5-羟色胺受体亚型3和4及其拮抗剂在治疗胆囊切除术后腹泻中的用途的制作方法

1.本发明涉及基础和临床医药技术领域，特别是涉及一种5-羟色胺受体亚型3和4及其拮抗剂在治疗胆囊切除术后腹泻中的用途。


背景技术：

2.胆囊作为消化系统中一个非常重要的器官，主要发挥储存和浓缩胆汁的功能。胆囊在机体进食时收缩，排出大量浓缩的胆汁协助消化。胆囊疾病是外科常见的疾病之一，主要包括胆囊结石。胆囊切除术是现有的治疗有症状的胆囊结石最好的治疗手段，其安全性随着外科微创技术的发展逐渐得以提升。早期观点认为胆囊切除术是一项安全可靠、并发症少的手术，然而，近年来人们开始关注胆囊切除的并发症。
3.在众多的术后并发症中，胆囊切除术后腹泻(post-cholecystectomy diarrhea，pcd)的发生率很高，在2％-58％不等。胆囊疾病的患病率较高，因此pcd病人数量较大。pcd病人主要表现在肠道功能的改变且这一改变长期存在，例如排便次数增加、排便紧急、粪便变稀等，这些症状符合慢性腹泻的诊断标准(持续4周以上的粪便形状改变和排便次数增加)。pcd虽不会危及术后患者的生命，但对患者的生活质量影响很大，然而现有的证据都未能阐述其发生机制且临床尚无明显缓解症状的药物。因此，寻找合适的治疗pcd的药物是一件亟待解决的基础和临床医药的难题。
4.肠道菌群数量庞大，主要定居于人类的结肠中，越来越多的证据指出肠道微生态在维持人体正常生理功能以及某些疾病的病理生理发展过程中都发挥了重要作用。胃肠道作为消化系统的主要组成部分，其发挥正常的消化吸收功能主要依赖于肠道菌群，然而机体内外部因素的改变对肠道菌群的影响较大，肠道菌群紊乱会引起胃肠功能的紊乱，从而导致疾病的发生，例如肠易激综合征(ibs)和炎症性肠病(ibd)。将健康志愿者的粪菌移植到ibs或ibd患者重塑肠道微生态逐渐成为治疗这两种疾病的行而有效的临床疗法，这更加说明了肠道微生态对维持肠道功能的重要性。
5.现有的证据证明了术后腹泻患者肠道微生态的改变与腹泻的相关性，研究结果显示pcd患者的菌群较非腹泻患者的差异很大，主要表现在菌群丰富度和均匀度的降低，同时菌群组成也发生明显改变，例如门水平的厚壁菌门减少、拟杆菌门增加。由于胆汁酸与肠道菌群有着非常紧密的相关性，例如某些胆汁酸可以直接破坏细菌的细胞壁导致细菌死亡，而细菌在初级胆汁酸形成次级胆汁酸的过程中发挥了重要作用。胆囊切除后进入结肠内的胆汁酸的量增加，因而胆囊切除后结肠内的胆汁酸代谢改变可能是术后腹泻菌群改变的原因之一。然而，胆囊切除术后肠道菌群改变是否是导致腹泻的直接原因尚无实验证实。
6.5-羟色胺(serotonin，5-ht)是人体内重要的神经递质，95％左右的5-ht在肠道中产生，主要经肠道的嗜铬样细胞中5-羟色胺羟化酶1(tph1)将前体物质5-羟基色氨酸(5-htp)转化成5-ht。色氨酸代谢主要受肠道菌群调控，研究表明无菌小鼠体内的5-ht含量比正常小鼠明显降低。大量研究表明腹泻型肠易激综合征(ibs-d)患者体内5-ht水平明显升
高，而便秘型肠易激综合征(ibs-c)则水平降低，进一步提示5-ht是影响肠道正常蠕动功能的重要物质。5-ht在肠道内主要发挥刺激肠道蠕动的作用，而这种效应需通过与其受体结合。5-ht的受体有7大家族，人体内共13种受体，其中亚型3和亚型4主要分布在肠道内。5-ht在pcd中如何改变尚未可知，且5-ht3和4受体是否参与5-ht刺激肠道蠕动以及靶向抑制这两个受体是否具有治疗pcd的效果也无证据阐明。
