用钙强化的基于乳清的营养组合物的制作方法

1.本发明涉及适合于婴儿营养的用钙强化的基于乳清的营养组合物，这些营养组合物包括婴儿配方食品(if)和成长乳(gum)。
2.导言
3.大部分的全球人口不会食用推荐日摄入量(rdi)的钙(ca)，进而对人类健康产生影响。ca缺乏可引起可能影响许多器官和生理功能的疾病。具体地，婴儿和幼儿的正常生长和发育需要ca。
4.当用不溶性或可溶性ca盐或实际上用两者的组合来强化基于乳的营养组合物时，存在许多技术和配制挑战。通常用于if和gum组合物的强化中的可溶性ca盐包括乳酸钙、氯化钙和葡糖酸钙，但是将它们添加到营养配制物中通常对加工期间系统的热稳定性和ph稳定性以及ca盐的效力具有有害影响。这种不稳定性可最终导致蛋白质聚集和胶凝，从而使制造可接受的营养组合物具有挑战性。
5.另一方面，对于不溶性ca盐诸如碳酸钙、磷酸钙和柠檬酸钙，将它们添加到营养配制物中通常导致感官上的缺陷，诸如白垩状和沉降。
6.一般来讲，掺入附加的钙可能对作为指定用水重构的粉末提供的营养组合物的溶解度具有负面影响，如例如在婴儿配方食品的情况中。
7.此外，矿物质(包括ca)的功效受到生物系统中存在的所述矿物质的浓度的影响，并且这主要通过吸收和转运来确定。认为饮食吸收是影响ca生物利用率的主要因素。例如，一些食物基质中诸如植酸盐和草酸盐等组分的存在构成对包括ca在内的二价金属吸收的主要饮食障碍，因为在人类胃肠道中缺乏植酸盐水解酶，因此这些金属螯合剂形成不溶性ca络合物，使此类矿物质不可用[holm,p.b.等人，“transgenic approaches in commonly consumed cereals to improve iron and zinc content and bioavailability”，《j.nutr.》，2002年，第132卷，第514s-516s页]。从此类络合物回收游离ca具有挑战性，并且可出现ca缺乏。
[0008]
因此，看似充足的饮食ca摄入仍然可能造成一些问题，因为在中性到略微碱性的肠腔中不溶性盐的沉淀和形成导致小肠中可吸收的量不足。
[0009]
确保足够的ca摄入的一种解决方案是将维生素d与ca盐共同施用(这可增强ca吸收)以及通过活化膜结合钙转运蛋白—钙结合蛋白d9k。一种另选方法是用衍生自乳蛋白质的可商购获得的酪蛋白磷酸肽(cpp)来强化营养组合物。用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理酪蛋白会释放cpp，cpp主要以其结合钙的能力而为人熟知[donida,b.m.等人，“casein phosphopeptides promote calcium uptake and modulate the differentiation pathway in human primary osteoblast-like cells”，《peptides》，2009年，第30卷，第2233-2241页]，但也结合铁和锌。cpp具有不同的螯合能力，这取决于释放它们的特定酪蛋白亚单位。例如，与来自β-酪蛋白的cpp络合的铁吸收高于来自α-s1-cpp-铁络合物的铁吸收[kibangou,i.b.等人，“milk proteins and iron absorption:contrasting effects of different caseinophosphopeptides”，《pediatr.res.》，2005年，第58卷，第731页]。
[0010]
因此，开发满足配制要求和消费者要求并且以对消费者(具体地对婴儿和幼儿)最有益的方式提供ca的营养组合物仍然具有挑战性。
[0011]
仍然需要提供具有可接受的感官和物理化学特性(包括ph和热稳定性)的ca强化的营养组合物。仍然需要提供具有足够的溶解度以易于用水重构的ca强化的营养组合物，如例如在以粉末形式提供给消费者的婴儿配方食品的情况下。仍然需要提供当施用时可递送生物可利用的ca的ca强化的营养组合物。
[0012]
需要提供适合施用给婴儿和幼儿的有价值的营养组合物。
[0013]
本发明人已经开发了用于营养组合物，具体地用于婴儿配方食品(if)和成长乳(gum)的钙强化的、基于乳的营养成分，以(具体地)施用给婴儿和幼儿。包含钙强化的基于乳的营养成分的营养组合物提供高含量的生物可利用的钙。


技术实现要素：

[0014]
在第一方面，本发明涉及一种钙强化的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(α-lac wpc)，其中蛋白质的钙结合位点的至少80％被钙离子占据。
[0015]
根据一个实施方案，本发明涉及一种钙强化的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(α-lac wpc)，其中蛋白质的钙结合位点的至少90％被钙离子占据。
[0016]
根据一个实施方案，处于蛋白质结合状态的钙强化的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(α-lac wpc)中的钙百分比为至少68％，优选为75％，优选为至少80％。
[0017]
根据本发明的一个实施方案，在2mm钙溶液中以1％w/w的蛋白质浓度进行蛋白质结合的钙百分比的测量。
[0018]
根据本发明的另一个实施方案，上述钙强化的α-lac wpc的钙含量为200mg/100g-600mg/100g的钙强化的α-lac wpc。
[0019]
根据本发明的另一个实施方案，上述钙强化的α-lac wpc的α-lac百分比大于β-乳球蛋白的百分比，优选地，β-乳球蛋白浓度小于α-lac含量的百分比减去7％。
[0020]
根据本发明的另一个实施方案，在上述钙强化的α-lac wpc中，磷脂浓度为至少3％w/w，优选为至少4％。
[0021]
根据本发明的另一个实施方案，根据权利要求1至5中任一项所述的上述钙强化的α-lac wpc通过以下方式产生：
[0022]
(i)提供富含α-lac的wpc，其中α-lac处于失钙载脂蛋白状态，然后
[0023]
(ii)使载脂蛋白形式的α-lac wpc沉淀，
[0024]
(iii)将步骤(ii)中获得的载脂蛋白形式的α-lac wpc与钙盐混合。
[0025]
在第二方面，本发明涉及一种营养组合物，该营养组合物包含本发明的前述实施方案中的任一个实施方案，即钙强化的α-lac wpc。
[0026]
根据本发明的一个实施方案，上述营养组合物可为婴儿配方食品(if)(包括早产if、1段if(也称为阶段1if)、较大婴儿配方食品(也称为阶段2if并且可包括阶段3if))或成长乳(通常对应于阶段3if和阶段4if)、用于老年患者的营养补充剂、用于绝经期女性或围绝经期女性或绝经后女性的营养补充剂、或用于动物的营养组合物(例如，宠物食物组合物)。
[0027]
根据本发明的另一个实施方案，上述营养组合物的钙含量为200mg/100g-3200mg/
