天然免疫并影响脑膜炎球菌的携带(79)。在受到抗淋球菌免疫干扰的情况下，这些天然免疫应答可能会减弱。通过检查pubmlst数据库中存在的乳糖发酵奈瑟菌中假定蛋白基因库，候选者之间没有等位基因重叠，并且乳糖发酵奈瑟菌中不存在ngo0416基因。此外，乳糖发酵奈瑟菌中六个候选者的氨基酸序列显示出与相应的淋病奈瑟菌蛋白的序列同一性有限，这表明对共生生物不太可能有强烈的应答。
[0444]
经考虑淋病奈瑟菌的第一基因共表达网络利用从实验研究中获得的几个淋球菌转录组数据集，这些数据集检查在包含粘膜感染期间在内的各种条件下生长的淋球菌。在此类网络中，转录物或蛋白质被定义为节点，并且这些通过共丰度或共表达水平连接，指示为边缘。对淋球菌基因表达网络的询问表明，ngo0690和ngo0948具有较高的中心性得分。中心性已被用作衡量生物系统中基因重要性的指标，包含人病原体或癌症(80-83)。研究表明，网络中更中心的基因对细菌生长、新陈代谢和感染更重要，这为选择ngo0690和ngo0948作为潜在候选者提供了另外的理由。对中心性和边缘的分析还可以基于功能富集推断将给定基因放置到定义的基因模块中。因此，对网络的询问可以通过被称为关联内疚(guilt-by-association，gba)的过程帮助假定蛋白的功能分配，这种方法已与其它细菌物种一起使用，以基于未知基因与网络中特征良好的基因的边缘预测其功能(84)。这个复杂的过程可以为表征36种假定蛋白的功能提供背景，在未来的研究中没有产生缺失突变体。
[0445]
尽管结构信息有限或没有结构信息的蛋白质的重组表达和正确折叠存在挑战，但纯化的淋球菌抗原能够在小鼠中引发强烈的igg应答；免疫原性最低的候选者是ngo1043。使用明矾作为佐剂进行免疫，并且因此，观察到th2偏态免疫应答，其中igg1高、igg2a低且igg1/igg2a比率》1，但ngo1701除外(igg1/igg2a比率为0.86)。这也反映在血清细胞因子水平对具有较高ifn-γ、il-6和tnf-α的ngo1701和ngo0416以及对ngo0690(较高il-6)的反应。这些结果表明，尽管所有抗原都与相同的佐剂一起使用，但不同的抗原对小鼠的炎症应答具有本质上不同的影响。th1型免疫应答，对促进细胞介导的免疫和抗体类别转换为igg2a很重要(对补体结合和细菌杀伤很重要(85))(86，87)，在淋球菌小鼠感染模型中特别
of vaginal colonization of mice by neisseria gonorrhoeae.)《传染病杂志(j infect dis.)》2000；182(3):848-55。
[0461]
11.islam ea、shaik-dasthagirisaheb y、kaushic c、wetzler lm、gray-owen sd.生殖周期是小鼠淋球菌性盆腔炎的病原性决定因素(the reproductive cycle is a pathogenic determinant during gonococcal pelvic inflammatory disease in mice.)《粘膜免疫学(mucosal immunol)》2015。
[0462]
12.francis ip、islam ea、gower ac、shaik-dasthagirisaheb yb、gray-owen sd、wetzler lm.鼠宿主对淋病奈瑟菌上生殖道感染的应答揭示了共同的转录特征，以及在生殖周期阶段之间变化的不同炎症应答(murine host response to neisseria gonorrhoeae upper genital tract infection reveals a common transcriptional signature,plus distinct inflammatory responses that vary between reproductive cycle phases.)《bmc基因组学(bmc genomics.)》2018；19(1):627.epub2018/08/24.doi:10.1186/s12864-018-5000-7.pubmed pmid:30134832；pmcid:pmc6106831。
[0463]
13.hobbs mm、sparling pf、cohen ms、shafer wm、deal cd、jerse ae.男性志愿者的实验性淋球菌感染：淋病奈瑟菌fa1090和ms11mkc菌株的累积经验(experimental gonococcal infection in male volunteers:cumulative experience with neisseria gonorrhoeae strains fa1090 and ms11mkc.)《微生物学前沿》2011；2:123.epub 2011/07/08.doi:10.3389/fmicb.2011.00123.pubmed pmid:21734909；pmcid:pmc3119411。
[0464]
14.jerse ae、cohen ms、drown pm、whicker lg、isbey sf、seifert hs、cannon jg.在男性实验性尿道感染期间表达多种淋球菌混浊蛋白(multiple gonococcal opacity proteins are expressed during experimental urethral infection in the male.)《实验医学杂志(j exp med.)》1994；179:911-20。
[0465]
15.seifert hs、wright cj、jerse ae、cohen ms、cannon jg.在实验性人感染期间会产生多种淋球菌菌毛蛋白抗原变体(multiple gonococcal pilin antigenic variants are produced during experimental human infections.)《临床研究杂志(j clin invest)》1994；93:2744-9。
[0466]
16.lenz jd、dillard jp.人类输卵管上行感染淋病奈瑟菌的发病机制和宿主防御(pathogenesis of neisseria gonorrhoeae and the host defense in ascending infections of human fallopian tube.)《免疫学前沿》2018；9:2710.epub 2018/12/14.doi:10.3389/fimmu.2018.02710.pubmed pmid:30524442；pmcid:pmc6258741。
[0467]
