可来源于血小板浓缩液的生物活性组合物及其制备和使用方法与流程

可来源于血小板浓缩液的生物活性组合物及其制备和使用方法
1.本技术是申请号为201480056186.0，申请日为2014年8月27日，发明名称为“可来源于血小板浓缩液的生物活性组合物及其制备和使用方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明一般涉及来源于动物血小板产品的生物活性物质及其制备和使用方法的领域。


背景技术：

3.用于治疗处理的细胞或含有细胞的组合物的施用正在成为日益流行的治疗方式。这样的治疗可以包括，例如，施用具有分化成包括例如骨、脂肪、软骨和肌肉的间叶细胞谱系细胞的潜能的间充质干细胞(msc)。
4.为了获得治疗量的用于移植的细胞，经常需要从原始群体扩增细胞群体。用于扩增细胞群体的培养基为细胞代谢、生长和增殖提供必需营养物。经常使用胎牛血清(fbs)作为促进群体扩增的补充剂。因为fbs的低含量抗体，因为fbs包含刺激细胞生长和增殖的许多生长因子以及因为fbs的制造相对便宜，所以fbs一直是优选的补充剂。然而，fbs具有公认的缺点，包括病原体的传播风险，如牛海绵状脑病。
5.人血小板裂解物(hpl)已作为fbs的潜在的、非异种替代品出现。hpl来源于已知含有多种生长因子的血小板。除了生长因子外，目前的hpl分离技术通常还产生保留了高浓度的纤维蛋白原(一种参与凝块形成的糖蛋白)的组合物。因为它们的纤维蛋白原含量和形成凝块的倾向，目前的商业hpl组合物经常与一种或多种抗凝添加剂，典型地肝素一起使用。hpl中的抗凝添加剂增加了hpl生产和/或使用的成本，并且在肝素的生物活性是有害的情况下，可能会存在问题。此外，虽然已经提出了多种用于生产hpl的方法，但是实现hpl产品的目标组成分布或生物活性的尝试经常导致工艺复杂性和/或密集设备要求。作为fbs的替代品的hpl的广泛采用将需要经济上可行的方法，但是该方法产生所期望的且有效的组合物。
6.鉴于这样的背景，需要基本上不含纤维蛋白原，保留了对细胞增殖有益的生长因子并可以容易地且经济地制造的人血小板裂解物组合物。


技术实现要素：

7.在本发明的某些方面，已经发现，从血源性血小板浓缩液(优选人)中可以独特地处理有利的血源性血小板浓缩液的生物活性级分。生物活性级分可以具有存在于起始浓缩液中的生长因子和/或其它物质的新的组成分布，并且处理方法可以涉及凝结和分离浓缩液级分的新技术和/或新的用来澄清来源于浓缩液的液体级分的深层过滤操作。
8.在一个方面，用于处理血小板裂解物组合物的方法包括如下步骤：裂解含有血小板和血浆的人血源性浓缩液的血小板以形成裂解的血小板制备物，通过将裂解的血小板制
备物中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白形成凝块凝胶，以及压榨凝块凝胶以从凝块凝胶中压出液体。
9.在另一个方面，方法包括使血源性血小板浓缩液的液体生物活性级分通过至少第一深层过滤器，以便从生物活性级分中除去悬浮固体，所述血源性血小板浓缩液的液体生物活性级分包含血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白，和tgf-β1、egf、fgf-β、pdgf-aa、pdgf-bb、sdf-1α及vegf中的至少一种，任选地全部，其中纤维蛋白原以低于20,000ng/ml的含量存在。血小板浓缩液优选是人血小板浓缩液。在优选的方式中，液体生物活性级分通过第一深层过滤器，还通过第二深层过滤器，其中第二深层过滤器任选具有比第一深层过滤器小的公称微米等级。
10.在另一个方面，提供了包含人血源性血小板浓缩液的生物活性级分的组合物，该血小板浓缩液含有人血小板和人血浆，该生物活性级分包含血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、tgf-β1、egf、fgf-β、pdgf-aa、pdgf-bb、sdf-1α和vegf。生物活性级分可具有以低于约20,000ng/ml的含量存在，例如在约500ng/ml至约20,000ng/ml范围内的纤维蛋白原，和/或生物活性级分或含有它的细胞培养基可以不含或基本上不含所添加的肝素(即，非原产于血小板浓缩液起始原料的肝素)。生物活性级分可以具有如本文所公开的生长因子含量或比例。在某些实施方案中，生物活性级分是液体生物活性级分，并且天然组分包括：
11.含量低于20,000ng/ml液体生物活性级分，例如在约500ng/ml至约20,000ng/ml液体生物活性级分范围内的纤维蛋白原；
12.含量为至少2mg/dl液体生物活性级分的白蛋白；
13.含量为至少1g/dl液体生物活性级分的球蛋白；
14.含量为至少5000皮克/毫升(“pg/ml”)液体生物活性级分的tgf-β1；
15.含量为至少20pg/ml液体生物活性级分的egf；
16.含量为至少5pg/ml液体生物活性级分的fgf-β；
17.含量为至少200pg/ml液体生物活性级分的pdgf-aa；
18.含量为至少50pg/ml液体生物活性级分的pdgf-bb；
19.含量为至少100pg/ml液体生物活性级分的sdf-1α；和
20.含量为至少10pg/ml液体生物活性级分的vegf。
21.本公开还提供了用于制备生物活性组合物的方法，包括如下步骤：将凝结剂添加到血小板裂解物组合物中以形成凝结物质，将凝结物质中的凝结固体与液体分离，以及使液体经受深层无菌过滤。在一些形式中，该方法还包括将生物活性组合物包装于无菌容器中。
22.在某些实施方案中，生物活性级分是液体生物活性级分，并且天然组分包括：
23.含量在约200pg/ml至约350pg/ml之间的fgf-2；
24.含量在约1800pg/ml至约3100pg/ml之间的egf；
25.含量在约24,000pg/ml至约28,000pg/ml之间的pdgf-aa；
26.含量在约50ng/ml至约80ng/ml之间的pdgf-bb；
27.含量在约500pg/ml至约800pg/ml之间的vegf；