100g。
[0028]
根据本发明的一个实施方案，上述营养组合物的钙含量为260mg/100g-750mg/100g，例如在阶段1婴儿配方食品(0-6个月)的情况下。
[0029]
根据本发明的一个实施方案，上述营养组合物的钙含量为400mg/100g-1000mg/100g，例如在阶段2婴儿配方食品(6-12个月)的情况下。
[0030]
根据本发明的一个实施方案，上述营养组合物的钙含量为400mg/100g-2750mg/100g，例如在阶段3婴儿配方食品(12-36个月)的情况下。
[0031]
根据本发明的一个实施方案，上述营养组合物的钙含量为520mg/100g-3200mg/100g，例如在另外被称为成长乳(gum)的阶段4婴儿配方食品(3-8岁)的情况下。
[0032]
根据本发明的一个实施方案，上述营养组合物的钙含量为260mg/100g-750mg/100g，例如在用于老年人或用于围绝经期女性、绝经后女性或绝经期女性的营养组合物的情况下。
[0033]
在第三方面，本发明涉及一种用于提供根据权利要求1至6中任一项所述的钙强化的α-lac wpc的方法，该方法包括以下连续步骤：
[0034]
(i)提供wpc，其中α-lac处于失钙载脂蛋白状态，
[0035]
(ii)使载脂蛋白形式的α-lac沉淀以提供富含α-lac的wpc，
[0036]
(iii)将步骤(ii)中获得的载脂蛋白形式的α-lac wpc与钙盐混合。
[0037]
根据本发明的另一个实施方案，根据权利要求11所述的上述方法，其中通过将wpc溶液的ph降低至低于4的ph来实现钙流失以获得载脂蛋白状态α-lac。
[0038]
根据本发明的另一个实施方案，根据权利要求11-12中任一项所述的上述方法，其中钙盐选自以下物质中的一种或多种：碳酸钙、氯化钙、葡糖酸钙、氢氧化钙、苹果酸钙、乳酸钙和富马酸钙、柠檬酸苹果酸钙、乳酸苹果酸钙和乳酸柠檬酸钙。
附图说明
[0039]
图1：对于由以下物质制备的ph为6.80的1％蛋白质溶液，离子钙的浓度(mm)随氯化钙浓度(mm)的变化：乳清蛋白分离物(wpi；—
■
—)、乳清蛋白浓缩物(wpc；—
▲
—)、通过膜过滤制造的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(lac-m；—
□
—)、通过选择性蛋白质沉淀制造的富含α-乳白蛋白的原始乳清蛋白浓缩物(lac-p o；—δ—)、通过选择性蛋白质沉淀制造的富含α-乳白蛋白的脱脂乳清蛋白浓缩物(lac-p d；—
◇
—)和通过离子交换制造的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(lac-ie；—
○
—)。
[0040]
图2：对于由以下物质制备的ph为6.80的1％蛋白质溶液，ph随氯化钙浓度(mm)的变化：乳清蛋白分离物(wpi；—
■
—)、乳清蛋白浓缩物(wpc；—
▲
—)、通过膜过滤制造的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(lac-m；—
□
—)、通过选择性蛋白质沉淀制造的富含α-乳白蛋白的原始乳清蛋白浓缩物(lac-p o；—δ—)、通过选择性蛋白质沉淀制造的富含α-乳白蛋白的脱脂乳清蛋白浓缩物(lac-p d；—
◇
—)和通过离子交换制造的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(lac-ie；—
○
—)。
[0041]
图3：对于由以下物质制备的ph为6.80的1％蛋白质溶液，颗粒的体积平均直径随氯化钙浓度(mm)的变化：乳清蛋白分离物(wpi；—
■
—)、乳清蛋白浓缩物(wpc；—
▲
—)、通过膜过滤制造的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(lac-m；—
□
—)、通过选择性蛋白质沉
淀制造的富含α-乳白蛋白的原始乳清蛋白浓缩物(lac-p o；—δ—)、通过选择性蛋白质沉淀制造的富含α-乳白蛋白的脱脂乳清蛋白浓缩物(lac-p d；—
◇
—)和通过离子交换制造的富含α-乳白蛋白的乳清蛋白浓缩物(lac-ie；—
○
—)。
具体实施方式
[0042]
不能将本说明书中对现有技术文献中的任何参照视为承认此类现有技术为众所周知的技术或形成本领域普遍常识的一部分。
[0043]
如本说明书中所用，词语“包括”、“包含”和类似词语不应理解为具有排他性或穷举性的含义。换句话讲，这些词语旨在意指“包括，但不限于”。
[0044]
如本文所用，术语“营养组合物”包括但不限于完全营养组合物、部分或不完全营养组合物、营养补充剂、以及特定于疾病或病症的营养组合物。
[0045]
如本文所用，术语“营养补充剂”或“饮食补充剂”是指为个体提供所述个体可能无法以其它方式足量消耗的营养物质的营养产品。
[0046]
如本文所用，术语“食物产品”是指可供人类或动物安全食用的任何种类的产品。所述食物产品可以是固体、半固体或液体形式，并且可包含一种或多种营养物质、食物或营养补充剂。例如，食物产品可另外包含以下营养物质和微量营养物质：蛋白质源、脂质源、碳水化合物源、维生素和矿物质。该组合物还可含有抗氧化剂、稳定剂(以固体形式提供时)或乳化剂(以液体形式提供时)。
[0047]
如本文所用，术语“婴儿配方食品”是指替代人乳或除人乳之外施用于婴儿和学步儿的组合物。婴儿配方食品(也称为“配方食品”)由美国联邦食品、药品和化妆品法案(u.s.federal food,drug,and cosmetic act，ffdca)定义为“由于模拟人乳或作为人乳的完全或部分替代品的适用性而意图作为或仅针对特殊膳食使用而表示为婴儿食物的食物”。其还由欧洲法规(1991年5月14日关于婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的委员会指令(9 1/32i/eec))和由食品法典委员会发布的指南“婴儿配方食品及特殊医用婴儿配方食品标准”codex stan 72-1981(2015版)来定义，“婴儿配方食品及特殊医用婴儿配方食品标准”在1981年采纳为全球标准，1983年、1985年、1987年、2011年和2015年修正，2007年修订)。
[0048]
婴儿配方食品可含有例如牛乳乳清蛋白和酪蛋白作为蛋白质来源、植物油的共混物作为脂肪来源、乳糖作为碳水化合物来源、维生素和矿物质混合物以及其它成分，具体取决于制造商。用于对其它牛乳蛋白质过敏的婴儿的婴儿配方食品可包含大豆作为蛋白质来源来替代牛乳，或者可包含部分水解或深度水解的牛乳蛋白质。婴儿配方食品还可基于绵羊奶、山羊奶、骆驼奶或水牛奶。可特别配制婴儿配方食品以满足婴儿在出生后前六个月内(1段配方食品)或六个月以后(较大婴儿配方食品)的营养需求。早产婴儿或低出生体重婴儿if也可用于早产婴儿或低出生体重婴儿。
[0049]