17.rosenqvist e、musacchio a、aase a、hoiby ea、namork e、kolberg j、wedege e、delvig a、dalseg r、michaelsen te、tommassen j.人和鼠抗体针对脑膜炎奈瑟菌4类外膜蛋白(rmp)的功能活性和表位特异性(functional activities and epitope specificity of human and murine antibodies against the class 4outer membrane protein(rmp)of neisseria meningitidis.)《传染与免疫(infect immun.)》1999；67(3):1267-76。
[0468]
18.tan lk、carlone gm、borrow r.脑膜炎奈瑟菌疫苗开发进展(advances in the development of vaccines against neisseria meningitidis.)《新英格兰医学杂志(n engl j med.)》2010；362(16):1511-20.epub 2010/04/23.doi:10.1056/
nejmra0906357.pubmed pmid:20410516。
[0469]
19.siegel m、olsen d、critchlow c、buchanan tm.淋球菌菌毛：人体安全性和免疫原性以及体外抗体功能(gonococcal pili:safety and immunogenicity in humans and antibody function in vitro.)《传染病杂志》1982；145(3):300-10。
[0470]
20.zhu w、thomas ce、chen cj、van dam cn、johnston re、davis nl、sparling pf.对作为外膜囊泡、重组蛋白或委内瑞拉马脑炎病毒复制子颗粒递送的淋球菌porb的免疫应答的比较(comparison of immune responses to gonococcal porb delivered as outer membrane vesicles,recombinant protein,or venezuelan equine encephalitis virus replicon particles.)《传染与免疫》2005；73(11):7558-68。
[0471]
21.wetzler lm、blake ms、gotschlich ec.淋病奈瑟菌的蛋白i(por)作为免疫原：脂质体、蛋白体和缺乏阻断抗体(protein i(por)of neisseria gonorrhoeae as an immunogen:liposomes,proteosomes and the lack of blocking antibodies.)《美国医师协会议事录(transactions of the american association of physicians.)》102版马里兰州巴尔的摩：韦弗利出版社(baltimore,md:waverly press)；1989第78-90页。
[0472]
22.fegan je、calmettes c、islam ea、ahn sk、chaudhuri s、yu rh、gray-owen sd、moraes tf、schryvers ab.杂化转铁蛋白结合蛋白抗原在防止病原性奈瑟菌物种中的效用(utility of hybrid transferrin binding protein antigens for protection against pathogenic neisseria species.)《免疫学前沿》2019；10:247.epub 2019/03/07.doi:10.3389/fimmu.2019.00247.pubmed pmid:30837995；pmcid:pmc6389628。
[0473]
23.price ga、masri hp、hollander am、russell mw、cornelissen cn.淋球菌转铁蛋白结合蛋白嵌合体在小鼠中诱导杀菌和生长抑制抗体(gonococcal transferrin binding protein chimeras induce bactericidal and growth inhibitory antibodies in mice.)《疫苗(vaccine.)》2007；25(41):7247-60。
[0474]
24.wang s、xue j、lu p、ni c、cheng h、han r、van der veen s.淋球菌mtre及其表面表达的环2具有免疫原性并引发杀菌抗体(gonococcal mtre and its surface-expressed loop 2are immunogenic and elicit bactericidal antibodies.)《传染病杂志》2018；77(3):191-204.epub2018/06/15.doi:10.1016/j.jinf.2018.06.001.pubmed pmid:29902495。
[0475]
25.lee eh、shafer wm.farab编码的外排泵介导淋球菌对长链抗菌脂肪酸的抗性(the farab-encoded efflux pump mediates resistance of gonococci to long-chained antibacterial fatty acids.)《分子微生物学(mol microbiol.)》1999；33(4):839-45.epub 1999/08/14.pubmed pmid:10447892。
[0476]
26.semchenko ea、day cj、seib kl.淋病奈瑟菌的metq是引发杀菌和功能性阻断抗体的表面表达的抗原(metq of neisseria gonorrhoeae is a surface-expressed antigen that elicits bactericidal and functional blocking antibodies.)《传染与免疫》2017；85(2)。
[0477]
27.jen fe、semchenko ea、day cj、seib kl、jennings mp.淋病奈瑟菌甲硫氨酸亚砜还原酶(msra/b)是一种表面暴露的免疫原性疫苗候选者(the neisseria gonorrhoeae methionine sulfoxide reductase(msra/b)is a surface exposed,
immunogenic,vaccine candidate.)《免疫学前沿》2019；10:137.epub 2019/02/23.doi:10.3389/fimmu.2019.00137.pubmed pmid:30787927；pmcid:pmc6372556。
[0478]
