HVCN1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物中的应用的制作方法

hvcn1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物中的应用
技术领域
1.本公开涉及基因工程技术领域，尤其涉及hvcn1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.髓鞘碎片堆积是多发性硬化症、阿尔兹海默症、亨廷顿疾病和肌萎缩侧索硬化症等多种神经损伤和神经退行性疾病的病理特征，清除髓鞘碎片对于治疗神经损伤或神经退行性疾病有益。
3.小胶质细胞或巨噬细胞能够清除髓鞘碎片，且小胶质细胞或巨噬细胞清除髓鞘碎片时首先需要将小胶质细胞或巨噬细胞募集到髓鞘碎片周围；目前，利用抗体处理髓鞘碎片时均是促进小胶质细胞或巨噬细胞吞噬髓鞘，而每个小胶质细胞或巨噬细胞吞噬髓鞘碎片的能力是有限的，耗竭性的吞噬髓鞘碎片会导致小胶质细胞或巨噬细胞激活甚至死亡。因此，亟需新的促进髓鞘碎片清除的方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本公开的目的在于提出一种hvcn1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物中的应用。
5.基于上述目的，本公开提供了hvcn1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物中的应用。
6.可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物包括治疗髓鞘碎片堆积疾病的药物。
7.可选地，所述治疗髓鞘碎片堆积疾病的药物包括促进髓鞘碎片清除的药物。
8.可选地，所述促进髓鞘碎片清除的药物包括增强小胶质细胞或巨噬细胞的迁移来促进髓鞘碎片清除的药物。
9.可选地，所述神经退行性疾病包括多发性硬化症、阿尔兹海默症、帕金森综合征、脊髓侧索硬化症和亨廷顿舞蹈症。
10.可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物是以hvcn1抗体作为唯一活性成分或者是包含hvcn1抗体的药物组合物。
11.可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物包括采用药学上可接受的辅料制成药学上可接受的任意剂型。
12.可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物包括汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、脂质体制剂、气雾剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、膜剂和海绵剂中的至少一种。
13.从上面所述可以看出，本公开提供的hvcn1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行
性疾病的药物中的应用，hvcn1抗体能够增强小胶质细胞或巨噬细胞的迁移能力进而促进其向损伤区募集，吞噬损伤区的髓鞘碎片，实现髓鞘碎片的清除，为髓鞘碎片的清除提供了一种新方法，从根本上起到治疗髓鞘碎片堆积疾病的作用；并且服用安全性好，成本降低，患者依从性高。
附图说明
14.为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
15.图1a为脑内hvcn1抗体中和hvcn1通道对小胶质细胞清除髓鞘碎片的效果研究实验中体内髓鞘清除实验设计示意图；
16.图1b为脑内hvcn1抗体中和hvcn1通道对小胶质细胞清除髓鞘碎片的效果研究免疫荧光染色示意图；
17.图1c为小鼠脑内残余髓鞘的体积统计图；
18.图1d为小鼠脑内残余髓鞘的累积荧光强度统计图；
19.图2a为hvcn1抗体注射对小胶质细胞的影响研究实验中体内髓鞘清除实验设计示意图；
20.图2b为hvcn1抗体注射对小胶质细胞的影响研究实验中免疫荧光染色示意图；
21.图2c为损伤核心区和损伤周围区总细胞和小胶质细胞计数结果统计图；
22.图3a为体内hvcn1抗体中和后的髓鞘清除是否主要由小胶质细胞介导研究实验中免疫荧光染色示意图；
23.图3b为体内hvcn1抗体中和后的髓鞘清除是否主要由表达hvcn1通道的小胶质细胞介导研究实验中免疫荧光染色示意图；
24.图3c为小鼠脑内注射髓鞘后髓鞘损伤区表达hvcn1的细胞统计图。
具体实施方式
25.为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
26.需要说明的是，除非另外定义，本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。