7.阿洛司琼是美国fda批准的可用于治疗ibs-d的有效药物，其作用机理是通过阻断5-ht与5-ht3受体结合，从而阻断5-ht对肠道蠕动的刺激作用。很多阿洛司琼治疗ibs-d的临床实验都指出其较好的临床疗效，然而其是否能用于治疗胆囊术后腹泻尚无证据表明。gr113808是5-ht4受体靶向抑制剂，然而其治疗pcd的疗效如何也是未知。


技术实现要素：

8.本发明主要解决的技术问题是提供一种5-羟色胺受体亚型3和4及其拮抗剂在治疗胆囊切除术后腹泻中的用途，揭示了术后肠道菌群改变是导致pcd的致病因素之一并研究5-ht在该过程中发挥的重要作用，同时确认了5-ht3和4受体在pcd模型小鼠中表达量明显升高，应用阿洛司琼和gr113808治疗模型小鼠腹泻，具有很好疗效。
9.为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种5-羟色胺受体亚型3和4作为药物靶点在治疗胆囊切除术后腹泻中的用途
10.在本发明一个较佳实施例中，抑制5-羟色胺的合成在治疗胆囊切除术后腹泻中的用途。
11.在本发明一个较佳实施例中，所述胆囊切除术后腹泻的模型是通过粪菌移植的方法构建的。
12.提供一种5-羟色胺受体亚型3和4的拮抗剂在治疗胆囊切除术后腹泻中的用途。
13.在本发明一个较佳实施例中，所述拮抗剂为阿洛司琼及其生理上可接受的盐和溶剂化物。
14.在本发明一个较佳实施例中，所述拮抗剂为gr113808及其生理上可接受的盐和溶剂化物。
15.本发明的有益效果是：本发明公开了5-ht受体3和4是胆囊切除术后腹泻的治疗靶点，为拮抗剂阿洛司琼和gr113808在临床医药领域中的应用提供一种新的适应症。通过将人的粪菌移植给抗生素处理过的无菌化小鼠体内，本发明首次阐述胆囊切除术后肠道菌群改变是导致术后腹泻的直接因素。同时菌群紊乱所致的腹泻主要由于结肠的蠕动加快导致，通过分析人源化小鼠体内菌群的功能，初步确认了细菌的代谢产物5-ht可能是导致腹泻的关键物质，检测小鼠体内5-ht的含量以及其合成代谢的关键酶，发现腹泻小鼠5-ht合成明显增加。由于5-ht需要通过与受体结合发挥促进结肠蠕动的功效，因此，本研究还检测到腹泻小鼠结肠两种5-ht受体(5-ht3r和5-ht4r)表达明显增加并指出这两种受体是治疗术后腹泻的靶点。基于以上结果，分别选择两种受体的特异抑制剂，发现它们都有缓解腹泻小鼠症状的效果。本发明的活性物质阿洛司琼已被fda批准用于临床腹泻型肠易激综合征的治疗，安全低毒，药理作用强，具有容易吸收、稳定性好等特点。因此，本发明系统阐述了阿洛司琼以及gr113808治疗胆囊切除术后腹泻的疗效。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
17.图1中，图1a人源化肠道菌群移植的操作步骤。先口服抗生素构建无菌状态，然后粪菌移植，7天后测结肠通过时间和粪便含水量；
18.图1b显示腹泻小鼠粪便明显比正常组和非腹泻组的松软。每组共选取3只小鼠的粪便进行拍照；
19.图1c显示腹泻小鼠结肠通过时间明显缩短。左边是所有小鼠的统计柱状图，右边是每个临床病人样本对应的统计图，该实验通过给小鼠灌胃含5％胭脂红的0.6％的甲基纤维素指示剂，记录小鼠第一粒红色粪便为改小鼠的结肠通过时间；
20.图1d显示腹泻组小鼠粪便含水量明显增加。通过收集并称重小鼠的粪便，计算含水量；
21.图2中，图2a显示腹泻小鼠结肠蠕动明显加快。予以指示剂灌胃，分别在40、60和80分钟后解剖小鼠，观察指示剂在肠道的位置并进行拍照。