28.zielke ra、wierzbicki ih、baarda bi、gafken pr、soge oo、holmes kk、jerse ae、unemo m、sikora ae.蛋白质组学驱动的抗原发现用于开发针对淋病的疫苗(proteomics-driven antigen discovery for development of vaccines against gonorrhea.)《分子细胞蛋白质组学(mol cell proteomics.)》2016；15(7):2338-55.epub 2016/05/04.doi:10.1074/mcp.m116.058800.pubmed pmid:27141096；pmcid:pmc4937508。
[0479]
29.almonacid-mendoza hl、humbert mv、dijokaite a、cleary dw、soo y、hung mc、orr cm、machelett mm、tews i、christodoulides m.重组淋病奈瑟菌粘附素复合蛋白(rng-acp)的结构和对淋球菌具有杀菌活性的鼠抗体的产生(structure of the recombinant neisseria gonorrhoeae adhesin complex protein(rng-acp)and generation of murine antibodies with bactericidal activity against gonococci.)《msphere杂志》2018；3(5).epub 2018/10/12.doi:10.1128/msphere.00331-18.pubmed pmid:30305317；pmcid:pmc6180225。
[0480]
30.ngampasutadol j、rice pa、walsh mt、gulati s.模拟淋病奈瑟菌寡糖表位的肽疫苗候选者的表征以及由此产生的免疫应答和功能(characterization of a peptide vaccine candidate mimicking an oligosaccharide epitope of neisseria gonorrhoeae and resultant immune responses and function.)《疫苗》2006；24(2):157-70。
[0481]
31.gulati s、zheng b、reed gw、su x、cox ad、st mf、stupak j、lewis la、ram s、rice pa.针对糖类表位的免疫加速了实验性淋球菌感染的清除(immunization against asaccharide epitope accelerates clearance of experimental gonococcal infection.)《公共科学图书馆
·
病原学(plos pathog.)》2013；9(8):e1003559。
[0482]
32.ram s、ngampasutadol j、cox ad、blom am、lewis la、st michael f、stupak j、gulati s、rice pa.淋病奈瑟菌脂寡糖上的庚糖i聚糖取代影响c4b结合蛋白结合和血清抗性(heptose i glycan substitutions on neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharide influence c4b-binding protein binding and serum resistance.)《传染与免疫》2007；75(8):4071-81.epub2007/05/29.doi:10.1128/iai.01109-06.pubmed pmid:17526744；pmcid:pmc1952009。
[0483]
33.gulati s、shaughnessy j、ram s、rice pa.针对淋球菌疫苗的脂寡糖(los)(targeting lipooligosaccharide(los)for a gonococcal vaccine.)《免疫学前沿》2019；10:321.epub2019/03/16.doi:10.3389/fimmu.2019.00321.pubmed pmid:30873172；pmcid:pmc6400993。
[0484]
34.gorringe ar、pajon r.bexsero：一种用于预防脑膜炎球菌病的多组分疫苗(bexsero:a multicomponent vaccine for prevention of meningococcal disease.)《人疫苗免疫治疗学(hum vaccin immunother)》2012；8(2):174-83.epub 2012/03/20.doi:10.4161/hv.18500.pubmed pmid:22426368。
[0485]
35.paynter j、goodyear-smith f、morgan j、saxton p、black s、petousis-harris h.b组外膜囊泡脑膜炎球菌疫苗预防新西兰淋病住院的有效性：一项回顾性队列研
究(effectiveness of a group b outer membrane vesicle meningococcal vaccine in preventing hospitalization from gonorrhea in new zealand:a retrospective cohort study.)《疫苗》(巴塞尔),2019；7(1).epub2019/01/10.doi:10.3390/vaccines7010005.pubmed pmid:30621260。
[0486]
36.semchenko ea、tan a、borrow r、seib kl.血清群b脑膜炎球菌疫苗bexsero引发针对淋病奈瑟菌的抗体(the serogroup b meningococcal vaccine bexsero elicits antibodies to neisseria gonorrhoeae.)《临床传染病杂志(clin infect dis.)》2018.epub 2018/12/15.doi:10.1093/cid/ciy1061.pubmed pmid:30551148。
[0487]
37.petousis-harris h、paynter j、morgan j、saxton p、mcardle b、goodyear-smith f、black s.b组外膜囊泡脑膜炎球菌疫苗在新西兰对抗淋病的有效性：一项回顾性病例对照研究(effectiveness of a group b outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in new zealand:a retrospective case-control study.)《柳叶刀(lancet.)》2017；390(10102):1603-10.epub 2017/07/15.doi:10.1016/s0140-6736(17)31449-6.pubmed pmid:28705462.