术语“成长乳”或“gum”是指已用铁或其它矿物质和维生素强化的乳(通常是牛乳)；通常旨在施用于12个月以上的婴儿，直到他们达到约36个月。
[0050]
术语“围绝经期女性”是指处于即将发生绝经之前的一段时期内的女性。
[0051]
本发明人已经开发了一种营养系统，该营养系统有利于将相对较大量的钙(具体地以生物可利用的形式)掺入到基于乳的产品中。具体地，本发明人已经通过用钙强化特定
形式的富含α-乳白蛋白(α-lac)的乳清蛋白浓缩物(wpc)，具体地通过将特定形式的富含α-乳白蛋白(α-lac)的乳清蛋白浓缩物与至少一种可溶性钙盐混合来实现这一点。
[0052]
因此，本发明人已经识别并利用了某种形式的富含α-lac的乳清蛋白浓缩物(wpc)的有利特性以掺入高含量的钙，并由此产生适合掺入到营养组合物中的富含钙的基于乳清的成分。
[0053]
富含α-乳白蛋白(α-lac)的乳清蛋白浓缩物(wpc)
[0054]
乳清蛋白具有有吸引力的营养、功能、生理和药理特性。乳清中的蛋白质主要分成两组：1)球蛋白级分，该球蛋白级分主要含有β-乳球蛋白(β-lg)和免疫球蛋白(ig)；和2)白蛋白级分，该白蛋白级分包括α-乳白蛋白(α-lac)和血清白蛋白，α-lac通常占人乳中总蛋白质的约40重量％，而牛乳仅含有按总蛋白质的重量计约4％-5％的α-lac。β-lg不存在于人乳中。
[0055]
α-lac是必需氨基酸诸如色氨酸、赖氨酸和半胱氨酸的重要来源。人α-lac蛋白质与牛α-lac共享其氨基酸序列的72％。因此，用于婴儿和幼儿的营养配制物中的富含α-lac的牛乳清蛋白可在婴儿配方食品的母乳化方面满足特定的营养要求，从而导致与人乳的组成匹配更加完美。
[0056]
ep1455585 b1公开了包含改性的乳清蛋白浓缩物的if营养组合物，该改性的乳清蛋白浓缩物包含特定量的α-lac和β-lg。美国专利us6312755描述了在处理牛乳清蛋白中实现高浓度的α-lac的方法。
[0057]
可使用技术人员已知的不同方法诸如膜过滤、离子交换、选择性蛋白质沉淀、选择性蛋白质水解或这些方法的组合来实现富含α-lac的乳清蛋白浓缩物(α-lac wpc)的工业制造[fox,p.f.，2001年，“milk proteins as food ingredients”，《international journal of dairy technology》，第54卷，第41-55页；kamau,s.m.等人，2010年，“alpha-lactalbumin:its production technologies and bioactive peptides”，《comprehensive reviews in food science and food safety》，第9卷第2期，第197-212页]。通过膜过滤而富含乳清蛋白成分中的α-lac可使用具有不同孔径的级联式膜(即300kda超滤(uf)，随后30kda uf)与荷电膜结合进行，以选择性地渗透α-lac。通过离子交换技术获得的α-lac wpc通常使用选择性吸附(阴离子交换)制备，或者另选地通过在远离α-lac的pi调整的ph值下选择性洗脱(阳离子交换)来制备。
[0058]
本发明人已经发现，通过形成载脂蛋白形式的α-lac，然后使wpc富含，优选地通过使该载脂蛋白形式α-lac选择性沉淀产生的富含α-lac的乳清蛋白浓缩物(α-lac wpc)然后可与钙盐组合以产生具有非常高钙含量的钙强化的α-lac wpc。具体地，呈蛋白质结合形式的钙比例大于当使用通过离子交换或膜过滤方法产生的α-lac wpc时得到的钙比例。与未与α-lac wpc浓缩物中的蛋白质缔合的钙相比，这种蛋白质结合形式的钙具有更高的生物利用度。
[0059]
具体地，本发明人已经发现，通过以下步骤制备的富含α-lac的wpc：
[0060]
(i)首先任选地通过使用钙结合盐和/或改变ph来实现失钙载脂蛋白状态，然后
[0061]
(ii)优选通过使载脂蛋白形式的α-lac沉淀来使wpc富含α-lac
[0062]
导致如此产生的α-lac具有随后结合以外源方式添加的ca的出乎意料的优异能力，这种能力超出人们的期望。
[0063]
通常，上述步骤(i)和(ii)可通过技术人员已知的任何方式进行。根据本发明的一个实施方案，步骤(i)和(ii)根据美国专利申请us 6,312,755(具体地第4栏第8-44行)中描述的方法进行。简言之，可以任何常规方式制备初始乳清蛋白浓缩物(wpc)起始产物。例如，乳清蛋白浓缩物可从脱脂和/或澄清的乳清获得。乳清可通过常用方法浓缩和/或脱盐，例如通过超滤和/或渗滤。例如，起始材料可为干酪或酸性酪蛋白乳清，或者为通过使用5-50k mwco膜超滤而浓缩以提供基于固体计具有约30％-80％蛋白质的乳清蛋白浓缩物的相同乳清。
[0064]
然后，通常为了实现wpc的钙流失(上述步骤(i))以产生处于载脂蛋白状态的α-lac，可将未浓缩或浓缩的乳清的ph降低至ph 4.0或以下。这可通过将在初始超滤或渗滤步骤之后获得的wpc渗透物与足够量和浓度的酸混合来实现，以将渗透物的ph降低至4.0或以下。ph优选降低至约3.3-3.8之间的范围，其中约3.5是最优选的。酸优选为食品级的酸，诸如盐酸、磷酸、柠檬酸和硫酸。优选的酸为盐酸。温度在该步骤中并不重要。该ph降低步骤致使钙离子与α-lac分子解离。
[0065]
us 6,312,755第4栏第19-44行描述了可用于获得适合作为用于钙强化的起始材料的α-lac wpc的另外的处理步骤，以产生根据本发明的实施方案的营养组合物。这些步骤可应用于本文。
[0066]
简言之，优选通过例如用去离子水稀释渗余物而诱导使α-lac和其它蛋白质沉淀来获得富含α-lac的wpc产物。这在us 6,312,755第4栏中有所指示：“稀释渗余物直到其含有约2％-12％的蛋白质，并且优选含有约4％-10％的蛋白质。然后将ph调节至4-5的范围，并且优选的范围为4.5-4.7。许多碱性试剂诸如naoh和koh可用于此目的。稀释和ph调节步骤在介于约10℃-55℃，优选25℃-40℃之间的温度范围内进行。沉淀通常在2小时内完成。”[0067]
根据本发明的一个实施方案，步骤(i)中α-lac的钙流失也可通过在与蛋白质相比钙优先被螯合剂结合的ph下将wpc与钙流失螯合物一起温育来进行。
[0068]
根据本发明的一个实施方案，在步骤(i)中形成富含α-lac的wpc之后，可在步骤(ii)中进行钙强化。
[0069]
通过本文所述的方法形成的(钙强化的)富含α-乳白蛋白的wpc还用作蛋白质(例如α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)来源。所获得的(钙强化的)富含α-乳白蛋白的wpc可包含浓度在总蛋白质的约28％至40％(例如总蛋白质的约28％至36％)范围内的α-乳白蛋白和浓度在总蛋白质的约8％至约33％(例如总蛋白质的10％至约29％)范围内的β-乳球蛋白。富含α-乳白蛋白的wpc中的α-乳白蛋白的百分比大于β-乳球蛋白的百分比，例如β-乳球蛋白浓度不大于α-乳白蛋白含量的百分比减去7％。