22.图2b显示腹泻小鼠结肠蠕动明显加快，该图为结肠内指示剂所蠕动的距离比例，腹泻小鼠在灌胃指示剂40、60和80分钟后结肠蠕动都明显比其他两组快；
23.图2c显示3组小鼠的结肠长度。对3组小鼠的结肠进行测量并记录；
24.图3中，图3a显示2组小鼠结肠内菌群的kegg功能预测的t-test图。图中列出了有统计学差异的细菌功能；
25.图3b显示菌群的色氨酸代谢可能贡献了腹泻小鼠的表型。将上图中在腹泻小鼠中明显富集的功能进行随机森林分析；
26.图4中，图4a显示腹泻小鼠血清中5-ht水平明显升高。elisa检测小鼠3组小鼠血清中5-ht的浓度；
27.图4b显示显示腹泻小鼠结肠中5-ht水平明显升高。elisa检测小鼠3组小鼠血清中5-ht的浓度，bsa法检测结肠蛋白浓度并进行校准；
28.图4c显示3组结肠中嗜铬样细胞特异性标志物表达无差异。pcr检测结肠组织中嗜铬样细胞特异性标志物cga的表达，β-actin作为内参；
29.图4d显示腹泻小鼠结肠组织中5-羟色胺羟化酶1(tph1)表达量明显增加。pcr检测3组小鼠结肠组织中5-ht合成的关键酶(5-羟色胺羟化酶1，tph1)的表达，β-actin作为内参；
30.图4e显示腹泻小鼠结肠组织中5-ht回收通道sert表达明显降低。pcr检测3组小鼠结肠组织中5-ht回收通道(sert)的表达，β-actin作为内参；
31.图4f显示3组小鼠结肠组织中5-ht降解酶单胺氧化酶a(maoa)无差异。pcr检测3组小鼠结肠组织中5-ht降解酶单胺氧化酶a(maoa)的表达，β-actin作为内参；
32.图4g，h显示腹泻小鼠结肠组织中5-ht受体亚型3和4表达量明显升高。pcr检测3组小鼠结肠组织中5-ht的受体5-ht3r和5-ht4r的表达，β-actin作为内参；
33.图5中，图5a，b分别是本研究所用的两种5-ht受体的特异性抑制剂阿洛司琼和
gr113808的分子结构。
34.图6中，图6a显示使用受体抑制剂治疗腹泻模型小鼠的示意图；
35.图6b显示注射两种受体抑制剂可以明显改善小鼠的粪便性状。该图是5组小鼠粪便的大体拍照图片；
36.图6c显示两种受体抑制剂能减慢肠道蠕动时间。该实验通过给小鼠灌胃含5％胭脂红的0.6％的甲基纤维素指示剂，记录小鼠第一粒红色粪便为改小鼠的结肠通过时间；
37.图6d显示受体抑制剂可以降低腹泻小鼠的粪便含水量。通过收集并称重小鼠的粪便，计算含水量；
38.图6e显示受体抑制剂明显减慢腹泻小鼠结肠蠕动。观察指示剂在肠道的位置并进行拍照；
39.图6f显示结肠内指示剂蠕动的距离比例，腹泻小鼠在灌胃指示剂60和80分钟后结肠蠕动都明显比正常组和非腹泻组快，而受体抑制剂组明显减慢；
40.图6g显示5组小鼠的结肠长度。对5组小鼠的结肠进行测量并记录。
具体实施方式
41.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
42.实施例一：构建胆囊切除术后腹泻的动物模型
43.收集临床病人样本，包括正常人群、术后非腹泻人群和术后腹泻人群，加入粪菌保存液后低温冷冻保存。构建人源化菌群小鼠模型，予以5联抗生素(万古霉素、新霉素、甲硝唑、两性霉素b和氨苄青霉素)口服处理10天构建无菌小鼠，然后分别灌胃不同组人群的粪菌5次，灌胃结束后7天通过灌胃含5％胭脂红和0.6％甲基纤维素的指示剂以及计算粪便含水量评估腹泻情况(图1a)。结果显示腹泻小鼠粪便比对照组松软，提示肠道功能改变；腹泻小鼠肠道通过时间明显减少，提示腹泻小鼠肠道蠕动加快；同时计算3组小鼠粪便含水量，结果显示腹泻组小鼠含水量增加(图1)。这些结果显示提示胆囊切除术后肠道菌群改变是导致术后腹泻的原因，胆囊切除术后肠道菌群改变能导致术后腹泻。