[0488]
38.ochoa-azze rf.由va-mengoc-bc(r)疫苗诱导的交叉保护(cross-protection induced by va-mengoc-bc(r)vaccine.)《人疫苗免疫治疗学(hum vaccin immunother)》2018；14(5):1064-8.epub 2018/02/09.doi:10.1080/21645515.2018.1438028.pubmed pmid:29420119。
[0489]
39.beernink pt、ispasanie e、lewis la、ram s、moe gr、granoff dm.具有减毒内毒素和过表达h因子结合蛋白的脑膜炎球菌天然外膜囊泡疫苗引发淋球菌杀菌抗体(ameningococcal native outer membrane vesicle vaccine with attenuated endotoxin and overexpressed factor h binding protein elicits gonococcal bactericidal antibodies.)《传染病杂志》2019；219(7):1130-7.epub 2018/10/23.doi:10.1093/infdis/jiy609.pubmed pmid:30346576；pmcid:pmc6420169。
[0490]
40.pizza m、scarlato v、masignani v、giuliani mm、arico b、comanducci m、jenningsgt、baldi l、bartolini e、capecchi b、galeotti cl、luzzi e、manetti r、marchetti e、mora m、nuti s、ratti g、santini l、savino s、scarselli m、storni e、zuo p、broeker m、hundt e、knapp b、blair e、mason t、tettelin h、hood dw、jeffries ac、saunders nj、granoff dm、venter jc、moxon er、grandi g、rappuoli r.通过全基因组测序鉴定针对血清群b脑膜炎球菌的疫苗候选者[见评论](identification of vaccine candidates against serogroup b meningococcus by whole-genome sequencing[see comments].)《科学(science.)》2000；287(5459):1816-20。
[0491]
41.serruto d、bottomley mj、ram s、giuliani mm、rappuoli r.针对脑膜炎球菌血清群b、4cmenb的新型多组分疫苗：抗原的免疫学、功能和结构表征(the new multicomponent vaccine against meningococcal serogroup b,4cmenb:immunological,functional and structural characterization of the antigens.)《疫苗》2012；30增刊2:b87-b97。
[0492]
42.hsu ca、lin wr、li jc、liu yl、tseng yt、chang cm、lee ys、yang cy.假定蛋白nmb1468的免疫蛋白质组学鉴定是一种在脑膜炎奈瑟菌中普遍存在的具有疫苗潜力的新
型脂蛋白(immunoproteomic identification of the hypothetical protein nmb1468 as a novel lipoprotein ubiquitous in neisseria meningitidis with vaccine potential.)《蛋白质组学(proteomics.)》2008；8(10):2115-25。
[0493]
43.williams jn、weynants v、poolman jt、heckels je、christodoulides m.人类对实验性脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡疫苗的免疫应答的免疫蛋白质组学分析确定了潜在的交叉反应抗原(immuno-proteomic analysis of human immune responses to experimental neisseria meningitidis outer membrane vesicle vaccines identifies potential cross-reactive antigens.)《疫苗》2014；32(11):1280-6。
[0494]
44.jain r、sonkar sc、chaudhry u、bala m、saluja d.用于从淋病奈瑟菌中鉴定潜在通用疫苗候选者(puvc)的计算机分层方法(in-silico hierarchical approach for the identification of potential universal vaccine candidates(puvcs)from neisseria gonorrhoeae.)《理论生物学杂志(j theor biol.)》2016；410:36-43。
[0495]
45.connor do、zantow j、hust m、bier ff、von nickisch-rosenegk m.通过噬菌体展示鉴定淋病奈瑟菌的新型免疫原性蛋白(identification of novel immunogenic proteins of neisseria gonorrhoeae by phage display.)《公共科学图书馆
·
综合》2016；11(2):e0148986。
[0496]
46.baarda bi、martinez fg、sikora ae.用于淋病疫苗的蛋白质组学、生物信息学和结构功能抗原挖掘(proteomics,bioinformatics and structure-function antigen mining for gonorrhea vaccines.)《免疫学前沿》2018；9:2793.epub 2018/12/20.doi:10.3389/fimmu.2018.02793.pubmed pmid:30564232；pmcid:pmc6288298。
[0497]
47.el-rami fe、zielke ra、wi t、sikora ae、unemo m.2016年世卫组织淋病奈瑟菌参考菌株调查疫苗候选者和抗菌素耐药性决定因素的定量蛋白质组学(quantitative proteomics of the 2016who neisseria gonorrhoeae reference strains surveys vaccine candidates and antimicrobial resistance determinants.)《分子细胞蛋白质组学》2019；18(1):127-50.epub2018/10/26.doi:10.1074/mcp.ra118.001125.pubmed pmid:30352803；pmcid:pmc6317477。
[0498]