28.含量在约60ng/ml至约90ng/ml之间的tgf-b；和
29.含量低于2.5μg/ml的纤维蛋白原。
30.本文公开的另外的实施方案涉及本文所描述的生物活性级分或组合物用于细胞培养、冷冻保存或治疗目的的用途。
31.通过本文的说明，对本技术领域的普通技术人员来说，更进一步的实施方案以及特征和优点将是显而易见的。
附图说明
32.图1示出了用于制备人血小板浓缩液组合物的液体生物活性级分的方法。
33.图2是无菌包装中本公开的液体生物活性级分的一个实施方案的透视图。
34.图3是滴瓶中本公开的液体生物活性级分的一个实施方案的透视图。
具体实施方式
35.为了有助于对本发明的原理的理解的目的，现在将参照某些实施方案并且使用特定的语言来描述它们。然而应当理解的是，无意因此限制本发明的范围。所描述的实施方案中的任何变化和进一步的修改，以及如本文中所描述的本发明的原理的任何进一步的应用都视为本发明所涉及的领域的技术人员通常会想到的。
36.一般来讲，本公开提供了生物活性组合物和制备生物活性组合物的方法，该生物活性组合物可用作，例如，细胞培养补充剂和/或治疗剂。本公开的组合物包括来源于人源的组合物，从而克服了与异种组合物如fbs相关的问题。此外，本发明优选的组合物，虽然保留了重要的生长因子和其它化学物质，但是具有低含量的纤维蛋白原，且不需要添加在使用过程中防止有问题的凝结发生的抗凝剂如肝素。
37.现在转向图1，所示是用于制备来自血小板浓缩液组合物的生物活性级分的一个示例性方法100。该方法包括以下步骤：获得血小板浓缩液01，将血小板浓缩液冷冻02，将血小板浓缩液解冻03，向血小板浓缩液添加凝结剂04，将凝块固体与液体分离05，用第一深层过滤器过滤液体06，用第二深层过滤器过滤液体07，用无菌过滤器过滤液体08，以及包装液体09。在某些方面，如下讨论详细叙述了对每一个所描述的一般步骤的选择；然而，应该理解的是，对于本文中的所有实施例，并非都需要所有所描述的一般步骤，并且将包括对应于一个、一些或所有所描述的步骤的特征的新方法视为本文的实施方案。
38.可以以任何合适的方式获得用作所公开方法的源材料的血小板浓缩液组合物和生物活性级分。如本文所使用的，术语血小板浓缩液是指含有已经从血源中浓缩的血小板的液体组合物。血源优选是人血，如全人外周血。血小板浓缩液优选包含血小板和血浆蛋白两者，并且可以由血小板单位来提供，该血小板单位通过机采从人供体的全外周血获得。可以预期来自其它物种例如哺乳动物物种的全血也可以用作待进行如本文所描述的处理的血小板浓缩液的来源。在某些实施方案中，在处理过程中的某一时刻，可以将来自不同的人或其它供体的血小板单位汇集以获得生物活性级分。在如今的典型实践中，每个人供体机采的血小板单位具有约100至约500ml，更典型地约100至400ml的体积，并且含有约100至500
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109个血小板和机采过程中与血小板分离的血浆。捐献的人机采血小板单位具有供在医疗卫生机构使用的相对短的保质期，一般为约五天。在本文的方法中所使用的血小板单位可以是从医疗卫生机构获得的、最近到期的人机采血小板单位，并且在用来制备如本文
所描述的生物活性级分之前，可以任选地在任何合适的温度例如约-20℃冷冻储存。
39.在制备生物活性级分中，可以通过合适的方法释放血小板内容物。在某些方式中，通过使血小板经过至少一个用来释放血小板内容物的冻融循环，且任选地多个冻融循环(例如，2个或3个冻融循环)而使血小板裂解。在使用冻融循环中，血小板浓缩液可在任何合适的温度下进行冷冻。在一些方面，在约-10℃至约-80℃之间的温度下冷冻血小板浓缩液。在具体的优选实施方案中，在约-20℃下冷冻血小板浓缩液。为了裂解血小板，例如在37℃的水浴中或通过其它有效的手段，使冷冻的血小板浓缩液解冻，从而形成“原始”血小板裂解物组合物。原始血小板裂解物包含裂解的血小板膜和生长因子以及从裂解的血小板中释放的其它物质。当被解冻的血小板浓缩液包含血浆和血小板时，血小板裂解物还将含有血浆，包括其中的血浆蛋白。在本文的某些方面，可以使用用于释放血小板内容物的其它技术，例如用凝血酶激活。然而，据认为用于裂解血小板的冻融或其它机械技术的优点在于它们不需要将非天然蛋白(如凝血酶)添加到血小板浓缩液中，该添加既会增加成本又使得在下游所处理的材料中存在至少一些凝血酶。
40.原始血小板裂解物含有多种来自血小板浓缩液起始材料的生长因子。这些生长因子可以包括，例如，转化生长因子β1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子aa、血小板衍生生长因子bb、基质细胞衍生因子-1α和血管内皮生长因子。
41.转化生长因子β1(tgf-β1)是在许多细胞类型中控制增殖、分化和其它功能的多功能肽。表皮生长因子(egf)刺激细胞的增殖、分化和存活。碱性成纤维细胞生长因子(fgf-b)促进血管生成并结合至肝素上，刺激多种多样的细胞。血小板衍生生长因子aa(pdgf-aa)是调节细胞生长和分裂，并促进血管生成的二聚糖蛋白。血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)是调节细胞生长和分裂，并促进血管生成的二聚糖蛋白。基质细胞衍生因子-1α(sdf-1α)激活白细胞并促进血管生成。
42.血管内皮生长因子(vegf)有助于血管发生和血管生成。
43.在某些实施方案中，原始血小板裂解物包含以下生长因子及其量(基于原始、未稀释的血小板浓缩液的体积)：
44.约50,000至约150,000pg/ml的tgf-β1，优选约70,000至约120,000pg/ml的tgf-β1；和/或
45.约100至约600pg/ml的egf，优选约200至约600pg/ml的egf；和/或
46.约5至约250pg/ml的fgf-b，优选约50至约200pg/ml的fgf-b；和/或
47.约500至约20,000pg/ml的pdgf-aa，优选约5000至约15000pg/ml的pdgf-aa；和/或
