一种检测MicroRNA-17的生物传感器

一种检测microrna-17的生物传感器
技术领域
1.本发明属于传感器技术领域，特别涉及一种核酸适配体检测microrna-17的生物传感器。


背景技术：

2.microrna (mirna)在正常组织、良性肿瘤和恶性肿瘤中表达水平的不同，使其成为肿瘤诊断和预后评估的重要生物标志物，这就凸显了发展高敏感性和特异性mirna检测的紧迫性和重要性。然而，传统的实验方法如northern blotting、rt-pcr等因为其复杂的实验过程和较低的灵敏度限制了其应用。
3.crispr-cas系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and crispr associated protein)作为原核生物的适应性免疫系统，已被广泛应用于真核生物的基因编辑。由前体crrna (pre-crrna)加工产生的成熟crispr rna (crrna)对形成活性crispr效应复合物至关重要。cas13a的特别之处在于，cas13a一旦识别并切割由crrna序列指定的rna目标，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它将结合并切割其他的rna。因cas13a蛋白具有高保真度和独特的靶标激活侧切活性，使该策略具有较高的灵敏度和特异性。


技术实现要素：

4.为了实现对microrna-17更加灵敏、快速、低成本的检测，本发明提供了一种检测微microrna的生物传感器。
5.一种检测microrna-17的生物传感器，包括核苷酸序列如seq id no: 1-6所示的crrna，发夹探针pre-trigger、h1、h2、h3、h4和cas13a蛋白、血红素、鲁米诺试剂、h2o2。
6.优选地，上述传感器中还包括mirna-17标准溶液。
7.上述生物传感器可用于制备检测mirna-17试剂盒。
8.上述生物传感器或试剂盒在检测mirna-17中的应用。
9.具体地，上述应用包括以下步骤：（1）将发夹探针pre-trigger、h1、h2、h3、h4和缓冲溶液共孵育，在水浴锅中完成退火，获得产物液；（2）将cas蛋白、crrna、产物液及待测溶液在缓冲溶液中孵育，获得反应液；（3）在反应液中依次加入血红素、鲁米诺试剂和h2o2溶液，进行分光光度测定。
10.优选地，所述cas13a蛋白与crrna的摩尔比为2:1。
11.优选地，步骤（3）中，检测波长为400 nm-600 nm。
12.本发明的检测原理如下：本发明的传感器在对mirna-17（caaagugcuuacagugcagguag）进行检测时用到以下序列：crrna：gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaaccuaccugcacuguaagcac uuug；
pre-trigger：ggaatgtgtcacattuuaatgtgtcacattcc；h1：aatgtgacacatttaagccacgagtgtc；h2：gacactcgtgggacagacgacacacgag；h3：ctcgtgtgtcgtcctatcagatgcctacgacac；h4：gtgtcgtaggcatcggacactcgtggcttagatgcct；其中crrna和mirna-17的斜体部分为互补序列，pre-tirgger和h1中单下划线部分为互补序列，h1和h2中斜体部分为互补序列，h2和h3中单下划线部分为互补序列，h3和h4中斜体部分为互补序列，h4和h1中单下划线部位为互补序列；如图1所示，当目标物存在时，可与crrna结合，激活cas13a的反式切割活性，将pre-trigger切断，使发夹pre-trigger之间不稳定，形成两条trigger链。两条trigger链都可以打开h1，h1又继而打开h2，h2打开h3，h3打开h4，触发杂交链反应（hcr反应），而h4又可与h1结合，释放trigger链，使其可以参与下一个循环。h1、h2、h3、h4的末端均为富g序列，通过上述无限次循环实现指数放大，产生大量的g四联体实现信号放大；随着各发卡探针暴露出g四联体，当加入血红素时，组装成类过氧化物酶，在h2o2存在时，进行氧化还原反应，催化鲁米诺试剂发光，从而通过测量化学发光强度来定量检测目标产物。
13.本发明具有以下优点：本发明利用cas13/crrna复合体对mirna-17的特异性识别和反式切割活性，利用trigger引发的杂交链反应实现了对目标物的循环放大；利用发夹末端的富g序列形成g四链体，通过类过氧化物酶催化鲁米诺试剂反应，实现了信号的检测。由于该传感器无酶参与，其检测方法操作简便、检测速度快。该传感器的构建简单，仅需两步，有效避免了多步加入样品可能带来的污染、繁琐的样品前处理过程，具有操作简单、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制作该生物传感器的工艺成本低，且反应条件温和，反应速度快。
附图说明
14.图1为该实验的原理图；图2为pre-trigger浓度优化检测结果图；图3为h1浓度优化检测结果图；图4为反应时间优化检测结果图；图5为传感器检测mirna-17的工作曲线。
具体实施方式
15.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