27.小胶质细胞或巨噬细胞能够清除髓鞘碎片，为了探究hvcn1抗体是否在髓鞘碎片清除的过程中发挥作用，本公开对hvcn1抗体中和hvcn1通道对小胶质细胞清除髓鞘碎片的总体效果、hvcn1抗体注射对小胶质细胞的影响和hvcn1抗体中和后的髓鞘清除加强是否主要由表达hvcn1通道的小胶质细胞细胞介导进行了研究。下述结合具体实验例进行详细说明。
28.实验例
29.下述实验中免疫荧光染色所采用的抗体名称、来源、货号和稀释度如表1所示。
30.表1
[0031][0032][0033]
下述实验中采用的溶液的配置如下：
[0034]
1％戊巴比妥钠溶液：取0.1g戊巴比妥钠和0.09g nacl,加约8ml ddh2o涡旋溶解，用ddh2o定容至10ml。
[0035]
0.01m pbs：取8g nacl、0.2g kcl、1.44g na2hpo4和0.24g kh2po4，溶于800ml蒸馏水，调节ph至7.4，加水定容至1l，灭菌后室温保存。
[0036]
0.2m pb：于800ml ddh2o中加入55.42g na2hpo4·
12h2o和7.04gnah2po4·
2h2o，溶解后加ddh2o定容到1l，调ph至7.3，室温保存。
[0037]
4％pfa：将400ml ddh2o加热至65-70℃，边搅拌边加入40g多聚甲醛，滴加5m naoh至完全溶解，冷却，过滤，加入500ml 0.2m pb，调ph至7.3，4℃保存。
[0038]
蔗糖溶液：分别称取10g、20g、30g蔗糖，加入50ml 0.2m pb，充分搅拌溶解后加ddh2o定容至100ml，即得10％，20％，30％蔗糖溶液。
[0039]
2.5mm tris-hcl：将2.5ml 1m tris-hcl(ph 7.4)加入约800ml ddh2o中，调ph至7.0，加ddh2o定容至1l。
[0040]
0.32m蔗糖：取109.54g蔗糖，加约700ml 2.5mm tris-hcl充分搅拌溶解，加2.5mm tris-hcl定容至1l。
[0041]
0.85m蔗糖：取290.96g蔗糖，加约700ml 2.5mm tris-hcl充分搅拌溶解，加2.5mm tris-hcl定容至1l。
[0042]
triton x-100稀释液：向100ml pbs中加入30μl triton x-100，其中triton x-100购自sigma,货号为t8787。
[0043]
封闭液：向10ml triton x-100稀释液中加入500μl驴血清。
[0044]
抗体稀释液：向10ml triton x-100稀释液中加入250μl驴血清。
[0045]
1.实验方法
[0046]
1.1髓鞘提取与荧光标记
[0047]
将12周龄雌性大鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，注射剂量为50mg/kg体重，然后经心灌注冰的0.01m pbs 2～3min用剪刀将大鼠断头，剪开头骨，用镊子取出大脑。将大脑转移到dounce匀浆管中，加入预冷的0.32m蔗糖溶液，匀浆。于超速离心管中加入25ml预冷的0.85m蔗糖溶液，上层小心加入匀浆液，于4℃75000g离心30min。收集中间层的髓鞘，用ddh2o清洗三次，然后于4℃75000g离心15min一次，于4℃12000g离心10min两次。离心后的髓鞘沉淀采用0.01m pbs调整浓度至8mg蛋白/ml，加入cfse染料至终浓度为5μm，于37℃孵育30min；然后12000g离心10min，弃去上清液，采用0.01m pbs清洗三次后，采用0.01m pbs重悬，-80℃储存。
[0048]
1.2脑内髓鞘吞噬实验
[0049]
将1.1中cfse标记的髓鞘煮沸10min，然后立即放冰上降温以变性。向变性后的髓鞘中加入抗体至抗体终浓度为1mg/ml，髓鞘终浓度为25mg/ml，得到抗体-髓鞘混合物。
[0050]
成年小鼠按照50mg/kg体重经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，将其头部水平固定于立体定位仪上。将小剪刀、镊子等器械浸泡于75％乙醇中消毒，用无菌干棉球擦去头骨表面的结缔组织，充分暴露手术区域。与前后左右移动注射针，将小鼠顶部头骨调水平，前囟后囟z轴误差≤0.2mm，前囟旁开1.5mm，两侧位点误差≤0.2mm。用颅骨钻钻开目标位置上方的颅骨，微量注射针吸取1μl抗体-髓鞘混合物，缓缓下针至目标位置，坐标为：前囟向前0.0mm,旁开2.0mm,腹侧1.5mm。停针5min，于5min内完成注射，停针5min，每2min拔针0.2mm，拔针三次后，再缓慢完全拔出。缝合头皮，将小鼠放到电热毯上保温，待其苏醒后转移到鼠笼中。注射48h之后灌流取材。