48.约1000至约20,000pg/ml的pdgf-bb，优选约2000至约15000pg/ml的pdgf-bb；和/或
49.约400至1100pg/ml的sdf-1α，优选约500至约1000pg/ml的sdf-1α；和/或
50.约10至约800pg/ml的vegf，优选约100至约600pg/ml的vegf。
51.在优选的形式中，原始血小板裂解物还包含一种或多种来源于血小板浓缩液起始材料中的血浆的组分，包括例如纤维蛋白原、球蛋白、白蛋白、甘油三酯、葡萄糖、钠、钙和/或胆固醇。在优选的形式中，原始血小板裂解物包含下列组分和量：
52.约0.5至2.5g/dl的球蛋白，优选约1.5至2.5g/dl的球蛋白；
53.约2至5g/dl的白蛋白，优选约3至4g/dl的白蛋白；
54.约100至200mmol/l的钠，优选约120至约160mmol/l的钠；
55.约40至200mg/dl的甘油三酯，优选约50至120mg/dl的甘油三酯；
56.约150至300mg/dl的葡萄糖，优选约150至250mg/dl的葡萄糖；
57.约5至12mg/dl的钙，优选约6至10mg/dl的钙；和/或
58.约1至350万ng/ml的纤维蛋白原，优选约150至250万ng/ml的纤维蛋白原。
59.原始血小板裂解物也可以包含其它生物活性物质，例如一种或多种白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子。这些白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子可以包括，例如，白介素(il)-1b、il-6、il-8、il-10、il-13、il-17、干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)中的一种、一些或所有。
60.在本文的某些实施方案中，对原始血小板裂解物进行处理以除去微粒物，例如离心，并进行灭菌，以用作血小板裂解产品。这样的灭菌可以，例如，包括使除尽微粒物的原始血小板裂解物通过无菌过滤器。
61.在本文的一些实施方案中，对原始血小板裂解物进行处理以回收其具有降低的纤维蛋白原浓度的级分。可通过任何合适的技术除去纤维蛋白原，包括例如通过向纤维蛋白的转化使得形成可以与液体生物活性级分分离的固体凝块物质。通过添加凝结剂可以诱导这样的向纤维蛋白的转化。按照实施所公开的方法的一些形式，可以将凝结剂，例如氯化钙盐，添加到原始血小板裂解物中。示例性地，可以将含量为每升原始血小板裂解物在约0.1g至2g之间的氯化钙盐添加到原始血小板裂解物中。在优选的实施方案中，向每升原始血小板裂解物中添加约0.4g至约0.75g氯化钙盐。可以将合并的血小板裂解液与氯化钙或其它凝结剂放置在振荡器上或以其它方式搅动以确保凝结剂与浓缩液的彻底混合。然后使生成的混合物形成固体凝块物质，在某些实施方案中，为期至少约8小时，或至少约12小时，通常在约8小时至约36小时的范围内。在优选的形式中，至少主要量(超过50％)的所生成的凝结物质，可能至少80％或至少90％的所生成的凝结物质，由基本上同质的凝块凝胶构成。这种基本上同质的凝块凝胶可以表现出整个材料中一致的凝胶相，而液体则夹带在连续的纤维蛋白基质内。这些凝结物质的优选形式与凝结的血小板浓缩液材料不同，其中大量的离散固体凝块颗粒悬浮在液相中，这对随后基于离心机的分离技术是可取的。
62.凝块形成后，可以将液体物质与固体凝块物质分离。任何合适的技术都可以用于此目的。在优选的形式中，压挤两个或更多个表面之间的凝结物质以将凝结固体与液体分离。在凝结物质表现出如本文所讨论的基本上同质的凝块凝胶的形式的情况下，这样的压挤可以将液体从凝胶物质中压出，同时压榨并浓缩凝胶的纤维蛋白基质。在一些形式中，可以在柔性容器如塑料袋中压挤凝结物质。例如，用手手动地或用工具施力，可以将凝块凝胶压挤到袋或其它柔性容器的一个区域(例如端部)，而从固体纤维蛋白基质压出的液体可以聚集到袋或其它柔性容器的另一个区域(例如端部)。在压挤发生时，压挤过程中或压挤之后，可以将第二个袋或其它容器与第一个袋连接，而液体物质可以转移到第二个袋或其它容器中。在其它方式中，凝块凝胶可以位于刚性容器如桶中，并可以用手或用工具施力进行压挤，从而将液体从固体纤维蛋白基质中压出，并且压榨且浓缩纤维蛋白基质。
63.在凝结和凝结的血小板浓缩液的液体和固体物质分离之后，相比于凝结之前的原始血小板裂解物，分离的液体具有降低的纤维蛋白原浓度。在优选的形式中，原始血小板裂解物具有至少1000000ng/ml的纤维蛋白原含量，通常在约1,500,000至3,500,000(150至
350万)ng/ml的范围内，并且在凝结和分离之后，液体具有低于约50,000ng/ml，优选低于约20,000ng/ml，更优选低于约10,000ng/ml的纤维蛋白原含量。示例性地，这种分离后的液体可以具有在约500ng/ml至约20,000ng/ml或约500ng/ml至约10,000ng/ml的范围内的纤维蛋白原含量。另外或可选择地，这种分离后的液体可以含有低于约5％，优选低于约2％，更优选低于约1％的存在于凝结之前的血小板浓缩液中的纤维蛋白原。此外，这种分离后的液体可以构成至少约70％，优选至少约75％，通常在约75％至约90％的范围内的原始血小板裂解物的体积。
64.在原始血小板裂解物凝结并且液体/固体分离之后，所回收的除尽纤维蛋白原的液体生物活性级分含有来自原始血小板裂解物的多种生长因子。这些生长因子可以包括tgf-β1、egf、fgf-β、pdgf-aa、pdgf-bb、sdf-1α和vegf。在某些实施方案中，这种除尽纤维蛋白原的液体生物活性级分包含以下来自原始血小板裂解物的生长因子及其量：
65.约50,000至约150,000pg/ml的tgf-β1，优选约70,000至约120,000pg/ml的tgf-β1；
66.约20至约800pg/ml的egf，优选约400至约800pg/ml的egf；和/或