44.本发明首先通过粪菌移植的方法构建胆囊切除术后腹泻小鼠模型。如图1所示，通过成熟的肠道菌群人源化技术的应用，成功构建了腹泻小鼠，即腹泻小鼠结肠通过时间和粪便含水量明显增加。
45.实施例二：胆囊切除术后腹泻的原因
46.为了研究胆囊切除术后腹泻组肠道菌群改变导致的肠道通过时间增快的发生的具体肠道节段。本研究通过分别在灌胃指示剂后40、60和80分钟后对不同组小鼠进行大体解剖并明确指示剂在肠道中的位置。结果表明，灌胃指示剂后40分钟，对照的两组小鼠指示剂刚到回盲瓣，而腹泻组已经通过回盲部，进入结肠，同时，60分钟和80分钟后，腹泻小鼠结肠中指示剂的位置占结肠长度的比例都比对照组小鼠的大，结肠大体图片如图2a所示，统计结果在图2b中展示。3组小鼠的结肠长度无统计学差异，说明粪菌移植不会改变结肠长度，而是加快了结肠的蠕动，因此胆囊切除术后腹泻主要是结肠蠕动增快导致的。
47.实施例三：筛选腹泻组小鼠结肠中富集的菌群
48.以上结果可知，腹泻小鼠结肠蠕动明显增快提示腹泻的病变部位主要发生在结肠，因此，本研究对3组小鼠结肠中的内容物进行16s rrna测序，分析粪菌组成差异。同时由于肠道菌群具有代谢结肠内物质的能力，如胆汁酸、短链脂肪酸和色氨酸，产生的代谢小分子对维持肠道的正常功能具有重要作用。因此，本研究对分析的菌群的数据进行kegg功能分析，通过t-test检验比较非腹泻和腹泻组小鼠粪菌中有差异的功能，结果3a展示了众多有差异的细菌的功能，比如丙酮酸代谢、色氨酸代谢主要在腹泻小鼠中富集。而后，将腹泻组明显富集的细菌功能进行随机森林分析，筛选对腹泻有贡献的细菌功能，结果显示，赖氨酸降解和色氨酸代谢是主要贡献腹泻的细菌功能。又由于色氨酸代谢中一个重要的物质5-羟色胺是调节肠道蠕动的重要物质，因此，本研究推测5-ht代谢的改变可能是导致术后腹泻的重要机制之一。
49.实施例四：腹泻组小鼠结肠中5-ht合成变化
50.首先用elisa方法检测3组小鼠血清中5-ht的含量，结果显示相比于移植了正常人和非腹泻人群的小鼠，腹泻组小鼠的血清中5-ht明显增加(图4a)，而后检测结肠组织中5-ht的含量，类似地，腹泻小鼠结肠中5-ht含量明显增加。5-ht主要由肠道中的嗜铬样细胞经其前体物质5-羟基色氨酸(5-htp)转化而来，因此，本研究进一步检测了嗜铬样细胞特异性标志物cga的表达，结果显示3组小鼠结肠组织中cga并无统计学差异，提示嗜铬样细胞数目并无改变(图4b)，同时也表明5-ht含量的增加并不是促进其合成的细胞增多引起的，可能是嗜铬样细胞合成5-ht的功能增加了。进一步地，本研究分析了结肠组织中5-ht合成的关键酶5-羟色胺羟化酶1(tph1)的表达量水平，结果表明，腹泻组小鼠结肠中tph1的表达量明显比其他两组小鼠的高，提示5-ht的升高与其合成功能的增加有关。同时，本研究还检测了5-ht代谢过程中的回收受体sert的表达，结果显示腹泻小鼠5-ht的回收受体受抑制，即5-ht回收进入肠道细胞的量有所减少，而经回收进入肠道后需经单胺氧化酶a将5-ht代谢掉，因此，本研究还检测了3组小鼠肠道中maoa的表达水平，结果显示3组之间并无差异。以上结果表明，腹泻小鼠结肠内5-ht的合成代谢明显增加，同时回收减少，导致结肠内5-ht堆积。
