重楼皂苷类化合物在制备抑制PD-1与PD-L1相互作用药物中的应用

重楼皂苷类化合物在制备抑制pd-1与pd-l1相互作用药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体来说，本发明涉及重楼皂苷类化合物在制备抑制pd-1与pd-l1相互作用药物中的应用。


背景技术：

2.免疫检查点分子是一系列在免疫反应中的产生共刺激或抑制信号的分子，目前已发现的免疫检查点蛋白包括细胞程序性死亡受体1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)、淋巴细胞活化基因3(lag3)等。在正常机体中，免疫检查点一方面维持对自身抗原的免疫耐受，避免过强的免疫反应造成自身免疫疾病，另一方面负反馈免疫反应，避免过度刺激造成的组织损伤，而肿瘤细胞可以通过异常上调共抑制分子及其相关配体，抑制t细胞激活，从而形成免疫逃逸。2018年，诺贝尔生理学或医学奖授予了首先开展免疫检查点分子ctla-4和pd-1研究的allison和honjo教授。
3.pd-1主要表达于活化的t细胞、b细胞、nk细胞、单核细胞和树突状细胞，是一个限制活化t细胞反应的免疫检查点[journal of experimental medicine,2000,192(7):1027-1034]。目前已知的pd-1配体有pd-l1和pd-l2。研究表明，pd-1/pd-l1免疫检查点通路的过度激活可显著抑制效应t细胞的生物学功能，从而可能引起一些自身免疫性疾病、肿瘤的免疫逃逸、病毒感染、细菌感染、真菌感染等疾病的发生。因此，通过阻断pd-1/pd-l1相互作用，可以促进t细胞增殖，使其恢复对肿瘤、病毒、细菌、真菌等的免疫[nature reviews cancer,2012,12(4):252-264]，对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。
[0004]
基于这一原理，目前已有多款pd-1/pd-l1的大分子抗体药物被fda获批上市，用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤、黑色素瘤、转移性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌等，取得了良好的疗效。然而抗体药物多存在着生产成本高、分子量大、结构复杂、稳定性差、口服生物利用度低，以及其本身的免疫原性等局限性，从而限制其在临床上的广泛应用。而非肽类的小分子药物在稳定性、口服生物利用度、给药方式等方面具有较强的优势，因此，开发阻断pd-1/pd-l1相互作用小分子药物逐渐成为热点[上海医药,2019,40(17):76-80]。
[0005]
中医药是中华文明瑰宝，是几千年来中华民族同疾病斗争的伟大成就。然而，中药成分异常复杂，且作用机制仍需进一步研究。以pd-1/pd-l1免疫检查点为靶标，从传统中药中探索发现阻断pd-1/pd-l1相互作用小分子候选药物，是新药创制的有效途径之一，具有较强的可行性。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种重楼皂苷类化合物在制备抑制pd-1与pd-l1相互作用药物中的应用。
[0007]
本发明的第二个目的是提供一种包括上述重楼皂苷类化合物的组合物。
[0008]
本发明的第三个目的是提供一种重楼皂苷类化合物在制备治疗pd-1/pd-l1介导的相关疾病的药物中的用途。
[0009]
本发明的技术方案概述如下：
[0010]
重楼皂苷类化合物在制备抑制pd-1/pd-l1相互作用药物中的应用，所述重楼皂苷类化合物为重楼总皂苷、重楼皂苷ⅰ、重楼皂苷ⅱ、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷ⅵ和重楼皂苷ⅶ中的一种或多种。含有上述重楼皂苷类化合物的组合物，所述组合物包含药用载体或赋形剂。
[0011]
重楼皂苷类化合物在制备治疗pd-1/pd-l1介导的相关疾病的药物中的用途。所述相关疾病为肿瘤、自身免疫疾病、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病或真菌感染性疾病。
[0012]
含有上述重楼皂苷类化合物的组合物在制备治疗pd-1/pd-l1介导的相关疾病的药物中的用途。所述相关疾病为肿瘤、自身免疫疾病、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病或真菌感染性疾病。
[0013]
本发明的优点：实验证明本发明的重楼皂苷类化合物具有显著抑制pd-1/pd-l1相互作用的活性，提示本发明的重楼皂苷类化合物可用作pd-1/pd-l1相互作用的抑制剂，制备治疗pd-1/pd-l1介导的相关疾病的药物。