67.约5至约250pg/ml的fgf-b，优选约50至约250pg/ml的fgf-b；和/或
68.约500至约25,000pg/ml的pdgf-aa，优选约5000至约18000pg/ml的pdgf-aa；和/或
69.约1000至约25,000pg/ml的pdgf-bb，优选约2000至约18000pg/ml的pdgf-bb；和/或
70.约400至1000pg/ml的sdf-1α，优选约500至约900pg/ml的sdf-1α；和/或
71.约10至约600pg/ml的vegf，优选约150至约450pg/ml的vegf。
72.在其它实施方案中，除尽纤维蛋白原的液体生物活性级分包括以下来自原始血小板裂解物的生长因子及其量：
73.含量在约200pg/ml至约350pg/ml之间的fgf-2(即fgf-b)；和/或含量在约1800pg/ml至约3100pg/ml之间的egf；和/或
74.含量在约24,000pg/ml至约28,000pg/ml之间的pdgf-aa；和/或
75.含量在约50ng/ml至约80ng/ml之间的pdgf-bb；和/或
76.含量在约500pg/ml至约800pg/ml之间的vegf；
77.含量在约60ng/ml至约90ng/ml之间的tgf-b。
78.在一些形式中，除尽纤维蛋白原的液体生物活性级分还具有低于3μg/ml，优选低于2.5μg/ml的纤维蛋白原含量。
79.在优选的形式中，这种除尽纤维蛋白原的液体生物活性级分还包含一种或多种来源于血小板浓缩液起始材料中的血浆的组分，包括例如球蛋白、白蛋白、甘油三酯、葡萄糖、钠和/或钙。在将氯化钙盐用于凝结原始血小板裂解物的情况下，存在于分离后的液体生物活性剂中的钙可以来自裂解物和所添加的钙盐两者。在某些实施方案中，这种分离的液体生物活性级分包含以下来自原始血小板裂解物的组分及量：
80.约0.5至2.5g/dl的球蛋白，优选约1至2g/dl的球蛋白；
81.约2至5g/dl的白蛋白，优选约3至4g/dl的白蛋白；
82.约100至200mmol/l的钠，优选约120至约160mmol/l的钠；
83.约40至70mg/dl的甘油三酯，优选约50至65mg/dl的甘油三酯；和/或
84.约150至300mg/dl的葡萄糖，优选约150至250mg/dl的葡萄糖。
85.此外，在将氯化钙盐用作原始血小板裂解物的凝结剂的情况下，在一些形式中，这种分离后的液体生物活性级分可以包含含量为约15至35mg/dl，优选约15至25mg/dl的钙。
86.按照实施本发明的一些方式，使液体生物活性级分通过无菌过滤器。在优选的实施方案中，无菌过滤器包括0.2μm无菌过滤器。在通过无菌过滤器之后，可以将液体生物活性级分密封在无菌容器内。
87.在凝结和液体/固体分离步骤之后，本文的某些发明实施方案包括过滤所回收的液体生物活性级分，例如除去悬浮固体，如任何残留的血小板碎片、细胞碎片和凝块固体。在优选的方式中，这样的过滤包括通过至少一个深层过滤器，优选多个深层过滤器如两个或三个可能不同微米等级的深层过滤器处理液体生物活性级分。在这点上，如已知的和如本文中所使用的，“深层过滤器”或“深层过滤”分别指的是利用多孔过滤介质在整个介质中，而不是仅仅在介质的表面上保持颗粒的过滤器和过滤。此外，如已知的和如本文中所使用的，应用于过滤器的“公称微米等级”是指这样的粒度，高于该粒度时，遍及过滤器的额定能力，将去除所有悬浮固体的98％。本发明的某些变体包括通过至少一个深层过滤器，随后通过至少一个无菌过滤器的过滤。本发明的另外的变体包括通过至少两个深层过滤器随后通过至少一个无菌过滤器的过滤。在优选的形式中，所用的深层过滤器或多个深层过滤器具有带正表面电荷的过滤介质。
88.在某些实施方案中，在液体生物活性级分的深层过滤中使用第一深层过滤器和第二深层过滤器。第一深层过滤器具有比第二深层过滤器大的公称微米等级。在一些形式中，第一深层过滤器具有在约10与0.1微米之间的公称微米等级。在优选的实施方案中，第一深层过滤器具有在5与0.1微米之间，甚至更优选在约3与0.2微米之间的公称微米等级。在某些实施方案中，第一深层过滤器具有纤维素膜和带正表面电荷、由纤维素纤维和无机助滤剂如硅藻土组成的过滤介质。
89.在某些实施方案中，第二深层过滤器具有比第一深层过滤器小的公称微米等级，例如，在一些形式中小于约0.5微米。在优选的实施方案中，第二深层过滤器具有在0.5至0.001微米之间，甚至更优选在约0.1至0.001微米之间的公称微米等级。在某些实施方案中，第一深层过滤器具有纤维素膜和带正表面电荷、由纤维素纤维和无机助滤剂如硅藻土组成的过滤介质。
90.在优选的形式中，在深层过滤或其它过滤除去悬浮固体之后，液体生物活性级分仍然含有来自原始血小板裂解物的多种生长因子。这些生长因子可以包括tgf-β1、egf、fgf-β、pdgf-aa、pdgf-bb、sdf-1α和vegf。在某些实施方案中，这种过滤后的液体生物活性级分包含以下源自原始血小板裂解物的生长因子及其量：
91.约5000至约75,000pg/ml的tgf-β1，优选约5000至约60,000pg/ml的tgf-β1；
92.约20至300pg/ml的egf，优选约50至约250pg/ml的egf。
93.约5至约150pg/ml的fgf-β，优选约30至130pg/ml的fgf-β；
94.约200至约4000pg/ml的pdgf-aa，优选约1000至约3000pg/ml的pdgf-aa；
95.约50至约1000pg/ml的pdgf-bb，优选约100至约500pg/ml的pdgf-bb；
96.约100至700pg/ml的sdf-1α，优选约300至约600pg/ml的sdf-1α；和/或
97.约10至约400pg/ml的vegf，优选约40至约200pg/ml的vegf。
98.在优选的形式中，这种深层过滤或其它过滤后的液体生物活性级分还包含一种或多种来源于血小板浓缩液起始材料中的血浆的组分，包括例如球蛋白、白蛋白、甘油三酯、葡萄糖、钠和/或钙。此外，在将氯化钙盐用于凝结原始血小板裂解物的情况下，存在于过滤后的液体生物活性剂中的钙可以来自裂解物和所添加的钙盐两者。在某些实施方案中，这种过滤后的生物活性液体级分包含以下源自原始血小板裂解物的组分及量：