[0070]
除非另有说明，否则本文公开的有关(钙强化的)富含α-乳白蛋白的wpc的所有百分比均基于重量百分比。
[0071]
步骤(ii)：来自步骤(i)的α-lac wpc的钙强化
[0072]
通常通过混合富含α-lac的wpc(其中α-lac处于载脂蛋白状态(如上所述))与合适的钙来源(具体地可溶性钙盐的溶液或悬浮液)来产生钙强化的富含α-lac的wpc。
[0073]
对于添加钙盐，应使富含α-lac的wpc的ph高于5，优选高于6，并且最佳地在6.5-7的范围内，以确保最大程度的钙结合。
[0074]
可溶性钙盐可选自无机或有机可溶性盐。优选的可溶性钙盐可选自：碳酸钙、氯化
钙、葡糖酸钙、氢氧化钙、苹果酸钙、乳酸钙和富马酸钙，或混合盐诸如柠檬酸苹果酸钙、乳酸苹果酸钙和乳酸柠檬酸钙。
[0075]
可溶性钙盐的溶液可按例如0.25mm-5mm、优选1mm-4mm、最优选2mm-3mm的浓度提供。
[0076]
根据本发明的一个优选实施方案，富含α-lac的wpc可与可溶性钙盐的溶液混合合适的时间，例如30分钟或长达2小时或3小时或4小时或更久。
[0077]
通常，该步骤在大于5的ph下进行，例如在6-7范围内，例如在6.8的ph下进行。通常，该步骤在约2℃-16℃、优选4℃-12℃、最优选4℃-6℃的温度进行。
[0078]
钙强化的富含α-lac的wpc的作用
[0079]
本发明人已经发现，通过选择特定类型的富含α-lac的wpc允许他(她)们实现高百分比的蛋白质结合的钙。这些含量令人惊讶地高，并且当使用通过膜过滤或离子交换方法产生的富含α-lac的wpc时不能达到。
[0080]
实际上，将α-lac wpc(其中α-lac处于载脂蛋白状态(如根据上述步骤(i)所述))与ca盐溶液混合得到富含ca的α-lac wpc，该富含ca的α-lac wpc与通过将相同的ca盐溶液与以下物质中的任一者混合获得的wpc相比具有更高百分比的蛋白质结合的钙/总钙：
[0081]-未改性的wpc，
[0082]-乳清蛋白分离物(wpi)，
[0083]-通过离子交换方法产生的α-lac wpc(α-lac wpc ie)，或
[0084]-通过膜过滤方法产生的α-lac wpc(α-lac wpc m)。
[0085]
因此，通过沉淀法产生的富含载脂蛋白α-lac的wpc经证明是用于进一步的钙富集的出人意料有效的起始材料。
[0086]
实施例1描述了一组实验，这些实验比较和表征了使用三种不同的富含α-lac的wpc起始材料：lac-m(通过膜过滤获得)、lac-p(通过根据us6,312,755第4栏第8-44行中描述的方法使失钙载脂蛋白形式沉淀而获得)和lac-ie(通过离子交换获得)产生的用钙强化的基于乳清的营养产物。还包括另外的脱脂lac-p-d样品以供分析。
[0087]
该实施例表明，蛋白质图谱和富含α-lac的wpc成分的物理状态的差异强烈影响所添加的离子钙与蛋白质成分的亲和力和结合。
[0088]
实施例1中离子钙的测量和cacl2滴定表明，无论磷脂是否存在，根据本发明的一个实施方案的lac-p成分与wpi、wpc、lac-m和lac-ie成分相比具有更高的ca
2
结合能力。
[0089]
有趣的是，lac-m和wpc的初始[ca
2
](即，固有[ca
2
]，分别为0.58mm和1.96mm)比其它样品显著更高(p《0.05)。对于所有成分，测量到[ca
2
]随着添加的cacl2的增加而增大，对于样品wpc、wpi、lac-m和lac-ie，[ca
2
]和所添加的cacl2浓度之间的关系接近线性(图1)；相比之下，lac-p显示出随着所添加的cacl2的变化，[ca
2
]呈线性度明显更低的增加(更加呈凹形)，这表明lac-p成分中的蛋白质比wpi、wpc、lac-m和lac-ie成分中的蛋白质具有更高的ca
2
结合能力。处于其原始(lac-p o)和脱脂(lac-p d)状态的lac-p成分显示出在[ca
2
]和cacl2之间非常相似的关系，这表明脂肪/磷脂(pl)材料不显著影响ca
2
结合。
[0090]
一般来讲，由于蛋白质和离子之间的相互作用导致的氢离子的释放，并且还由于磷酸钙的形成和随后氢离子的释放，因此向蛋白质溶液添加可溶性钙盐(例如，cacl2)会降低ph。本发明人也观察到这一点(参见图2)，因为lac-p成分在所有样品中显示出最大δph。
[0091]
粒度分布(psd)参数的数据，包括如使用动态光散射(dls)测量的蛋白质溶液的体积平均直径(vmd)随[cacl2]的变化报告于图3中。
[0092]
在所添加的cacl2为零时，wpi的psd和vmd值与先前所报告的psd和vmd值近似。对于除lac-ie(其具有单峰psd)之外的所有成分均观察到双峰psd(即，峰1对应于较小尺寸材料并且峰2对应于较大尺寸材料)。
[0093]
样品的vmd(图3)在0至2mm cacl2的范围内保持基本上不变。在cacl2浓度大于3mm时，lac-p d的vmd显著增大，然后wpi和lac-p o的vmd也显著增大。与lac-p o相比，去除脂肪和pl材料(即lac-p-d)导致在大于2mm的cacl2浓度下颗粒的平均体积直径更大。磷脂(pl)对蛋白质粒度的这种稳定作用可归因于乳清蛋白和pl之间的相互作用。
[0094]
等温滴定量热法(itc)用于更好地理解和定量该研究中ca
2
与蛋白质成分结合的热力学特性。itc通过测量在恒定温度(即，25℃)下当配体(即，来自cacl2的ca)与蛋白质的特定位点结合时产生的热流来确定此类相互作用的热力学特性。所获得的热力学常数(即δg、δh、-tδs、kd、n)示于实施例1的表1中。
[0095]
成分wpi、wpc和lac-m具有正焓(δh)和负熵(-tδs)，其中δh的值分别为70.1kcal/mol、22.2kcal/mol、80.6kcal/mol，并且-tδs的值分别为-86.3kcal/mol、-27.7kcal/mol和-86.0kcal/mol。相比之下，针对lac-p o、lac-p d和lac-ie确定的δh的值显著不同(p《0.05)，其中δh的值分别为-17.4kcal/mol、-28.3kcal/mol、-2.02kcal/mol，并且-tδs的值分别为8.24kcal/mol、19.1kcal/mol和-4.69kcal/mol。这些结果证实了ca
2
与两种型式(即lac p-o和lac p-d)中的lac-p成分的高亲和力和结合；不受理论的约束，ca和lac-p中的蛋白质之间的相互作用可能归因于结合ca
2
的α-lac的载脂蛋白状态。对于lac-ie，观察到对ca
2
的较弱亲和力，这与滴定热谱曲线(数据未示出)一致，因为在初始进样时观察到吸热峰。
[0096]