48.altindis e、cozzi r、di pb、necchi f、mishra rp、fontana mr、soriani m、bagnoli f、maione d、grandi g、liberatori s.保护组分析：一种用于细菌疫苗候选者发现的新的选择性生物信息学工具(protectome analysis:a new selective bioinformatics tool for bacterial vaccine candidate discovery.)《分子细胞蛋白质组学》2015；14(2):418-29。
[0499]
49.mcclure r、nudel k、massari p、tjaden b、su x、rice pa、genco ca.女性下生殖道感染期间的淋球菌转录组(the gonococcal transcriptome during infection of the lower genital tract in women.)《公共科学图书馆
·
综合》2015；10(8):e0133982。
[0500]
50.nudel k、mcclure r、moreau m、briars e、abrams aj、tjaden b、su xh、trees d、rice pa、massari p、genco ca.天然感染期间淋病奈瑟菌的转录组分析揭示了男性与女性之间抗生素耐药性决定因素的差异表达(transcriptome analysis of neisseria gonorrhoeae during natural infection reveals differential expression of antibiotic resistance determinants between men and women.)《msphere杂志》2018；3
(3).epub 2018/06/29.doi:10.1128/mspheredirect.00312-18.pubmed pmid:29950382；pmcid:pmc6021601。
[0501]
51.doytchinova ia、flower dr.vaxijen：预测保护性抗原、肿瘤抗原和亚单位疫苗的服务器(vaxijen:a server for prediction of protective antigens,tumour antigens and subunit vaccines.)《bmc生物信息学》2007；8:4。
[0502]
52.yu ny、wagner jr、laird mr、melli g、rey s、lo r、dao p、sahinalp sc、ester m、foster lj、brinkman fs.psortb 3.0：改进的蛋白质亚细胞定位预测，具有精确的定位子类别和所有原核生物的预测能力(psortb 3.0:improved protein subcellular localization prediction with refined localization subcategories and predictive capabilities for all prokaryotes.)《生物信息学》2010；26(13):1608-15.epub 2010/05/18.doi:10.1093/bioinformatics/btq249.pubmed pmid:20472543；pmcid:pmc2887053。
[0503]
53.yachdav g、kloppmann e、kajan l、hecht m、goldberg t、hamp t、honigschmid p、schafferhans a、roos m、bernhofer m、richter l、ashkenazy h、punta m、schlessinger a、bromberg y、schneider r、vriend g、sander c、ben-tal n、rost b.predictprotein——一种用于在线预测蛋白质结构和功能特征的开放资源(predictprotein
‑‑
an open resource for online prediction of protein structural and functional features.)《核酸研究(nucleic acids res.)》2014；42(web服务器问题):w337-43.epub 2014/05/07.doi:10.1093/nar/gku366.pubmed pmid:24799431；pmcid:pmc4086098.
[0504]
54.shen hb、chou kc.gneg-mploc：一种自上而下的策略，用于提高预测革兰氏阴性细菌蛋白亚细胞定位的质量(gneg-mploc:a top-down strategy to enhance the quality of predicting subcellular localization of gram-negative bacterial proteins.)《理论生物学杂志(jtheor biol.)》2010；264(2):326-33.epub 2010/01/23.doi:10.1016/j.jtbi.2010.01.018.pubmed pmid:20093124。
[0505]
55.he y、racz r、sayers s、lin y、todd t、hur j、li x、patel m、zhao b、chung m、ostrow j、sylora a、dungarani p、ulysse g、kochhar k、vidri b、strait k、jourdian gw、xiang z.基于网络的violin疫苗数据库和分析系统的更新(updates on the web-based violin vaccine database and analysis system.)《核酸研究》2014；42(数据库问题):d1124-32.epub 2013/11/22.doi:10.1093/nar/gkt1133.pubmed pmid:24259431；pmcid:pmc3964998。
[0506]
56.altschul sf、gish w、miller w、myers ew、lipman dj.基本的局部比对搜索工具(basic local alignment search tool.)《分子生物学期刊(j mol biol)》1990；215(3):403-10。
[0507]
57.krogh a、larsson b、von hg、sonnhammer el.用隐马尔可夫模型预测跨膜蛋白拓扑：应用于完整基因组(predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model:application to complete genomes.)《分子生物学期刊》2001；305(3):567-80。
[0508]
58.kall l、krogh a、sonnhammer el.结合跨膜拓扑结构和信号肽预测的优
势——phobius网络服务器(advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction
‑‑