99.约0.5至2.5g/dl的球蛋白，优选约1至2g/dl的球蛋白；
100.约2至5g/dl的白蛋白，优选约3至4g/dl的白蛋白；
101.约100至200mmol/l的钠，优选约120至约160mmol/l的钠；
102.约50至120mg/dl的甘油三酯，优选约60至110mg/dl的甘油三酯；和/或
103.约150至300mg/dl的葡萄糖，优选约150至250mg/dl的葡萄糖。
104.此外，在将氯化钙盐用作原始血小板裂解物的凝结剂的情况下，在一些形式中，这种分离后的生物活性液体级分可以包含含量为约15至60mg/dl，优选约20至50mg/dl的钙。
105.生物活性液体级分还可以包含其它生物活性物质，例如一种或多种白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子。这些白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子可以包括，例如，白介素(il)-1b、il-6、il-8、il-10、il-13、il-17、干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)中的一种、一些或所有。
106.如上所述，在本文的方法的一些实施方案中，优选在通过深层过滤器或其它过滤器除去如上所讨论的悬浮固体之后，使液体生物活性级分通过至少一个无菌过滤器。多种无菌过滤器和相关方法是已知的且可以使用。通过无菌过滤器除去的示例性污染物包括，例如：金黄色葡萄球菌(staphyloccus aureus)、绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)、产芽孢梭状芽孢杆菌(clostridium sporogenes)、白色念珠菌(candida albicans)、黑曲霉(aspergillus niger)、支原体(mycoplasma)和/或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。可以选择表现出相对低的蛋白结合的无菌过滤器。在无菌过滤之后，在优选的形式中，无菌过滤后的液体生物活性级分可以具有与如上对深层过滤或其它过滤后的液体生物活性级分所说明的相同组分，并且还具有在如上对深层过滤或其它过滤后的液体生物活性级分所说明的含量范围内的那些组分含量。然而，应当理解的是，在无菌过滤过程中，一些或所有组分的含量可能发生一些降低。
107.在某些优选的实施方案中，可以通过上述血小板裂解、纤维蛋白原除尽和深层或其它过滤除去悬浮微粒的步骤获得的无菌液体生物活性级分组合物包含：
108.含量低于20,000ng/ml液体生物活性级分，例如在约500ng/ml至约20,000ng/ml液体生物活性级分范围内的纤维蛋白原；
109.含量为至少2mg/dl液体生物活性级分的白蛋白；
110.含量为至少1g/dl液体生物活性级分的球蛋白；
111.含量为至少5000pg/ml液体生物活性级分的tgf-β1；
112.含量为至少20pg/ml液体生物活性级分的egf；
113.含量为至少5pg/ml液体生物活性级分的fgf-β；
114.含量为至少200pg/ml液体生物活性级分的pdgf-aa；
115.含量为至少50pg/ml液体生物活性级分的pdgf-bb；
116.含量为至少100pg/ml液体生物活性级分的sdf-1α；和
117.含量为至少10pg/ml液体生物活性级分的vegf。
118.在一些形式中，本公开的液体生物活性级分组合物还具有以下特征：
119.低于约10eu/ml的内毒素含量；
120.低于约25mg/dl的血红蛋白；
121.约4至6g/dl的总蛋白；
122.约260至340mmol/kg的摩尔渗透压浓度；和/或
123.在6.8和7.8之间的ph。
124.这些特征可存在于原始血小板裂解物组合物中(还可能在通过离心或以其它方式除去固体且灭菌之后)，存在于在凝结和液/固分离(并可能灭菌)之后所回收的除尽纤维蛋白原的液体生物活性级分中，或存在于在深层过滤和/或其它过滤除去悬浮固体(并可能灭菌)之后的除尽纤维蛋白原的液体生物活性级分中，如上文所述。同时，由于优选的处理形式不需要使用作为加工助剂的洗涤剂，因此这些组合物可以不含或基本上不含洗涤剂残留物。
125.在某些操作方式下，用来制备本公开的除尽纤维蛋白原的、过滤(例如，深层过滤)后的液体生物活性级分组合物的过程使得本文所限定的生长因子、白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子的含量降低。作为实例，在某些实施方案中，对除尽纤维蛋白原的级分进行深层过滤或其它过滤除去悬浮固体，并使得：
126.tgf-β-1、egf、fgf-b、pdgf-aa、pdgf-bb、sdf-1α和vegf中的一种、一些或所有的含量(例如，pg/ml)降低至少20％；和/或
127.tgf-β-1的含量(例如，pg/ml)降低至少50％；和/或
128.egf的含量(例如，pg/ml)降低至少30％；和/或
129.fgf-b的含量(例如，pg/ml)降低至少20％；和/或
130.pdgf-aa的含量(例如，pg/ml)降低至少50％；和/或
131.pdgf-bb的含量(例如，pg/ml)降低至少50％；和/或
132.sdf-1α的含量(例如，pg/ml)降低至少20％；和/或
133.vegf的含量(例如，pg/ml)降低至少30％。
134.此外或可选地，深层过滤或其它过滤可导致除去极显著含量的白介素-17(il-17)。在某些实施方案中，深层过滤或其它过滤除去微粒后的il-17的含量以及还可能在最终的、灭菌后的液体生物活性级分产品中的il-17的含量低于约1pg/ml，更优选低于约0.75pg/ml，甚至更优选低于约0.5pg/ml。il-17是炎性细胞因子，还级联触发其它炎性细胞因子的释放。优选的具有如本文所限定的低含量il-17的产品可以以几乎没有或没有因il-17的存在而导致的炎症活性的方式投入使用。