16.实施例1pre-trigger浓度优化（1）在1.5ml离心管中，加入发夹pre-trigger（终浓度分别为0.4μm，0.6μm，0.8μm，1.0μm，1.2μm，1.4μm）、h1（10
µ
m）、h2（10
µ
m）、h3（10
µ
m）、h4（10
µ
m）各10
µ
l，加入
10
µ
l10
×
buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5min，然后冷却至室温；（2）取2
µ
lcas13a蛋白（100nm）、2
µ
lcrrna（50nm）、1
µ
lmirna-17、26.7
µ
l灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应75min；（3）加入3
µ
l血红素、3
µ
l鲁米诺试剂、3.3
µ
l过氧化氢，荧光仪在420nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400nm到600nm，读取荧光信号变化，检测目标物；结果见图2，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着pre-trigger的浓度增大而增大，当浓度超过1.0μm后，化学发光强度趋于稳定。所以pre-trigger的最佳浓度为1.0μm。
17.实施例2h1浓度优化（1）在1.5ml离心管中，加入发夹pre-trigger（10
µ
m）、h1（终浓度分别为0.4μm，0.6μm，0.8μm，1.0μm，1.2μm，1.4μm）、h2（10
µ
m）、h3（10
µ
m）、h4（10
µ
m）各10
µ
l，加入10
µ
l10
×
buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5min，然后冷却至室温；（2）取2
µ
lcas13a蛋白（100nm）、2
µ
lcrrna（50nm）、1
µ
lmirna-17、26.7
µ
l灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应75min；（3）加入3
µ
l血红素、3
µ
l鲁米诺试剂、3.3
µ
l过氧化氢，荧光仪在420nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400nm到600nm，读取荧光信号变化，检测目标物；结果见图3，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着h1的浓度增大而增大，当浓度超过1.0μm后，化学发光强度趋于稳定。所以h1的最佳浓度为1.0μm。
18.实施例3反应时间优化（1）在1.5ml离心管中，加入发夹pre-trigger（10
µ
m）、h1（10
µ
m）、h2（10
µ
m）、h3（10
µ
m）、h4（10
µ
m）各10
µ
l，加入10
µ
l10
×
buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5min，然后冷却至室温；（2）取2
µ
lcas13a蛋白（100nm）、2
µ
lcrrna（50nm）、1
µ
lmirna-17、26.7
µ
l灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min；（3）加入3
µ
l血红素、3
µ
l鲁米诺试剂、3.3
µ
l过氧化氢，荧光仪在420nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400nm到600nm，读取荧光信号变化，检测目标物；结果见图3，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着时间延长而增大，当时间超过75min后，化学发光强度趋于稳定。所以最佳反应时间为75min。
19.应用例1生物传感器对mirna-17的检测（1）在1.5ml离心管中，加入发夹pre-trigger（10
µ
m）、h1（10
µ
m）、h2（10
µ
m）、h3（10
µ
m）、h4（10
µ
m）各10
µ
l，加入10
µ
l10
×
buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5min，然后冷却至室温；（2）取2
µ
lcas13a蛋白（100nm）、2
µ
lcrrna（50nm）、1
µ
lmirna-17（0nm、5nm、100nm、200nm、500nm、1
µ
m、2
µ
m、4
µ
m）、26.7
µ
l灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应75min；
（3）加入3
ꢀµ
l血红素、3
ꢀµ
l鲁米诺试剂、3.3
ꢀµ
l过氧化氢，荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400 nm到600 nm，读取荧光信号变化，检测目标物；结果见图5，从图中可以看出，检测到的荧光信号强度随着mirna-17的浓度在0.1
ꢀµmꢀ‑ꢀ4ꢀµ
m区间内逐渐上升；且mirna浓度的对数与荧光强度大小呈正比关系，拟合曲线为i=411.05137 433.47807 lgc（nm）（相关系数是0.999，其中c代表了mirna的浓度），经检测，当浓度低于100nm时，mirna浓度的对数与荧光大小不再符合拟合曲线规律。因此，可得到该方法检测mirna的下限为100 nm。