在过滤通过10kda mwco过滤器之前和之后，通过原子吸收光谱(aas)确定已添加2mm cacl2的1％w/v蛋白质溶液的ca含量(表1)。
[0097]
lac-p o和lac-p d显示出最高比例的与蛋白质结合的总ca，它们的最高比例分别为81.8％和69.4％。这些结果与作为不同的亲和力常数(kd)和化学计量(n)的itc数据一致。
[0098]
因此，无论是否呈其原始形式或其脱脂(脱去磷脂)形式，钙强化的富含α-lac的wpc提供最高比例的蛋白质结合的钙。
[0099]
因此，与以未结合蛋白质的形式提供的钙相比，根据本发明的钙强化的富含α-lac的wpc通常提供具有优异的生物利用度的钙。这种优异的钙生物利用度在维持婴儿和幼儿的健康生长和发育方面是重要的。同样重要的是将钙递送给老年患者，例如递送给围绝经期女性或绝经后女性以及绝经期女性。
[0100]
因此，本发明人已经提供了富含营养物质的基于乳清的营养组合物，该营养组合物因富含α-lac以及高钙含量，特别是蛋白质结合形式中高百分比的钙而具有许多营养优势，特别是对于婴儿、幼儿。可将钙强化的富含α-lac的wpc引入到if和gum中作为富含营养物质的成分。
[0101]
通过临床试验发现，若干种营养和生理有益效果与if中富含α-lac相关联，因为已经在母乳喂养婴儿和imf喂养婴儿之间发现关于生长参数(即，体重增加和人体测量分析)、
胃肠道耐受性(即，消化性、降低的过敏性和改善的肠道菌群)和激素调节(即，血清素调节)的相似性。此外，增加α-lac含量也显著改变wpc的功能特性，因为包含α-lac导致热稳定性增强、粘度降低并且蛋白质-蛋白质相互作用减少，这些特性在营养产品的配制和加工期间至关重要(buggy,a.k.(2017a)，“stabilising effect ofα-lactalbumin on concentrated infant milk formula emulsions heat treated pre-or post-homogenisation”，《dairy science and technology》，第96卷，第845-859页)。
[0102]
由本发明人制备的钙强化的富含α-lac的wpc中蛋白质结合的ca的比例增加意味着成分可以与以未结合蛋白质的形式递送的钙相比具有更高生物利用度的形式向婴儿或幼儿递送钙，例如简单地作为存在于if配制物中的可溶性盐。
[0103]
如上所论述，提供给婴儿或幼儿的钙的吸收是满足日常钙需求的关键决定因素。本文提供的组合物使得钙能够以可被吸收的形式递送给婴儿或幼儿，并因此可满足每日摄入要求。
[0104]
本发明人还假设，在本发明的钙强化的富含α-lac的wpc中提供的蛋白质结合的钙形式可在粉末营养组合物中，例如在婴儿配方食品中提供更好的稳定性，而不会负面影响组合物的感官特性。
[0105]
包含钙强化的富含α-lac的wpc的营养产品
[0106]
递送较大量并且呈其最佳(即生物可利用的)形式的钙在婴儿的最年幼发育阶段期间的确至关重要。
[0107]
受权利要求书保护的钙强化的富含α-lac的wpc也可用于宠物营养的情况下，尤其是对于用于幼小宠物的营养组合物，尤其是在生长和发育的早期。
[0108]
上文已经描述的包括钙强化的富含α-lac的wpc的营养组合物通常包括婴儿配方食品(if)和成长乳(gum)，该婴儿配方食品包括用于早产/低出生体重婴儿的if、1段if、较大婴儿if。
[0109]
用于婴儿或儿童的合成营养组合物的另外的非限制性示例为旨在添加人类母乳或用人类母乳稀释的用于婴儿的组合物、或旨在供婴儿和/或儿童单独食用或与人类母乳组合食用的食料。
[0110]
钙强化的富含α-lac的wpc可例如以足以提供每100可用千卡1g至1.2g的蛋白质，相当于每100可用千卡0.28g至0.48g的α-乳白蛋白或每升1.88g至3.23g的α-乳白蛋白的量使用。
[0111]
根据本发明的一个实施方案，提供了一种用于婴儿或儿童的合成营养组合物，该合成营养组合物包含如本文所公开获得的钙强化的富含α-lac的wpc。
[0112]
在一个实施方案中，合成营养组合物包含钙强化的富含α-lac的wpc，其浓度在0.8g/l至10g/l，例如0.8g/l至8g/l、0.8g/l至5g/l、0.85g/l至4.5g/l、3g/l至4.5g/l的范围内。
[0113]
在本发明的另一个实施方案中，该组合物还包含α-乳白蛋白，其浓度在人类母乳中存在的范围内，例如在1.6g/l至3.8g/l的范围内，例如1.7g/l至3g/l。
[0114]
婴儿配方食品制造商的一个目标是模拟人类母乳的组合物。然而，人类母乳的组合物是极其动态的，并且随着时间的推移而变化。因此，用于婴儿或儿童的合成营养组合物通常以阶段为基础，其中特定阶段适合用于特定年龄范围内的婴儿或儿童，例如，阶段1可
能针对0到6个月的婴儿，阶段2可能针对6个月到12个月的婴儿，阶段3可能针对12个月至36个月的儿童，阶段4可能针对3岁至8岁的儿童。每个阶段被配制成使得其组合物被视为相对于所针对的婴儿或儿童年龄范围营养良好。
[0115]
通常，用于婴儿的粉末状组合物(例如婴儿配方食品)通常作为粉末提供；在这种情况下，它们以每60ml溶液约8.5g的量用水重构。因此，钙强化的富含α-lac的wpc的含量和钙的含量可分别以g/l或mg/l表示。
[0116]
在本发明的一个实施方案中，提供了用于婴儿或儿童的合成营养组合物，该合成营养组合物包含9g/l至10g/l，例如9.5g/l-10.2g/l的用于本发明中的钙强化的富含α-lac的wpc。在一个实施方案中，所述组合物为0至6个月的婴儿配制。在一个更具体的实施方案中，所述组合物中钙的总浓度为至少400mg/l，并且更具体地在400mg/l至1000mg/l的范围内，甚至更具体地在600mg/l至800mg/l的范围内。
[0117]
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于婴儿或儿童的合成营养组合物，该合成营养组合物包含4g/l至5g/l的用于本发明中的钙强化的富含α-lac的wpc。在一个实施方案中，所述组合物为6个月至12个月的婴儿配制。在一个更具体的实施方案中，所述组合物中钙的总浓度为至少600mg/l，并且更具体地在600mg/l至1350mg/l的范围内，甚至更具体地在800mg/l至1200mg/l的范围内。
[0118]
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于婴儿或儿童的合成营养组合物，该合成营养组合物包含3g/l至4g/l的用于本发明中的钙强化的富含α-lac的wpc。在一个实施方案中，所述组合物为12个月至36个月的儿童配制。在一个更具体的实施方案中，所述组合物中钙的总浓度为至少575mg/l，并且更具体地在575mg/l至3880mg/l的范围内，甚至更具体地在700mg/l至900mg/l的范围内。
[0119]