51.5-ht需要与其受体结合后才能发挥其功效，现有的证据鉴定了5-ht受体有7大家族，人类存在13种，其中主要是5-ht3和5-ht4两种亚型分布于胃肠道，因此，本研究分别检测结肠中5-ht3r和5-ht4r的表达量，结果显示腹泻小鼠相比于两组对照组，结肠中5-ht3r和5-ht4r的表达明显升高。以上结果系统阐述了5-ht在导致胆囊切除术后腹泻的重要作用，同时也提示靶向抑制肠道中的5-ht受体可能具有治疗腹泻的效果。
52.通过研究胆囊切除术后腹泻模型动物腹泻发生的机制，腹泻组小鼠结肠中5-ht合成明显增加，得到了5-ht治疗靶点。本发明通过对小鼠菌群进行kegg通路分析，结果显示腹泻小鼠菌群的色氨酸代谢(tryptophanmetabolism)明显富集，如附图3所示，又由于5-羟色胺(5-ht)是色氨酸代谢中一种重要的物质，且已经被证实有促进肠道蠕动的功能。因此本发明检测了模型小鼠体内的5-ht水平，研究发现腹泻小鼠的血清中以及结肠组织中5-ht水平明显升高。同时，本发明还检测了与5-ht代谢相关的关键酶，5-ht羟化酶1(tph1)，发现酶的表达量增加。由于5-ht需要与其受体结合发挥作用，因此本发明检测了肠道中的5-ht受体3和4，发现受体表达也明显增加，因此腹泻小鼠的腹泻表型与其体内5-ht合成增加有关，结果如附图4所示。上述发现显示5-ht受体3和4是治疗胆囊切除术后腹泻的治疗靶点。
53.实施例五：改善小鼠腹泻症状的方法
54.为了研究治疗腹泻的方法，本研究基于以上结果，选择了针对两种5-ht受体的特异性拮抗剂，阿洛司琼(5-ht3r抑制剂)和gr113808(5-ht4r抑制剂)，抑制剂的分子结构如图5a和5b所示。与之前的造模方法类似，本次实验在造模后对移植腹泻组人群粪菌的小鼠进行受体拮抗剂治疗，实验操作方案如图6a所示。而后将5组小鼠的粪便进行拍照，图6b显示腹泻组小鼠与对照组小鼠的粪便相差甚大，而经两种抑制剂治疗后，小鼠的粪便趋向于对照组。同时，用上述的方法检测5组小鼠的肠道通过时间和粪便含水量，结果显示，腹泻模型组小鼠的结肠通过时间明显缩短，而经药物治疗后结肠通过时间又明显增加，同样地，腹泻小鼠的粪便含水量也是最高，而药物治疗的两组小鼠趋近于正常对照组。同时，本实验还研究了结肠蠕动情况，结果(图6e和f)显示，腹泻组小鼠结肠蠕动加快，而经药物治疗后，药物治疗组小鼠的结肠蠕动减慢。而5组的结肠长度并无明显差异。以上结果表明，靶向抑制5-ht的受体能够显著改善腹泻表型。
55.本发明针对胆囊切除术后腹泻的发生机制选择合适的治疗药物，5-ht受体亚型3和4拮抗剂阿洛司琼和gr113808，发现其治疗胆囊切除术后腹泻的效应。本发明选用了两种5-ht受体拮抗剂，即阿洛司琼(针对5-ht3受体)和gr113808(针对5-ht4受体)，如图5所示。对模型小鼠进行药物干预发现腹泻小鼠的表型明显缓解，结果如附图6所示，因此阿洛司琼和gr113808对胆囊切除术后腹泻具有明显的治疗效果，同时进一步确认显示了5-ht受体3和4是治疗胆囊切除术后腹泻的药物靶点，靶向抑制5-ht3r和5-ht4r能显著改善小鼠的腹泻症状。
56.以上实验同时表明，5-ht在胆囊切除术后腹泻的发生过程中发挥了重要作用，而选择性地靶向抑制5-ht受体可以明显改善腹泻症状，从而治疗胆囊切除术后腹泻。
57.综合以上所述，本发明构建了胆囊切除术后腹泻模型，同时指出肠道菌群改变引起的5-ht代谢改变是导致术后腹泻的重要机制之一，最后，选用了两种5-ht受体拮抗剂并证明了其治疗效果。本专利首次提出阿洛司琼和gr113808可以治疗胆囊切除术后腹泻，即胆囊切除术腹泻可以是这两种药的临床适应症。
58.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。