具体实施方式
[0014]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0015]
实施例1
[0016]
化合物1～6的制备，包括如下步骤：
[0017]
(1)中药重楼的干燥块茎，经粉碎机粉碎，过二号筛，得重楼粉末。
[0018]
(2)取200g重楼粉末，用2l体积浓度为60％乙醇水溶液(乙醇水溶液、甲醇水溶液和乙腈水溶液均为体积浓度，以下同)回流提取2h，静置，收集提取液。重复3次，合并提取液，减压浓缩后获得提取物14g。
[0019]
(3)14g提取物经mci树脂(chp20/p120)柱层析色谱(色谱柱直径为5cm,长度为40cm)，分别用1l的水、1l的30％甲醇水溶液和1l的80％甲醇水溶液依次洗脱，其中80％甲醇水溶液洗脱液减压浓缩，得到重楼总皂苷(5.1g)。取1g的重楼总皂苷，用20ml甲醇溶解，经sephadex lh-20柱色谱(色谱柱直径3.5cm,长度1.5m)，用1.5l甲醇洗脱，前800ml洗脱液收集,减压浓缩干燥，得到cl-1，中间后300ml洗脱液收集，减压浓缩干燥，得到cl-2，最后400ml洗脱液收集,减压浓缩干燥，得到cl-3；
[0020]
(4)cl-1经制备型高效液相色谱(色谱柱grace rpc
18
,5μm,250
×
20mm,检测波长203nm)分离，流速为8ml/min，用体积浓度为50％的乙腈-水溶液等度洗脱，分别收集tr＝18.0min和33.0min的部分，减压浓缩干燥，得到化合物1(11mg)和2(24mg)。cl-2经制备型高效液相色谱(色谱柱grace rpc
18
,5μm,250
×
20mm,检测波长203nm)分离，流速为8ml/min，用体积浓度为60％的乙腈-水溶液等度洗脱，分别收集tr＝18.0min和24min的部分，减压浓缩干燥，得到化合物3(11mg)和4(24mg)。cl-3经制备型高效液相色谱(色谱柱grace rpc
18
,5μm,250
×
20mm,检测波长203nm)分离，流速为8ml/min，用体积浓度为50％的乙腈-水溶液等度洗脱，分别收集tr＝21.0min的部分，减压浓缩干燥，得到化合物5(11mg)。
[0021]
(5)通过
13
c nmr波谱确定了化合物1-5的结构分别为重楼皂苷ⅶ，重楼皂苷ⅵ，重楼皂苷ⅱ，纤细薯蓣皂苷，和重楼皂苷ⅰ。
[0022]
实验例
[0023]
实施例1获得的重楼总皂苷及其中的重楼皂苷类化合物对pd-1/pd-l1相互作用抑制活性评价
[0024]
试剂：pd-1/biotinylated/:pd-l1inhibitor screening elisaassay pair试剂盒(购于美国acrobiosystems公司)
[0025]
实验步骤：
[0026]
本试验采用简单的比色酶联免疫吸附试验平台，测量固定的人pd-l1和自生物素标记的pd-1蛋白之间的结合。从而用于快速高通量筛选pd-1和pd-li抑制剂，按照试剂盒标准操作说明书进行检测，主要实验步骤如下：
[0027]
1)将人pd-l1固定在96孔板中；
[0028]
2)加入待测重楼总皂苷或化合物1～5，或阳性药anti-pd-1neutralizing antibody ab con溶液
[0029]
3)加入生物素标记的pd-1蛋白，使其与pd-l1结合；
[0030]
4)加入链霉亲和素-hrp，然后加入tmb或其他hrp比色底物
[0031]
5)用酶标仪检测450nm的吸光度值，根据吸光度值计算每个化合物对pd-1/pd-l1结合的抑制率；
[0032]
对制备获得的新型生物碱类化合物对pd-1/pd-l1结合抑制作用进行评价，活性结果表明获得的新型生物碱类化合物具有一定的抑制pd-1/pd-l1结合的能力，活性结果见表1。
[0033]
表1.化合物对pd-1/pd-l1结合抑制活性
[0034][0035]
本发明的化合物、包括该化合物的组合物、该化合物的盐及包括该盐的组合物，按照常规技术手段，与药学上可接受的载体、和/或赋形剂，制成适用于口服或注射等应用形式制剂，例如，按常规技术，加入药物可接受的载体和/或赋形剂制成片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、针剂等。
[0036]
上述各制剂在制备治疗pd-1/pd-l1介导的相关疾病的药物中的用途。相关疾病为肿瘤、自身免疫疾病、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病或真菌感染性疾病。
[0037]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本领域的普通技术
人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。