the phobius web server.)《核酸研究》2007；35(web服务器问题):w429-32.epub2007/05/08.doi:10.1093/nar/gkm256.pubmed pmid:17483518；pmcid:pmc1933244。
[0509]
59.almagro armenteros jj、tsirigos kd、sonderby ck、petersen tn、winther o、brunak s、von heijne g、nielsen h.signalp 5.0使用深度神经网络改进信号肽预测(signalp 5.0improves signal peptide predictions using deep neural networks.)《(自然生物技术(nat biotechnol.)》2019；37(4):420-3.epub 2019/02/20.doi:10.1038/s41587-019-0036-z.pubmed pmid:30778233。
[0510]
60.bendtsen jd、jensen lj、blom n、von heijne g、brunak s.基于特征的非经典和无前导蛋白分泌预测(feature-based prediction of non-classical and leaderless protein secretion.)《蛋白质工程、设计和选择(protein eng des sel.)》2004；17(4):349-56.epub 2004/04/30.doi:10.1093/protein/gzh037.pubmed pmid:15115854。
[0511]
61.juncker as、willenbrock h、von heijne g、brunak s、nielsen h、krogh a.革兰氏阴性菌中脂蛋白信号肽的预测(prediction of lipoprotein signal peptides in gram-negative bacteria.)《蛋白质科学(protein sci.)》2003；12(8):1652-62.epub 2003/07/24.doi:10.1110/ps.0303703.pubmed pmid:12876315；pmcid:pmc2323952。
[0512]
62.uniprot c.uniprot：全球蛋白质知识中心(uniprot:a worldwide hub of protein knowledge.)《核酸研究》2019；47(d1):d506-d15.epub 2018/11/06.doi:10.1093/nar/gky1049.pubmed pmid:30395287；pmcid:pmc6323992。
[0513]
63.el-gebali s、mistry j、bateman a、eddy sr、luciani a、potter sc、qureshi m、richardson lj、salazar ga、smart a、sonnhammer ell、hirsh l、paladin l、piovesan d、tosatto sce、finn rd.2019年pfam蛋白家族数据库(the pfam protein families database in 2019.)《核酸研究》2019；47(d1):d427-d32.epub 2018/10/26.doi:10.1093/nar/gky995.pubmed pmid:30357350；pmcid:pmc6324024。
[0514]
64.jolley ka、maiden mc.bigsdb：对群体水平下的细菌基因组变异的可扩展分析(bigsdb:scalable analysis of bacterial genome variation at the population level.)《bmc生物信息学》2010；11:595.epub 2010/12/15.doi:10.1186/1471-2105-11-595.pubmed pmid:21143983；pmcid:pmc3004885。
[0515]
65.liu x、wetzler lm、massari p.来自共生乳糖奈瑟球菌的porb孔蛋白诱导小鼠对卵清蛋白的th1和th2免疫应答并且是一种潜在的免疫佐剂(the porb porin from commensal neisseria lactamica induces th1 and th2 immune responses to ovalbumin in mice and is a potential immune adjuvant.)《疫苗》2008；26(6):786-96。
[0516]
66.chen sc、yin yp、dai xq、unemo m、chen xs.全国首例淋病奈瑟菌头孢曲松耐药性及分子流行病学研究(first nationwide study regarding ceftriaxone resistance and molecular epidemiology of neisseria gonorrhoeae in china.)《抗菌剂与化疗杂志(j antimicrob chemother.)》2016；71(1):92-9。
[0517]
67.kirkcaldy rd、kidd s、weinstock hs、papp jr、bolan ga.美国淋病奈瑟菌耐药性趋势：淋球菌隔离监测项目(gisp)，2006年1月至2012年6月(trends in antimicrobial resistance in neisseria gonorrhoeae in the usa:the gonococcal isolate surveillance project(gisp))《性传播传染(sex transm infect.)》2013；89增刊4:iv5-10。
[0518]
68.andersen c、rak b,benz r.存在于大肠杆菌bgl操纵子中的负责β-葡萄糖苷的摄取和发酵的基因bglh编码碳水化合物特异性外膜孔蛋白(the gene bglh present in the bgl operon of escherichia coli,responsible for uptake and fermentation of beta-glucosides encodes for acarbohydrate-specific outer membrane porin.)《分子微生物学》1999；31(2):499-510.epub1999/02/23.pubmed pmid:10027967。
[0519]
69.delgado m、yero d、niebla o、gonzalez s、climent y、perez y、cobas k、caballero e、garcia d、pajon r.来自脑膜炎双球菌血清群b的脂蛋白nmb0928作为一种新型疫苗候选者(lipoprotein nmb0928 from neisseria meningitidis serogroup b as a novel vaccine candidate.)《疫苗》2007；25(50):8420-31.epub 2007/11/13.doi:10.1016/j.vaccine.2007.09.053.pubmed pmid:17996338。
[0520]