[0051]
1.3灌流取材与切片
[0052]
将针管在恒流泵上固定好并调整好流速，小鼠按照50mg/kg体重经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，以仰卧位固定于泡沫板上。用大剪刀沿剑突朝头部剪开并充分暴露胸腔，将针头插入左心房，用小剪刀剪开静脉窦，打开恒流泵，经心灌注冰的0.01m pbs 2～3min后继续灌流冰的4％pfa 8min。用大剪刀断头并剪开头骨，用镊子朝两侧掰开头骨，充分暴露大脑，用镊子捞出大脑。将大脑转移至新的ep管中，加入4％pfa后固定2h，换10％蔗糖脱水，待组织沉底后，依次换20％蔗糖、30％蔗糖继续脱水。将组织取出，吸水纸上吸干表面的蔗糖溶液，在组织表面裹一层oct后再转移到包埋盒中，定好方向后，加入oct至没过组织顶端。包埋盒转移到-80℃急速冷冻5min，待oct凝固后取出组织与oct，转移并固定到冻头上，于切片机中切片，切片厚度为12μm，将得到的组织切片贴到载玻片上后室温放置2h，转移到-80℃长期储存。
[0053]
1.4组织免疫荧光染色
[0054]
将组织切片室温放置5min晾干后，用0.01m pbs清洗三次，每次5min。然后将组织切片转移至湿盒里，于5％驴血清中室温封闭2h；一抗4℃孵育过夜，pbs洗三次，每次5min。
二抗4℃孵育1h，pbs洗三次，每次5min。dapi室温孵育10min，pbs洗三次，每次5min。轻轻吸干组织周围残余的液体，滴上fluorsave封片剂，封片，室温避光放置2h固化，-20℃存储或显微镜下拍照。
[0055]
1.5数据统计
[0056]
数据展示为平均值
±
标准误。数据统计用graphpad prism软件完成，依具体情形采用单因素方差分析结合事后dunnett’s多重比较，非配对双尾t检验，或配对双尾t检验，p《0.05视为有显著性差异。
[0057]
1.6脑内hvcn1抗体中和hvcn1通道对小胶质细胞清除髓鞘碎片的效果研究
[0058]
在成年小鼠脑内一侧注射rabbit anti-hvcn1抗体和髓鞘，另一侧注射等体积和浓度的同型igg抗体和髓鞘作为对照(图1a)，注射用量及方法参照1.2，其中igg抗体为rabbit igg，购于义翘神州，货号为cr1。48h后，对小鼠进行灌流切片，方法同1.3。采用dapi对切片进行染色封片，方法同1.4；然后采用荧光显微镜对残余髓鞘进行拍照，比较残余髓鞘的量，每隔24～36μm取一张切片进行免疫荧光染色，然后进行体视学重构，标尺为100μm(图1b),结果如图1c～1d所示。图中结果显示，与对照侧相比，注射hvcn1抗体侧，残余髓鞘的量明显更少；对残余髓鞘的体积和累积荧光强度进行定量估算发现，与对照组相比，注射hvcn1抗体一侧，残余髓鞘的总体积显著减小(图1c)；注射hvcn1抗体一侧脑内残余髓鞘的累积荧光强度显著低于对照抗体一侧(图1d)；上述结果统计方法同1.5。上述结果表明，注射hvcn1抗体侧相对于注射对照抗体侧残余髓鞘的量显著减少，这证明体内hvcn1抗体中和hvcn1通道能促进髓鞘碎片清除。
[0059]
1.7hvcn1抗体注射对小胶质细胞的影响研究
[0060]
在成年小鼠脑内一侧注射rabbit anti-hvcn1抗体和髓鞘，另一侧注射等体积和浓度的同型igg抗体和髓鞘作为对照(图2a)，注射用量及方法参照1.2。48h后，对小鼠进行灌流切片，方法同1.3。采用一抗rat anti-cd68抗体、二抗cy3-conjugated donkey anti-rat抗体和dapi对切片进行免疫荧光染色封片，方法同1.4；然后采用荧光显微镜对髓鞘进行拍照，检测髓鞘周围cd68阳性小胶质细胞的数量；将髓鞘残余区域以及紧邻着残余髓鞘的一圈小胶质细胞密度特别大的区域作为损伤核心区，核心区以外小胶质细胞密度明显升高的区域作为损伤周围区(图2b)，图2b中显示hvcn1抗体中和增加了cd68阳性的小胶质细胞在髓鞘损伤核心区(c)与损伤周围区(p)的密度；对损伤核心区和损伤周围区的细胞进行计数，结果如图2c所示。图2c显示，损伤核心区和损伤周围区的dapi密度即总细胞密度没有显著差异；对cd68阳性的小胶质细胞进行统计，结果发现相比于对照抗体侧，注射hvcn1抗体侧cd68阳性的小胶质细胞密度在损伤核心区和损伤周围区显著提升，损伤核心区和损伤周围区内cd68阳性的小胶质细胞占总细胞的比例也显著提高；上述结果统计方法同1.5。上述结果表明，在体内通过hvcn1抗体中和hvcn1通道能够促进小胶质细胞向损伤区募集。
[0061]
1.8体内hvcn1抗体中和后的髓鞘清除是否主要由表达hvcn1通道的小胶质细胞介导研究
[0062]