135.此外或可选择地，对除尽纤维蛋白原的级分进行深层过滤或其它过滤以除去悬浮固体可以产生pdgf-bb浓度低于1000pg/ml、pdgf-aa浓度低于3000pg/ml、tgf-β1浓度为至少5000pg/ml和/或vegf浓度低于300pg/ml的液体生物活性级分产品。这些值也可以存在于深层过滤或其它过滤除去悬浮固体后所制备(例如，通过无菌过滤)的无菌产品中。
136.根据本文所公开的一些方式，可以处理本文所述的液体生物活性级分以便有益地保留血浆组分。可以被液体生物活性级分保留的血浆组分包括：球蛋白、白蛋白、甘油三酯、葡萄糖、钠和/或钙。在一些形式中，液体生物活性级分含有一种或多种这样的血浆组分，可
能地含有所有，同时还具有以下特征：
137.含量为至少200pg/ml液体生物活性级分的fgf-2；
138.含量为至少1800pg/ml液体生物活性级分的egf；
139.含量为至少24,000pg/ml液体生物活性级分的pdgf-aa；
140.含量为至少50ng/ml液体生物活性级分的pdgf-bb；
141.含量为至少500pg/ml液体生物活性级分的vegf；
142.含量为至少60ng/ml液体生物活性级分的tgf-β1；和
143.含量低于2.5μg/ml液体生物活性级分的纤维蛋白原。
144.在一些形式中，可以将本公开的液体生物活性级分组合物包装于用于储存或递送的无菌包装中。可以以其完全回收浓度对液体生物活性级分进行包装，或者其可以用水或水性介质进行稀释以供包装和随后使用，例如可以稀释至液体生物活性级分的初始浓度的90％至10％，并且这样的稀释后的组合物以及它们所导致的本文所说明的组分含量的相应降低形成了本文所公开的另外实施方案。在图2中示出了这样的包装的一个实施方案。根据实施本公开的一些形式，将组合物200储存于无菌培养基瓶210中。无菌培养基瓶可以，例如，具有在50ml至5000ml的范围内的体积容量。作为实例，可以使用60ml、125ml、250ml、500ml、1000ml或2000ml的瓶。在一些形式中，通过收缩包装230保护无菌培养基瓶210的盖子220。在一些形式中，将瓶收缩包裹。在某些实施方案中，瓶贴有制成品标签240。在一些形式中，将瓶放置在具有干冰的产品箱中。
145.在某些实施方案中，本公开的液体生物活性级分组合物可以与其它成分组合形成细胞培养基。这样的细胞培养基包含与用于细胞培养的其它营养物或培养基混合的本公开的液体生物活性级分，用于细胞培养的其它营养物或培养基包括例如已知的细胞培养基如极限必需培养基(mem)或者杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle medium，dmem)中存在的那些。根据本公开的细胞培养基被配制成为细胞生长或维持提供所必需的营养物(例如生长因子等等)，包括例如干细胞和/或祖细胞，如间充质干细胞。在优选的形式中，这样的细胞培养基不含所添加的肝素，并且尽管如此不含任何凝结物质(例如，这将通过出现不放大的情况下肉眼可见的凝块颗粒来证明)。
146.在其它实施方案中，本公开的液体生物活性级分组合物或其级分，可用作治疗物质。例如，该组合物可以用作用于医学治疗，包括用于治疗患病的或受损的组织，如神经、腱、骨骼、肌肉、皮肤(如伤口愈合)、结缔组织、眼和/或心血管(如心脏或主动脉)组织的治疗物质。可通过任何合适的手段，包括例如注射或其它外科植入将本文中所描述的液体生物活性级分或包含它的组合物递送到这些组织或其它组织。在某些用途中，在治疗眼组织时，将液体生物活性组合物或包含它的组合物施加到眼表面上(例如，以液滴的形式)，例如在治疗眼表面缺陷或疾病，如眼的移植物抗宿主病(眼的gvhd)、角膜溃疡、干眼(干燥性角膜结膜炎(keratoconjunctivitis sicca))或手术或受伤后的角膜修复中。
147.在其它实施方案中，本发明的液体生物活性级分组合物或其级分，可用作治疗物质。例如，该组合物可以用作用于医学治疗，包括用于治疗患病的或受损的组织，如神经、腱、骨骼、肌肉、皮肤(如伤口愈合)、结缔组织、眼和/或心血管(如心脏或主动脉)组织的治疗物质。可通过任何合适的手段，包括例如注射或其它外科植入将本文中所描述液体生物活性级分或包含它的组合物递送到这些组织或其它组织。在某些用途中，在治疗眼组织时，
将液体生物活性组合物或包含它的组合物施加到眼表面上(例如，以液滴的形式)，例如在治疗眼表面缺陷或疾病，如眼的移植物抗宿主病(眼的gvhd)、角膜溃疡、干眼(干燥性角膜结膜炎)或手术或受伤后的角膜修复中。
148.根据本发明的某些变体，将本公开的液体生物活性级分用于治疗哺乳动物患者(例如人、犬、猫、马等)。在某些实施方案中，对于目标患者液体生物活性级分是同种异体的，在其它实施方案中，对于目标患者液体生物活性级分是异种的。例如，在某些实施方案中，来源于人血小板的血小板裂解物组合物可用于治疗犬科患者。还预期来源于犬科血小板的血小板裂解物组合物可用于治疗犬科患者，并且来源于人血小板的血小板裂解物组合物可用于治疗人类患者。在一些形式中，患者患有干燥性角膜结膜炎。根据本公开的某些变体，本发明的液体生物活性级分用于治疗患有干燥性角膜结膜炎的犬科患者。犬科患者可以是犬科的任何品种，通常受干燥性角膜结膜炎影响的品种包括：查理士王小猎犬、斗牛犬、中国沙皮犬、拉萨犬、西施犬、西高地白梗、帕格、寻血猎犬、可卡犬、北京犬、波士顿梗、迷你雪纳瑞和萨摩耶。
149.在某些实施方案中，将含有液体生物活性级分的人血小板裂解物储存于液体递送装置中，该液体递送装置被构造成将液体生物活性级分递送到患者的眼中。在一些形式中，液体递送装置是无菌容器。图3示出了液体递送装置的一个实施方案。在示出的实施方案中，将液体生物活性级分被储存于装置300内。装置300具有储存部310和分散部320。在所示的实施方案中，可以任选地用盖子322覆盖分散部320。可以将分散部320构造成以便分配液体生物活性级分的一部分(例如逐滴)。在一些形式中，储存部310包括可以由使用者挤压的可变形的塑料材料。其它合适的液体递送装置包括但不限于：滴眼管和移液器。