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于婴儿或儿童的合成营养组合物，该合成营养组合物包含0.5g/l至1.5g/l的用于本发明中的钙强化的富含α-lac的wpc。在一个实施方案中，所述组合物为3岁至8岁的儿童配制。在一个更具体的实施方案中，所述组合物中钙的总浓度为至少500mg/l，并且更具体地在520mg/l至3200mg/l的范围内，甚至更具体地在600mg/l至2500mg/l的范围内。
[0120]
用于婴儿或儿童的合成营养组合物还可包含所讨论的此类合成营养组合物(例如，婴儿配方食品)中已知待采用的任何其它成分或赋形剂。
[0121]
此类成分的非限制性示例包括：其它蛋白质、氨基酸、碳水化合物、低聚糖、脂质、益生元或益生菌、必需脂肪酸、核苷酸、核苷、维生素、矿物质和其它微量营养素。可用于婴儿或儿童的合成营养组合物中的合成营养组合物的其它合适的和所需成分，在食品法典委员会(codex alimentarius)颁发的有关所涉及的合成营养组合物类型(例如，婴儿配方食品、成长乳、人乳强化剂、较大婴儿配方食品或用来供婴儿食用的食料(例如，辅食))的指南中有描述。
[0122]
可通过将钙强化的富含α-lac的wpc与组合物中包含的其它成分简单混合来将其添加至用于婴儿或幼儿的合成营养组合物中。
[0123]
α-乳白蛋白富含必需氨基酸和有条件必需氨基酸。因此，本发明的钙强化的富含α-lac的wpc特别适用于婴儿和儿童的低蛋白质合成营养组合物，因为即使微小的蛋白质摄入，所述婴儿和儿童仍然摄入足够氨基酸以优化生长和发育，即位于标准生长曲线，例如
who标准生长曲线内。
[0124]
本发明所用的并且通过本文所述方法获得的钙强化的富含α-lac的wpc按每100克总蛋白质的克数计含有如下最小的氨基酸浓度：
[0125]
精氨酸3.1；半胱氨酸1.4；组氨酸1.6；异亮氨酸1.0；亮氨酸5.3；赖氨酸3.9；甲硫氨酸0.3；苯丙氨酸1.2；苏氨酸3.2；色氨酸1.5；酪氨酸0.9；缬氨酸1.0。因此，当使用钙强化的富含α-lac的wpc时，对于婴儿或儿童而言，可能不必将氨基酸添加至用于婴儿或儿童的合成营养组合物。非蛋白质氮含量可为总氮量的约15％或更少。总蛋白质含量可介于约12.5％至约95％，例如35％至80％或73％至77％之间。脂肪含量可为约15％或更少。灰分含量可为约4.5％或更少。在一个实施方案中，合成营养组合物为低蛋白质婴儿配方食品。低蛋白质婴儿配方食品每100kcal将包含小于3.5g的蛋白质，例如小于2.5g/100kcal或小于2g/100kcal。低蛋白质婴儿配方食品可以是针对最大12月龄的婴儿配制的婴儿配方食品，例如针对0至6月龄的婴儿，或6至12月月龄的婴儿。
[0126]
用于婴儿或儿童的合成营养组合物可通过本领域用于制备所讨论的该类合成营养组合物(例如，婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、针对婴儿的用于添加人乳或用人乳稀释的组合物(例如，人乳强化剂)、或供婴儿单独食用或与人乳组合食用的食料(例如，辅食))的熟知方法来制备。
[0127]
例如，婴儿配方食品可通过在去离子水中将适当量的钙强化的富含α-lac的wpc与脱脂乳粉、乳糖、植物油和脂肪可溶维生素共混来制备。这些材料可以共混在一起，其数量足以提供大约400克/升的最终浓度。然后可在高温/短时巴氏灭菌步骤之前将附加的(除了钙之外)矿物质盐添加至混合物。适当的附加矿物质盐包括柠檬酸钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、氯化镁、硫酸亚铁、柠檬酸钾、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁、碘化钾、亚硒酸钠等。然后可将该混合物均质化并冷却。然后可将热不稳定维生素和微量营养素添加至混合物。然后用去离子水将混合物标准化至约120克/升至约135克/升例如约123克/升的最终总固体浓度，这相当于约670千卡/升。然后可使用常规超高温或标准蒸馏方法来对该配方食品进行灭菌。然后可将该经灭菌的材料放置在适当的包装中。
[0128]
在本发明的另一个方面，提供了如本文所公开获得的钙强化的富含α-lac的wpc用于向婴儿或儿童提供优化量的钙的用途。
[0129]
用以产生钙强化的富含α-lac的wpc的方法
[0130]
本发明还涉及用以产生钙强化的富含α-lac的wpc的方法。
[0131]
通常，富含α-lac的wpc根据us 6,312,755 b1的权利要求中描述的沉淀方法产生，并且富含α-lac的wpc与钙溶液混合。
[0132]
根据本发明的一个实施方案，富含α-lac的wpc可根据包括以下步骤的沉淀方法产生：
[0133]-将乳清蛋白产物与足够量的酸混合，使得乳清蛋白产物的ph降低至4.0或以下，例如在3.3至3.8范围内的ph(诸如ph为3.5)；
[0134]-通过将酸化的乳清蛋白产物中的蛋白质浓缩直到钙与蛋白质的比率小于约0.001以形成低钙乳清蛋白产物，将酸化的乳清蛋白产物中的蛋白质分级以产生富含α-lac的乳清蛋白产物；以及使α-lac从低钙乳清蛋白产物中沉淀，所述沉淀步骤包括以下子步骤：
[0135]-稀释低钙乳清蛋白产物；
[0136]-将稀释的低钙乳清蛋白产物的ph调整到约4.0至5.0之间的范围，以形成沉淀蛋白质和可溶蛋白质；以及将沉淀蛋白质与可溶蛋白质分离，
[0137]
例如通过超滤，例如通过5k-50k分子量截留膜，和/或通过渗滤。
[0138]
在酸化步骤中，乳清蛋白产物可通过添加酸来酸化。酸可以是食品级的酸，例如盐酸、磷酸、柠檬酸和/或硫酸。如果使用乳清蛋白粉末作为乳清蛋白产物，则必须在酸化步骤之前将其加入溶液中。乳清蛋白产物可以是以任何传统方式从哺乳动物乳清(甜乳清或酸乳清)，例如奶牛、山羊、绵羊、野牛、水牛、牦牛、人类、骆驼和/或小鼠乳清，制备的乳清蛋白浓缩物。乳清蛋白浓缩物可例如从脱脂和/或澄清的牛乳清获得，该牛乳清已通过常用方法浓缩和/或脱盐，例如通过超滤(乳清蛋白产物可为保留物)和/或渗滤。
[0139]
通常，富含α-lac的wpc处于沉淀级分中。可将该级分进一步加工(例如喷雾干燥)并储存以供进一步使用，或者另选地，该级分可立即使用，而无需在步骤(ii)钙富集步骤中储存，以产生钙强化的富含α-lac的wpc。
[0140]
如果富含α-lac的wpc(来自步骤(i))作为粉末提供，则将蛋白质粉末重构在例如水中至1％(w/v)蛋白质含量，使用磁力搅拌以350rpm搅拌至少2小时，然后在持续搅拌下在4℃保持18小时。在步骤(ii)中，将如上所述的步骤(i)中获得的α-lac wpc与合适的钙来源(具体地，可溶性钙盐的溶液或悬浮液)混合。例如，可引用以下物质作为合适的可溶性钙盐：碳酸钙、氯化钙、葡糖酸钙、氢氧化钙、苹果酸钙、乳酸钙和富马酸钙，或混合盐诸如柠檬酸苹果酸钙、乳酸苹果酸钙和乳酸柠檬酸钙。
