Amonafide化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用的制作方法

amonafide化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及amonafide化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用，属于医药领域。


背景技术：

2.许多逆转录病毒，包括人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)和一些冠状病毒，如严重急性呼吸综合症病毒(severe acute respiratory syndrome)和传染性支气管炎病毒(infectious bronchitisvirus)，都会使用程序化的-1核糖体移码(-1prf)来控制病毒结构蛋白和酶蛋白的产生比例，这有利于自身病毒的组装。
3.在hiv病毒中，-1prf的信号位于gag和pol开放阅读框(orf)之间，核糖体能够识别该区域并能够诱导其在此区域向后移位一个核苷酸，进而翻译生成gag-pol融合蛋白，其中gag蛋白是病毒结构蛋白，pol是病毒关键的酶蛋白。具体机制如下：在gag-pol mrna的翻译过程中，大多数核糖体终止于gag开放阅读框末端的终止密码子，仅产生gag蛋白。
4.然而，由于hiv-1gag-pol mrna中有一个由七核苷酸滑动序列(uuuuua)和一个下游rna茎环组成的特殊序列，核糖体在翻译过程中遇到此信号时，大约能够诱导约5％的核糖体向后移动一个核苷酸，进而跳过了gag蛋白的终止密码子也使后续的orf序列转变为pol蛋白的编码序列，从而产生gag-pol融合蛋白，该融合蛋白在病毒蛋白酶protease的进一作用下，gag蛋白被切割成p17、p24、p7等结构蛋白，pol蛋白被切割成反转录酶、整合酶等酶蛋白。hiv正是利用这种机制，严格控制了gag-pol蛋白的产生比例为20:1，有利于病毒自身的组装，如图1所示。
5.尽管目前的抗逆转录病毒治疗取得了很大进展，但hiv-1导致的艾滋病仍是一个全球性的健康问题，这种情况使得开发抗hiv-1的新药和研究这种病毒新的治疗靶点成为当务之急。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供amonafide化合物在制备治疗艾滋病药物中的应用，以解决上述背景技术中遇到的问题。
7.amonafide化合物的结构式为：
8.amonafide化合物通常是作为dna拓扑异构酶ii的抑制剂。本发明发现amonafide化合物可以增加核糖体在翻译gal-pol融合蛋白时发生-1prf的效率，使pol蛋白的含量增
加，gag蛋白的含量相对降低，致使病毒无法在细胞内包装成一个完整的颗粒，从而导致艾滋病病毒产量急剧降低，故而可用于艾滋病的治疗。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该amonafide药物能够增强核糖体在翻译gag-pol融合蛋白时程序性核糖体移位的效率，导致gal和pol蛋白比率的严重失调，进而显著降低了hiv-1病毒包装的效率，最终导致病毒的产量急剧降低，具有良好的抗hiv效果。
附图说明
10.图1为本发明在正常情况下和-1prf的效率增加后对病毒包装的影响示意图；
11.图2为本发明中双荧光蛋白和双荧光素酶报告基因示意图；
12.图3为本发明在实施例2中mcherry-(-1prf)-gfp单红细胞在10μmamonafide处理4小时后多功能酶标仪检测绿色荧光值的变化示意图；
13.图4为本发明在实施例3中人胚肾293细胞在转染野生型pnl4-3质粒24h，再加amonafide处理4h后，real-time pcr检测细胞内gp120含量的变化，并elisa检测培养基中病毒颗粒的变化示意图；
14.图5为本发明在实施例4中外周血单核细胞在转染野生型pnl4-3质粒24h，再加amonafide处理4h后，real-time pcr检测细胞内gp120含量的变化，并elisa检测培养基中病毒颗粒的变化示意图；
15.图6为本发明在实施例5中通过elisa检测免疫缺陷型小鼠血液中hiv病毒颗粒的含量示意图。
16.图7为amonafide化合物的结构式。
具体实施方式
17.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。
18.实施例1
19.amonafide化合物的结构式如图7所示。
20.如图1所示，amonafide化合物可以作为制备治疗艾滋病的药物，并应用在治疗艾滋病中。amonafide化合物治疗艾滋病的原理为amonafide化合物可以增加-1prf的效率，使pol蛋白的含量增加，gag蛋白的相对含量降低，致使病毒无法在细胞内包装成一个完整的颗粒，从而导致艾滋病病毒产量急剧降低。本发明正是利用hiv的这种机制，在fda已批准的药物库中筛选出能够显著促进hiv-1prf的化合物，进而获得能够治疗hiv的潜在药物。
21.hiv-1的移码效率控制着gag：pol的比例，这一比率的偏离，特别是移码效率的增加会导致pol蛋白含量的增加进而使细胞内无法产生完整的hiv病毒颗粒。因此，-1prf可以成为抗hiv-1的新靶点。
22.本发明首先建立了一种可以指示-1prf效率的稳定细胞株，进而从2000多种fda批准上市的药物库中筛选到了一种可以显著增强hiv-1prf的效率的化合物amonafide，并在细胞水平和小鼠活体实验中均证明该化合物能够抑制hiv的复制，显著降低病毒颗粒，具有优秀的抗病毒效果。该化合物为dna拓扑异构酶ii的抑制剂，是一种合成的蒽环类抗癌药，原先用于治疗急性骨髓性白血病和一些其他血液系统恶性肿瘤。而目前申请人发现这种药物可以用于hiv的治疗，跟该药物的第一用途没有关联性。因此，专利发明人申请该药物的