150.根据某些实施方案，将本发明的液体生物活性级分配制成药膏。在一些形式中，将含有hpl的药膏局部地施加到受影响的区域(例如患者的眼睛)。
151.液体生物活性组合物也可以用于其它目的，包括例如作为细胞的冷冻保护剂。在这样的冷冻保护剂使用中，可以将液体生物活性组合物掺入到细胞悬浮组合物中，细胞悬浮组合物可以冷冻保存以保持细胞的活力。细胞可以是多种细胞的任一种，包括干细胞如间充质干细胞、祖细胞或其它细胞。可在合适的容器例如袋或小瓶中进行冷冻保存。
152.除了得自所回收的来源于裂解血小板浓缩液的液体生物活性级分的派生产品外，由凝结和液-固分离过程中形成的固体凝块物质也可以制备有价值的产品。在某些方式中，已发现分离后的固体凝块物质还富含生长因子，并含有足量的纤维蛋白原和凝结因子以用作可凝结载体，例如在生物粘合剂中，和/或以用作用于医疗应用的止血材料。对于这些或其它目的，所回收的固体凝块物质可以在冷藏或冷冻条件下储存和/或可以将所回收的固体凝块物质冻干形成可任选地粉碎成粉末形式的干物质。对于医疗、诊断、研究或其它应用，通过任何合适的手段，包括例如通过暴露于辐射或化学杀菌剂(例如，环氧乙烷)，可以对由此得到的固体凝块物质或级分进行灭菌。
153.此外，除了回收液体生物活性级分以及可能还回收由以上所讨论的凝结和液-固分离过程中形成的固体凝块物质制备的产品之外，可以从用于处理血小板裂解物的一个过滤器或多个过滤器中单独地或以混合物的形式回收生物活性物质如生长因子或其它蛋白。这可以从原始起始材料中回收附加价值。示例性地，随后可以对用于过滤血小板裂解物组合物的深层过滤器(例如，如上文所述的深层过滤器)进行处理以回收一种或多种生长因子
或过滤器上捕获的其它生物活性物质。这可以以任何合适的方式来完成。示例性地，通过使洗脱液通过过滤器以便克服蛋白对过滤介质的吸引，可以将一种或多种蛋白，如生长因子从过滤器中洗脱出来，从而生成含有蛋白的洗脱液流。在使用至少部分地基于蛋白和带电过滤介质之间的电荷相互作用来保留蛋白的带电荷的(例如，带正电荷的)深层过滤器的情况下，通过用盐溶液、洗脱液的ph值变化(相对于在初始过滤过程中所使用的)或用亲和洗脱介质(含有待洗脱蛋白的配体)进行洗脱，可以从过滤介质中回收蛋白。梯度洗脱(例如，通过盐或ph梯度)可用于顺序地洗脱级分，所述级分被纯化以获得特定的蛋白或感兴趣的蛋白或所述级分富含特定的蛋白或感兴趣的蛋白。所回收的一种蛋白或多种蛋白可以例如是本文所限定的任何一种，优选本文所限定的生长因子、白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子中的一种或多种。这些蛋白可用于例如治疗、诊断或研究目的。为了这些或其它目的，从过滤介质中回收之后，它们可以任选地经纯化和/或灭菌。
154.为了有助于本公开的方面及其特征和优点的进一步理解的目的，提供了以下具体实施例。应该理解的是，这些实施例是示例性的，而不是限制本发明的实施方案。
155.实施例
156.实施例1
157.人血小板裂解物组合物的制备
158.收集5天保质期后刚过期的疾病筛查的机采人血小板单位(从外周血获得)并在冰箱中在-20℃下冷冻直到使用。从冰箱中取出若干单位(例如约10单位)并在室温下解冻，从而裂解血小板并形成“原始hpl”组合物。将来自所选择的单位的原始hpl汇集到袋中。将含量为0.7g/l(约6mm cacl2)的氯化钙添加到汇集后的原始hpl中，然后在室温下在振荡器上与原始hpl彻底混合2小时。在混合之后，在室温下使cacl2处理后的原始hpl凝结过夜，在此期间，由原始hpl的体积形成结实的、基本上同质的凝结凝胶团。
159.在保持封闭的同时，用手手动压挤含有原始hpl的凝胶凝块的袋以将液体从凝胶凝块中压出。彻底地进行该压挤，使得固体凝块团位于袋的一端，分开的液体体积位于邻近出口喷口的袋的另一端。分离后的液体占最初的、汇集后的原始hpl的体积的约75-80％，固体凝结物质占其余部分。将液体从袋中转移到具有100l容积的第二冷藏袋。进行足够数量的这样的解冻-汇集-凝结-压挤运行以用液体填满100l的冷藏袋。
160.将100l袋中的液体无菌连接到过滤器组并通过过滤器组进行处理，该过滤器组由具有带正表面电荷的过滤介质和在3与0.2微米之间的公称微米等级的第一深层过滤器以及具有带正表面电荷的过滤介质和在0.1与.001微米之间的公称微米等级的第二深层过滤器组成。以约100升每平方米过滤器表面积每小时(“lmh”)的滤液流量进行过滤。第一深层过滤器由millistack pod filter，c0级系列hc深层过滤器提供，而第二深层过滤器由millistack pod filter，xo级系列hc深层过滤器提供，两者均可从millipore公司商购获得。这些过滤器的每个都具有由纤维素的混合酯组成的膜和由具有无机助滤剂(硅藻土)的纤维素纤维组成的过滤介质。在处理100l袋材料之前，用无菌蒸馏水预灌注过滤器组。将从过滤器组离开的hpl液体收集到100l的第二袋中。
161.将100l的第二hpl袋无菌连接到无菌过滤器上并用泵进行抽吸通过无菌过滤器进入较小的容器，例如100ml或500ml广口瓶(例如，nalgene广口瓶)中。这可以在无菌填充条件下进行。广口瓶可以进行收缩包装以覆盖它们的带盖端，并进行标记。
162.按照本实施例制备的hpl产品具有如本文所说明的组成分布，并且可以用作细胞培养基的补充剂，且无需添加肝素来防止凝块形成。将该hpl产品添加到细胞培养基中，即使不添加肝素，也产生基本上无凝块的培养基。如此制备的细胞培养基在细胞培养中表现出优异的性能，在优选的用途中，在给定的培养期之后，可以获得相对高的细胞计数或汇合百分比，所述细胞包括但不限于骨髓间充质细胞、脂肪细胞干细胞、来源于胎盘的间充质干细胞和来源于肌肉的干细胞或祖细胞。