[0141]
包含钙强化的富含α-lac的wpc的营养产品
[0142]
本发明人已经开发的钙强化的富含α-lac的wpc适用于包含在营养组合物中，例如包含在婴儿配方食品(if)和成长乳(gum)中，该婴儿配方食品包括用于早产/低出生体重婴儿的if、1段if、较大婴儿if。
[0143]
尽管以举例的方式对本发明进行了描述，但应当理解，在不脱离权利要求书中所定义的本发明范围的前提下，可作出变型和修改。此外，对于具体的特征如果存在已知的等同物，则应如同在本说明书中明确提到的那样来并入此类等同物。
[0144]
参考以下实施例进一步描述本发明。应当理解，受权利要求书保护的本发明并非旨在以任何方式由这些实施例限制。
[0145]
实施例
[0146]
实施例1：关于不同喷雾干燥的富含α-乳白蛋白的wpc成分的比较测试
[0147]
三种喷雾干燥的富含α-乳白蛋白的wpc(lac)成分获自欧盟和美国的三家不同制造商，在所有情况下都是由甜乳清制造的。使用凯氏定氮法(官方分析方法，aoac，1994年，“nitrogen(total)in milk 991.20”)确定lac-m、lac-p和lac-ie粉末的蛋白质含量分别为78.8％(w/w)、78.2％(w/w)和92.5％(w/w)。假定α-lac:β-乳球蛋白比率分别为1.72:1、2.48:1和13.3:1，则lac-m、lac-p和lac-ie粉末的α-乳白蛋白α-lac含量分别为28.4％(w/w)、24.4％(w/w)和73.4％(w/w)。常规乳清蛋白分离物(wpi)和浓缩物(wpc)成分用作基准并且分别具有88.1％(w/w)和33.3％(w/w)蛋白质，并且假定α-lac:β-ig比率分别为0.24:1和0.28:1，则α-lac含量分别为20.4％(w/w)和4.36％(w/w)。使用jackson等人描述的方法，通过反相高效液相色谱测量α-lac和β-lg含量[jackson,j.g.、janszen,d.b.、lonnerdal,
b.、lien,e.l.、pramuk,k.p.和kuhlman,c.f.，2004年，“a multinational study ofα-lactalbumin concentrations in human milk”，《journal of nutritional biochemistry》，第15卷第9期，第517-521页]。使用分别用于lac-m、lac-p和lac-ie的膜过滤、选择性蛋白质沉淀(根据us 66312 755中的描述)和离子交换色谱方法，实现这些成分中α-lac的富集。根据herwig等人的方法[herwig,n.、stephan,k.、panne,u.、pritzkow,w.和vogl,j.，2011年，“multi-element screening in milk and feed by sf-icp-ms”，《food chemistry》，第124卷第3期，第1223-1230页]，通过电感耦合等离子体-质谱测定成分的总ca含量；wpc、wpi、lac-m、lac-p和lac-ie分别具有704mg/100g、82.6mg/100g、500mg/100g、3.58mg/100g和198mg/100g的总钙含量。使用方法[官方分析方法，aoac，2005年，“total fat dried milk method 932.06”]确定粉末的脂肪含量，其中wpc、wpi、lac-m、lac-p和lac-ie具有2.45％w/w、0.59％w/w、0.88％w/w、9.32％w/w和0.36％w/w的脂肪含量。根据castro-g
ó
mez等人描述的方法并作出一些修改，使lac-p的子样品脱脂[castro-g
ó
mez,m.p.、rodriguez-alcal
á
,l.m.、calvo,m.v.、romero,j.、mendiola,j.a.、e.和fontecha,j.，2014年，“total milk fat extraction and quantification of polar and neutral lipids of cow,goat,and ewe milk by using a pressurized liquid system and chromatographic techniques”，《journal of dairy science》，第97卷第11期，第6719-6728页]。简言之，在25℃将粉末分散(5％，w/v)在2:1二氯甲烷/甲醇溶剂混合物中并以750rpm搅拌20分钟，将混合物静置保持25分钟，之后将澄清的有机溶剂滗析并过滤通过541等级whatman滤纸(ge healthcare，chicago,il,usa)。对于相同粉末，进行三次脂肪萃取，之后使用实验室用edwards modulyo f101冷冻干燥器(edwards，crawley,uk)来干燥脱脂材料。脱脂lac-p(lac-p d)样品的脂肪含量为0.28％(w/w)，如通过确定的。如根据braun等人的方法[braun,m.，2010年，“quantification of phospholipids in infant formula and growing up milk by hplc-737elsd”，《journal of aoac international》，第93卷第3期，第948-955页]，使用配备有蒸发光散射检测器的高效液相色谱(agilent 1100，santa clara,usa)在80℃使用1l/min的气体流速测定的，原始lac-p(lac-p o)和lac-p d的总磷脂(pl)含量分别为4.68％(w/w)和0.36％(w/w)。将蛋白质粉末重构在超纯水中至1％(w/v)蛋白质含量，使用磁力搅拌以350rpm搅拌至少2小时，然后在持续搅拌下在4℃保持18小时。在分析之前，使用0.5m氢氧化钾或0.5m盐酸将蛋白质溶液的ph调节至ph 6.80。向乳清蛋白溶液(1％w/v蛋白质)添加呈cacl2形式的浓度为0.00mm、0.25mm、0.50mm、0.75mm、1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm和5.0mm的ca。除非另有说明，否则测量所有ca强化溶液的ph，并且如果需要，将ph重新调整至6.80。除非另有说明，否则本研究中使用的试剂和标准物是分析级的并且购自sigma aldrich(sigma-aldrich，arklow,co.wicklow,ireland)。
[0148]
离子钙的测量和用氯化钙滴定
[0149]