70.pajon r、yero d、niebla o、climent y、sardinas g、garcia d、perera y、llanes a、delgado m、cobas k、caballero e、taylor s、brookes c、gorringe a.通过对奈瑟菌基因组的系统分析鉴定新的脑膜炎球菌血清群b表面抗原(identification of new meningococcal serogroup b surface antigens through a systematic analysis of neisserial genomes.)《疫苗》2009；28(2):532-41。
[0521]
71.awanye am、chang cm、wheeler jx、chan h、marsay l、dold c、rollier cs、bird le、nettleship je、owens rj、pollard aj、derrick jp.来自荚膜b族脑膜炎奈瑟菌的蛋白质抗原的免疫原性分析(immunogenicity profiling of protein antigens from capsular group bneisseria meningitidis.)《科技报告(sci rep.)》2019；9(1):6843.epub 2019/05/03.doi:10.1038/s41598-019-43139-0.pubmed pmid:31048732。
[0522]
72.chu cl、yu yl、kung yc、liao py、liu kj、tseng yt、lin yc、hsieh ss、chong pc、yang cy.脑膜炎球菌脂蛋白ag473的免疫调节活性取决于由脂质和蛋白质部分组成的构象(the immunomodulatory activity of meningococcal lipoprotein ag473 depends on the conformation made up of the lipid and protein moieties.)《公共科学图书馆
·
综合》2012；7(7):e40873.epub 2012/07/31.doi:10.1371/journal.pone.0040873.pubmed pmid:22844415；pmcid:pmc3402496。
[0523]
73.ladomersky e、petris mj.细菌的铜耐受性和毒力(copper tolerance and virulence in bacteria.)《金属组学(metallomics.)》2015；7(6):957-64.epub 2015/02/06.doi:10.1039/c4mt00327f.pubmed pmid:25652326；pmcid:pmc4464932。
[0524]
74.gangaiah d、raterman el、wu h、fortney kr、gao h、liu y、jerse ae、spinola sm.在下生殖道感染的小鼠模型中，淋病奈瑟菌感染需要misr(cpxr)和miss(cpxa)两者(both misr(cpxr)and miss(cpxa)are required for neisseria gonorrhoeae infection in a murine model of lower genital tract infection.)《传染与免疫》2017；85(9).epub 2017/06/28.doi:10.1128/iai.00307-17.pubmed pmid:
28652307；pmcid:pmc5563589。
[0525]
75.yu c、genco ca.毛皮介导的病原性奈瑟菌全局调控回路(fur-mediated global regulatory circuits in pathogenic neisseria species.)《细菌学杂志(j bacteriol.)》2012；194(23):6372-81。
[0526]
76.quillin sj、hockenberry aj、jewett mc、seifert hs.暴露于亚致死水平的过氧化氢的淋病奈瑟菌会产生复杂的转录应答(neisseria gonorrhoeae exposed to sublethal levels of hydrogen peroxide mounts a complex transcriptional response.)《微系统(msystems)》2018；3(5).epub 2018/10/16.doi:10.1128/msystems.00156-18.pubmed pmid:30320218；pmcid:pmc6172773。
[0527]
77.velez acevedo rn、ronpirin c、kandler jl、shafer wm、cornelissen cn.鉴定控制淋病奈瑟菌中tbpba操纵子表达的调节元件(identification of regulatory elements that control expression of the tbpba operon in neisseria gonorrhoeae.)《细菌学杂志》2014；196(15):2762-74.epub 2014/05/20.doi:10.1128/jb.01693-14.pubmed pmid:24837286；pmcid:pmc4135677。
[0528]
78.madico g、gursky o、fairman j、massari p.新型重组momp衣原体抗原的结构和免疫学表征(structural and immunological characterization of novel recombinant momp-based chlamydial antigens.)《疫苗》(巴塞尔),2017；6(1)。
[0529]
79.deasy am、guccione e、dale ap、andrews n、evans cm、bennett js、bratcher hb、maiden mc、gorringe ar、read rc.鼻内接种共生乳糖奈瑟球菌抑制年轻人携带脑膜炎奈瑟菌：一项受控人类感染研究(nasal inoculation of the commensal neisseria lactamica inhibits carriage of neisseria meningitidis by young adults:a controlled human infection study.)《临床传染病杂志》2015；60(10):1512-20。
[0530]
80.mcdermott je、taylor rc、yoon h、heffron f.推断网络中的瓶颈和枢纽对于鼠伤寒沙门氏菌的毒力很重要(bottlenecks and hubs in inferred networks are important for virulence in salmonella typhimurium.)《计算生物学杂志(j comput biol.)》2009；16(2):169-80.epub2009/01/31.doi:10.1089/cmb.2008.04tt.pubmed pmid:19178137。
[0531]