163.实施例2
164.人血小板裂解物组合物的制备
165.收集5天保质期后刚过期的疾病筛查的机采人血小板单位(从外周血获得)并在冰箱中在-20℃下冷冻直到使用。从冰箱中取出若干单位(例如约23单位)并在室温下解冻，从而裂解血小板并形成“原始hpl”组合物。将来自所选择的单位的原始hpl汇集到袋中。将含量为0.75g/l氯化钙(约6mm cacl2)添加到汇集后的原始hpl中，然后在室温下在振荡器上与原始hpl彻底混合2小时。在混合之后，在室温下使cacl2处理后的原始hpl凝结过夜，在此期间，由原始hpl的体积形成结实的、基本上同质的凝结凝胶团。
166.在保持封闭的同时，压挤含有原始hpl的凝胶凝块的袋以将液体从凝胶凝块中压出。彻底地进行该压挤，使得固体凝块团位于袋的一端，分开的液体体积位于邻近出口喷口的袋的另一端。分离后的液体占最初的、汇集后的原始hpl的体积的约75-80％，固体凝结物质占其余部分。将液体从袋中转移到具有25l容积的第二填充袋。进行足够数量的这样的解冻-汇集-凝结-压挤运行以用液体填满25l的填充袋。
167.将25l填充袋储存于4℃实验室冰箱中过夜。将蠕动泵用于转移来自25l填充袋的流体通过预过滤器(25μm)和无菌过滤器(0.2μm)。将过滤后的液体汇集到收集袋中。然后将过滤后的液体(hpl)等分到无菌容器(例如100ml或500ml的nalgene广口瓶)中。这可以在无菌填充条件下进行。广口瓶可以进行收缩包装以覆盖它们的带盖端，并进行标记。
168.按照本实施例制备的hpl产品具有如本文所说明的组成分布，并且可以用作细胞培养基的补充剂，且无需添加肝素来防止凝块形成，并且还可以在本文所限定的液体生物活性级分的其它应用中投入使用。将该hpl产品添加到细胞培养基中，即使不添加肝素，也产生基本上无凝块的培养基。如此制备的细胞培养基在细胞培养中表现出优异的性能，在优选的用途中，在给定的培养期之后，可以获得相对高的细胞计数或汇合百分比，所述细胞包括但不限于骨髓间充质细胞、脂肪细胞干细胞、来源于胎盘的间充质干细胞和来源于肌肉的干细胞或祖细胞。
169.实施例3
170.犬科血小板裂解物组合物的制备
171.可以基本上如上所述制备犬科血小板裂解物(cpl)组合物。一般来说，cpl组合物的制备开始于从外周血获得的疾病筛查机采犬科血小板单位的制备。如上详述，这样的血小板单位可以是新制备的，或者可以从过期的血小板单位获得。将血小板单位冷冻于-20℃的冰箱中直至使用。从冰箱中取出若干单位(例如约10单位)并在室温下解冻，从而裂解血小板并形成“原始cpl”组合物。将来自所选择的单位的原始cpl汇集到袋中。将含量为0.7g/l的氯化钙(约6mm cacl2)添加到汇集后的原始cpl中，然后在室温下在振荡器上与原始cpl彻底混合2小时。在混合之后，在室温下使cacl2处理后的原始cpl凝结过夜，在此期间，由原
始cpl的体积形成结实的、基本上同质的凝结凝胶团。
172.在保持封闭的同时，用手手动压挤含有原始cpl的凝胶凝块的袋以将液体从凝胶凝块中压出。彻底地进行该压挤，使得固体凝块团位于袋的一端，分开的液体体积位于邻近出口喷口的袋的另一端。分离后的液体占最初的、汇集后的原始cpl的体积的约75-80％，固体凝结物质占其余部分。将液体从袋中转移到具有100l容积的第二冷藏袋中。进行足够数量的这样的解冻-汇集-凝结-压挤运行以用液体填满100l的冷藏袋。
173.然后使所收集的液体(例如，液体生物活性级分)通过无菌过滤器。在一些形式中，使所收集的液体通过如实施例1所述的一系列深层过滤器。然后将过滤后的液体(cpl)等分到无菌容器(例如100ml或500ml的nalgene广口瓶)中。这可以在无菌填充条件下进行。广口瓶可以进行收缩包装以覆盖它们的带盖端，并进行标记。
174.按照本实施例制备的cpl产品具有如本文所说明的组成分布，并且可以用作细胞培养基的补充剂，且无需添加肝素来防止凝块形成，并且还可以在本文所限定的液体生物活性级分的其它应用中投入使用。将这种cpl产品添加到细胞培养基中，即使不添加肝素，也产生基本上无凝块的培养基。如此制备的细胞培养基在细胞培养中表现出优异的性能，在优选的用途中，在给定的培养期之后，可以获得相对高的细胞计数或汇合百分比，所述细胞包括但不限于骨髓间充质细胞、脂肪细胞干细胞、来源于胎盘的间充质干细胞和来源于肌肉的干细胞或祖细胞。如本文所描述的，cpl溶液也可以用作治疗剂。
175.除非本文另有规定或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中，特别是在以下权利要求书的上下文中使用术语“一个”、“一种”、“该/所述”和类似的指代都应被解释为覆盖单数和复数。除非本文另外指出，否则本文数值范围的例举仅旨在作为分别提及落在该范围内的每一个单独的数值的速记方法，并且如同在本文中单独列举一样，将每个单独的数值的范围并入说明书中。除非本文另有说明或者说是与上下文明显矛盾，否则可以以任何合适的顺序进行本文中所描述的所有方法。除非另有声明，否则本文所提供的任何的和所有的实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅仅是为了更好地阐明本发明，而不构成对本发明的范围的限制。说明书中的任何语言不应解释为表示任何非所要求保护的要素对本发明的实施是必不可少的。
176.如同特别地、单独地说明通过引用将每个单独的出版物或专利申请并入一样，在本说明书中所引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文中。此外，本文所述的任何理论、操作机制、证据或发现是为了进一步增强对本发明的理解，而非旨在以任何方式将本发明限制于这种理论、操作机制、证据或发现。虽然已经在附图和前面的描述中示出并详细描述了本发明，但是应认为在特征方面本发明是示例性的而不是限制性的，可以理解的是，仅示出并描述了所选择的实施方案，并且期望在本发明的精神范围内的如本文或以下权利要求所限定的所有等同形式、变化形式和修改形式都得到保护。