在成年小鼠脑内注射rabbit anti-hvcn1抗体和髓鞘，注射用量及方法参照1.2。48h后，对小鼠进行灌流切片，方法同1.3。采用一抗goat anti-iba1抗体、二抗cy3-conjugated donkey anti-goat抗体和dapi对切片进行免疫荧光染色封片，方法同1.4；然后采用荧光显微镜对对髓鞘碎片进行拍照，检测髓鞘碎片周围的小胶质细胞的数量，结果
如图3a所示。图3a中结果显示，小鼠脑内注射髓鞘-抗体混合物后，髓鞘碎片周围存在着大量的iba1阳性小胶质细胞，且在这些小胶质细胞胞内检测到大量髓鞘碎片，表明体内hvcn1抗体中和hvcn1通道后，小胶质细胞仍能够吞噬髓鞘碎片。
[0063]
为了进一步研究髓鞘碎片周围表达hvcn1蛋白的细胞中各类细胞所占的比例，在成年小鼠脑内注射cfse标记的髓鞘，，注射用量及方法参照1.2。48h后，对小鼠进行灌流切片，方法同1.3。通过免疫荧光染色检测hvcn1蛋白和脑内主要细胞类型的表面标志物双标的情况。具体的，利用一抗goat anti-iba1抗体、二抗cy3-conjugated donkey anti-goat抗体和dapi对小胶质细胞进行免疫荧光染色封片，利用一抗goat anti-sox10抗体、二抗cy3-conjugated donkey anti-goat抗体和dapi对少突胶质细胞进行免疫荧光染色封片,利用一抗chicken anti-gfap抗体、二抗cy3-conjugated donkey anti-chicken抗体和dapi对星形胶质细胞进行免疫荧光染色封片,利用一抗guinea pig anti-neun抗体、二抗cy3-conjugated donkey anti-guinea pig抗体和dapi对神经元进行免疫荧光染色封片,利用一抗rabbit anti-hvcn1抗体、二抗alexa fluor 647-conjugated donkey anti-rabbit抗体和dapi对hvcn1蛋白进行免疫荧光染色封片，方法同1.4。采用荧光显微镜对髓鞘碎片进行拍照，结果如图3b～3c所示。图3b～3c中结果显示，髓鞘碎片周围表达hvcn1蛋白的细胞以iba1阳性小胶质细胞为主(图3b)；在髓鞘碎片周围表达hvcn1蛋白的细胞中，iba1阳性小胶质细胞占比高达90％，sox10阳性少突胶质细胞仅占10％左右，几乎没有gfap阳性星形胶质细胞和neun阳性神经元(图3c)；上述结果统计方法同1.5。上述结果表明，髓鞘碎片周围的细胞中表达hvcn1蛋白的细胞主要是小胶质细胞，证明hvcn1抗体主要通过中和小胶质细胞上的hvcn1通道发挥促进髓鞘清除作用。
[0064]
本公开提供的hvcn1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物中的应用，hvcn1抗体能够增强小胶质细胞或巨噬细胞的迁移能力进而促进其向损伤区募集，吞噬损伤区的髓鞘碎片，实现髓鞘碎片的清除，为髓鞘碎片的清除提供了一种新方法，从根本上起到治疗髓鞘碎片堆积疾病的作用；并且服用安全性好，成本降低，患者依从性高。
[0065]
需要说明的是，本公开的实施例还可以以下方式进一步描述：
[0066]
hvcn1抗体在制备治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物中的应用。
[0067]
可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物包括治疗髓鞘碎片堆积疾病的药物。
[0068]
可选地，所述治疗髓鞘碎片堆积疾病的药物包括促进髓鞘碎片清除的药物。
[0069]
可选地，所述促进髓鞘碎片清除的药物包括增强小胶质细胞或巨噬细胞的迁移来促进髓鞘碎片清除的药物。
[0070]
可选地，所述神经退行性疾病包括多发性硬化症、阿尔兹海默症、帕金森综合征、脊髓侧索硬化症和亨廷顿舞蹈症。
[0071]
可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物是以hvcn1抗体作为唯一活性成分或者是包含hvcn1抗体的药物组合物。
[0072]
可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物包括采用药学上可接受的辅料制成药学上可接受的任意剂型。
[0073]
可选地，所述治疗神经损伤或神经退行性疾病的药物包括汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、脂质体制
剂、气雾剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、膜剂和海绵剂中的至少一种。。
[0074]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0075]
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。