81.mcdermott je、diamond dl、corley c、rasmussen al、katze mg、waters km.蛋白质共丰度网络的拓扑分析确定了对hcv感染和发病机制重要的新宿主靶标(topological analysis of protein co-abundance networks identifies novel host targets important for hcv infection and pathogenesis.)《bmc系统生物学(bmc syst biol.)》2012；6:28.epub 2012/05/02.doi:10.1186/1752-0509-6-28.pubmed pmid:22546282；pmcid:pmc3383540。
[0532]
82.song hs、mcclure rs、bernstein hc、overall cc、hill ea、beliaev as.对聚球藻pcc7002调控和代谢网络的计算机集成分析揭示了基因中心性与必要性之间的关系(integrated in silico analyses of regulatory and metabolic networks of synechococcus sp.pcc 7002reveal relationships between gene centrality and essentiality.)《生活(life)》(巴塞尔),2015；5(2):1127-40.epub 2015/04/01.doi:10.3390/life5021127.pubmed pmid:25826650；pmcid:pmc4500133。
the membrane with a bam！)《生物化学科学趋势(trends biochem sci.)》2016；41(10):872-82.epub 2016/07/28.doi:10.1016/j.tibs.2016.06.005.pubmed pmid:27450425；pmcid:pmc5420074。
[0542]
92.sikora ae、wierzbicki ih、zielke ra、ryner rf、korotkov kv、buchanan sk、noinaj n.对bamd和bame在淋病奈瑟菌β桶装配机器中的作用的结构和功能见解(structural and functional insights into the role of bamd and bame within the beta-barrel assembly machinery in neisseria gonorrhoeae.)《生物化学杂志(j biol chem.)》2018；293(4):1106-19.epub2017/12/13.doi:10.1074/jbc.ra117.000437.pubmed pmid:29229778；pmcid:pmc5787791。
[0543]
实例2：人类血清对ngo0690、ngo0948和ngo1701的免疫识别。
[0544]
重组纯化抗原ngo0690、ngo0948和ngo1701的免疫识别通过来自淋病奈瑟菌天然感染的恢复期女性受试者的超免疫人类血清进行验证，这些受试者发展为pid或dgi。与简单的感染相比，这些受试者通常会产生强烈的抗淋球菌抗体应答{参见例如，hedges等人,《传染病杂志》1998年9月；178(3):742-51.doi:10.1086/515372；以及hook等人,《临床微生物学(j clin microbiol.)》1997年8月；35(8):2129
–
2132，所述文献通过引用整体并入本文}。与纯化的淋病奈瑟菌f62 pib孔蛋白(已知的免疫反应性抗原)类似，抗原通过elisa一致地被识别(图10a-10c)。也就是说，感染淋病奈瑟菌的人患者产生了与本文鉴定的ngo0690、ngo0948和ngo1701抗原结合的抗体。这表明这些抗原不仅在人类感染不同的、天然存在的病原体菌株时表达，而且它们在人类(体内)感染中显然具有抗原性。
[0545]
实例3：用于结合抗原(ngo0690/ngo1701和ngo0690/ngo0948/ngo1701)的抗体水平。
[0546]
用纯化的重组ngo0690、ngo0948和ngo1701作为抗原以以下组合对雌性balb/c小鼠进行皮下免疫：1)ngo0690/ngo1701一起和2)ngo0690/ngo0948/ngo1701一起，使用明矾作为佐剂，如先前所描述的。通过elisa测试合并的免疫前血清和免疫血清的抗原特异性抗体的存在和量，并与用单个抗原免疫的小鼠的血清中的那些进行比较。来自单独用佐剂免疫的小鼠的血清和免疫前血清作为对照；如先前所描述的，针对福尔马林固定的淋病奈瑟菌菌株f62测量总igg，并表示为μg/ml
±
sem。与单独抗原相比，组合抗原诱导了抗原特异性igg的强烈产生，所有这些抗原均高于免疫前血清和佐剂血清对照。图11示出了白条(仅佐剂)和灰条(免疫前血清)中的对照血清；抗ngo0690血清(虚线)、抗ngo1701血清(细条纹)和抗ngo0948血清(水平条纹)、抗ngo0690/ngo1701血清(方格虚线)和抗ngo0690/ngo0948/ngo1701血清(粗条纹)。
[0547]
实例4：抗ngo0690/ngo1701和ngo0690/ngo0948/ngo1701的血清杀菌活性。
[0548]
抗体杀死来自分别用ngo0690、ngo0948和ngo1701免疫的小鼠的血清，以及抗ngo0690 抗ngo1701组合的淋病奈瑟菌的能力显示在实例1中(图8a-8c)和zhu等人2017,《疫苗》，所述文献通过引用整体并入本文。使用血清杀菌活性(sba)测定从组合抗原免疫评估小鼠血清对细菌的杀伤，并报告存活率百分比作为杀伤的倒数。图12a示出了暴露于来自用指定稀释度的ngo0690/ngo1701免疫的小鼠的血清的细菌存活率％(方格条)。杀灭滴度与抗ngo0690 抗ngo1701血清的杀灭滴度类似(大约1/80，参见图8c)。图12b示出了暴露于抗ngo0948个体抗原血清(灰色条)和相应的杀伤滴度(1/10，也参见表2)后细菌存活率％。
图12c示出了提高至ngo0690/ngo0948/ngo1701组合的血清的存活率％和杀伤滴度(粗条纹条)，其高于单个抗原抗血清和2抗原组合抗血清。来自用pbs/明矾(佐剂对照，图12a-12c，白条)和免疫前血清(未示出)免疫的小鼠的血清对细菌的杀伤仍然可以忽略不计。
[0549]
使用已建立的方法，通过用卡那霉素(kan)抗性基因对编码区进行等位基因置换并在卡那霉素板上进行选择，构建了ngo0690或ngo1701缺失的淋病奈瑟菌f62突变体。与wt生物体相比，免疫识别淋病奈瑟菌f62 ngo0690缺失突变体(δ0690)被纯化的ngo0690提高的小鼠免疫血清被废除，并且对淋病奈瑟菌f62 ngo1701缺失突变体(δ1701)的识别大大降低，如通过小鼠混合免疫血清中的全细胞elisa和总igg定量确定的。
[0550]
至于抗体识别，提高到ngo0690和ngo1701的血清对两种淋病奈瑟菌f62缺失突变体的杀菌活性也被取消，证实了抗原特异性抗体功能。
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疫苗组合物和选择抗原的方法

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