第二医药用途专利。
23.amonafide化合物在应用时，首先构建双荧光蛋白和双荧光素酶报告基因，如图2所示。通过图2可知，将来自hiv-1的-1prf序列(如seq id no.2所示)插入到红色荧光蛋白(mcherry，序列如seq id no.1)和绿色荧光蛋白(gfp，序列如seq id no.3)的编码序列之间，最终得到如seq id no.2所示的重组序列。在重组基因中，mcherry是可以正常转录翻译的，而gfp只有当核糖体在hiv-1移码信号区产生-1位移码才能进行翻译。
24.本发明将上述重组序列扩增后用同源重组的方法构建与plvx-ires-neo质粒并转染hela细胞后用g418筛选稳转的细胞株，并通过多次流式分选技术从中筛选出了只稳定表达红色荧光蛋白而不表达绿色荧光蛋白的单红细胞株，这种单红细胞株有利于后续的试验，因为只要药物处理过程中出现绿色荧光，就可以表明该药物能够促进-1prf的效率，有利于大规模的药物筛选。
25.本发明获得的化合物amonafide能够显著促进模式细胞中绿色荧光蛋白的产生，并在细胞水平和小鼠水平进一步论证了其对hiv的复制具有显著的抑制效果。
26.作为一种优选的方案，amonafide化合物在制造时，-1prf的长度及序列采用的是长度为212bp的-1prf序列，如seq id no.2所示，包含滑动序列和茎环结构。
27.其中tttttta和ctggccttcccacaagggaaggccag的序列为滑动序列和茎环，taa为不发生-1核糖体移码时出现的终止密码子的位置，也就是细胞内只能产生红色荧光蛋白。
28.实施例2，请参阅图3，基于实施例1，在利用amonafide显著增强稳转细胞内hiv-1-1prf的效率时，通过加药作用于只发红光的单阳稳转细胞株2h后，多功能酶标仪检测绿色荧光蛋白含量的变化。
29.结果显示：图3为mcherry-(-1prf)-gfp单红细胞在10μmamonafide处理4小时后多功能酶标仪检测绿色荧光值的变化。图中可以看出amonafide处理后，细胞的绿色荧光值显著增加。
30.实施例3，请参阅图4，基于实施例1，在利用amonafide化合物抑制hiv-1野生型病毒在人细胞中的复制时，通过转染nl4-3野生型质粒20h后再加入amonafide作用4h，提取细胞内的总rna，real-time pcr检测p24的含量。
31.图4为人胚肾293细胞在转染野生型pnl4-3质粒24h，再加amonafide处理4h后，real-time pcr检测细胞内gp120含量的变化，并elisa检测培养基中病毒颗粒的变化。
32.实施例4，请参阅图5，基于实施例1，在利用amonafide化合物抑制hiv-1野生型病毒在外周血单核细胞中的复制时，分离获得了人体外周血单核细胞，通过在细胞中转染nl4-3野生型质粒24h后再加入amonafide作用4h，提取细胞内的总rna，real-time pcr检测p24、pol、gp120的含量。
33.同时，也检测了细胞培养液中病毒颗粒及p24蛋白的含量，结果显示amonafide处理的细胞中，细胞内病毒的复制受到明显的抑制，分泌到培养基中的病毒颗粒也显著降低，amonafide也能显著抑制病毒在外周血单核细胞中复制与包装。
34.图5为外周血单核细胞在转染野生型pnl4-3质粒24h，再加amonafide处理4h后，real-time pcr检测细胞内gp120含量的变化，并elisa检测培养基中病毒颗粒的变化。
35.实施例5，请参阅图6，基于实施例1，在利用amonafide化合物抑制hiv在免疫缺陷的小鼠动物模型中的复制时，将人的造血干细胞分离后移植到小鼠中，继续培养两周后检
测造血干细胞在小鼠体内的分化情况，最终获得了造血细胞人源化的小鼠。小鼠选用nod.cg-prkdcscid il2rgtm1wjl/szj(nsg)类型的，因此本专利发明人就可以用这个模型在体内评价药物的作用效果。
36.将hiv病毒纯化后通过尾静脉注射到小鼠的血液系统，感染48小时后，再将amonafide也通过尾静脉注射小鼠，再过48小时后，检测了小鼠血液中hiv病毒颗粒的含量。
37.结果表明，注射了amonafide的小鼠其血液中hiv的病毒颗粒也显著低于对照组，这个结果表明在动物实验中，amonafide也能显著抑制hiv的复制。
38.图6为免疫缺陷的小鼠nod.cg-prkdcscid il2rgtm1wjl/szj(nsg)，将人的造血干细胞分离后移植到小鼠中两周之后，建立血细胞人源化的小鼠动物模型。将hiv病毒纯化后通过尾静脉注射到小鼠的血液系统，48小时后，我们再将amonafide也通过尾静脉注射小鼠。再过48小时后，本专利发明人通过elisa检测了小鼠血液中hiv病毒颗粒的含量。从图中可以看出，amonafide也能够显著抑制hiv在人源化小鼠血液中的复制。
39.综上所述，本发明的有益效果主要体现在：(1)、本发明筛选到的amonafide，能够有效促进hiv-1prf的发生并能够显著抑制hiv-1野生型病毒在肿瘤细胞、外周血单核细胞、小鼠动物模型中的复制，抑制hiv-1病毒颗粒的组装；(2)、本发明发现一种抗癌药物amonafide的新用途，即有抗hiv-1病毒的效果。
40.该amonafide药物能够改变hiv-1基因在翻译gag-pol融合蛋白时程序性核糖体移位的效率，导致gal和pol蛋白比率的严重失调，进而显著降低了hiv-1病毒包装的效率，最终导致病毒的产量急剧降低，具有良好的抗hiv效果。
41.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式，并不用于限定本发明保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应含在本发明的保护范围之内。