使用ca离子选择性聚合物膜电极(metrohm，herisau,switzerland)在25℃测量乳清蛋白溶液的离子钙浓度(1％w/v蛋白质，ph为6.80)。在25℃用通过在超纯水中稀释1m标准cacl2溶液得到的0.00mm、2.00mm、4.00mm、6.00mm、8.00mm和10.0mm的标准ca溶液校准离子选择性ca探头。通过使用配备有ph和温度组合探头的自动metrohm ag 907titrando ph滴定系统(metrohm，herisau,switzerland)监测在受控添加(0.1ml/min)cacl2溶液(0.5m)
时乳清蛋白溶液的ph变化(50ml的1％w/v蛋白质，ph为6.80)。使用ph为4.00、7.00和9.00的三种标准缓冲溶液进行ph探头的校准。
[0150]
粒度分布和ζ电位的测量
[0151]
如mulcahy等人[mulcahy,e.m.、mulvihill,d.m.和o’mahony,j.a.，2016年，“physicochemical properties of whey protein conjugated with starch hydrolysis products of different dextrose equivalent values”，《international dairy journal》，第53卷，第20-28页]所述但作出一些小修改，使用zetasizer nano-zs(malvern instruments，malvern,uk)通过动态光散射(dls)测量已添加cacl2的乳清蛋白溶液(1％w/v蛋白质，ph为6.80)的粒度分布。就分析而言，将每种溶液以1:100稀释于相应的无乳清蛋白的钙溶液中。折射率值1.45用于蛋白质，并且分散剂折射率响应于分散剂的cacl2浓度的差异而变化，范围为0.00mm cacl2(即，超纯水)的1.330至5.00mm cacl2的1.332，其中折射率使用米氏散射理论计算。在25℃和自动电压模式下测量120s内的电位，并且使用174smoluchowski模型(kirby和hasselbrink，2004年)计算电位值。
[0152]
钙-蛋白质相互作用的等温滴定量热分析
[0153]
使用microcal peaq-itc仪器(malvern instruments，malvern,uk)，通过等温滴定量热法(itc)测定溶液中的乳清蛋白和所添加cacl2之间的相互作用的热力学特性(1％w/v蛋白质，ph为6.80)。在25℃和以750rpm搅拌下，用5mm cacl2滴定乳清蛋白溶液。参考池与样品池填充有相同体积(250μl)的超纯水。将滴定剂以0.1μl的体积逐步注射到乳清蛋白溶液中，其中在连续注射之间延迟150s并且总共注射25次。方法的原理是，在恒温下测量由于生物分子结合而导致释放或吸收的热量。将施加到参考池的功率设置为10μcal/s，这与先前的研究(canabady-rochelle和mellema，2010年)一致。所使用的模型为“一个结合位点”以建立化学计量(n)、结合常数(kf)、吉布斯自由能(δg)、焓(δh)和熵(δs)。不同乳清蛋白溶液的滴定曲线表示为差异功率(即，参考池和样品池之间的功率差异)随时间的变化。
[0154]
蛋白质结合钙和游离形式钙之间的钙分布
[0155]
根据国际乳品联合会标准119:2007(idf，2007年)，使用配备有ca空心阴极灯(activion，halstead,essex,england)的火焰原子吸收光谱(aas)(spectraa 55b aas，varian)确定乳清蛋白溶液(1％w/v蛋白质，ph为6.80)的总ca含量。使用由ca参考溶液(1000mg/l)制备的已添加2％含量的10％氯化镧溶液的标准溶液(0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0mg ca/l)来校准仪器。将cacl2(2mm)添加到蛋白质溶液中并使其在20℃平衡20分钟，然后将样品在离心过滤器(merk millipore，carrigtohill,co.cork,ireland)中在20℃以5,000g离心25分钟，其中分子量截止值为10kda。将用于aas分析的含有以1:1比率添加的24％三氯乙酸的样品静置25分钟，并且过滤通过413号滤纸(vwr international，france)。使用aas分析ca含量的样品是原始钙强化的(即，添加2.00mm cacl2)蛋白质溶液和来自离心过滤的相应上清液级分。
[0156]
统计数据分析
[0157]
将所有样品独立制备三次，并且对于每个独立实验一式三份地进行所有分析。使用r i386版本3.3.1(r foundation for statistical computing，vienna,austria)对所
生成的数据进行单向方差分析(anova)。使用tukey成对比较事后考验来确定在95％置信水平下不同样品的平均值之间统计学上显著的差异(p《0.05)。除非另有说明，否则结果以平均值
±
标准偏差表示，并且使用上标字母在表中识别统计学上显著的差异。
[0158]
[0159]
实施例2
[0160]
以下给出根据本发明所用的婴儿配方食品的组成的一个实施例。该组合物仅以例证的方式给出。根据实施例3中详述的方法产生配方产品。
[0161][0162]
实施例3
[0163]
如下制备四十升批量的配方产品：首先将三分之一的在45℃在单独容器中回火的脂质共混物添加到热水(约75℃)中，以在添加常量营养素成分时减少发泡。然后以5分钟的间隔按照脱脂乳粉、钙强化的富含α-lac的wpc和乳糖的顺序单独添加常量营养素成分，并且使用silverson l4rt混合器(silverson machines ltd.，chesham,england)混合，然后添加剩余的脂质共混物。混合10分钟后，在50℃测量混合物的ph并且调节(如果需要的话)
至6.6-7.0的范围内，使用氢氧化钾增加ph值或使用柠檬酸降低ph。在进一步加工之前，将混合物混合10分钟。
[0164]
使用microthermics(型号25hv；north carolina,usa)管状热交换器以100℃
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30s热加工混合物，并使用内嵌式两级阀均质器(型号ns20006h，gea niro，soavi,parma,italy)以13.8mpa的第一级压力和3.45mpa的第二级压力进行均化。将混合物在4℃-8℃的温度存储过夜，并使用配备有设置为30rpm的螺旋桨(3叶片，r1381螺旋桨，gmbh&co.kg，janke&kunkel-str.10,79219staufen,germany)的顶置式搅拌器(数字式euro-st，gmbh&co.kg，janke&kunkel-str.10,79219staufen,germany)混合。在存储过夜之后，将混合物预热至65℃，然后使用中试规模anhydro喷雾干燥器(工厂型号3类型i ka，copenhagen,denmark)喷雾干燥，其中典型水蒸发速率为20l/h。干燥器入口温度保持恒定为185℃，并且出口温度为90℃。