一种3D干细胞微球胶囊、其制备方法及在移植治疗领域的应用

一种3d干细胞微球胶囊、其制备方法及在移植治疗领域的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种3d干细胞微球胶囊、所述3d干细胞微球胶囊的制备方法及其在干细胞移植治疗领域的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.近年来，随着生物医疗技术的发展，干细胞移植为许多疾病的治疗提供了新的选择。干细胞强大的自我更新和多向分化潜能，使其具备修复组织器官损伤的功能，在临床医学领域具有广阔的应用前景。
4.传统的干细胞体外扩增方式为单层贴壁培养，在贴壁状态下，细胞无法实现类似于体内的细胞-细胞间和细胞-细胞外基质间的相互作用，这使得细胞形态、基因表达、对刺激的反应能力等均受到一定程度的限制，无法充分发挥其生物学特性。与贴壁培养相比，3d细胞球体培养可以模拟细胞在体内的生长状态，增强细胞-细胞间和细胞-细胞外基质间的相互作用，促进干细胞的再生和分化潜能，已成为当前干细胞研究的热点之一。
5.然而，3d细胞球在体内应用时仍面临许多挑战，病灶部位的炎症微环境是阻碍干细胞修复损伤组织的关键因素。在炎症微环境中，存在细菌及其代谢产物、氧化应激、各种酶和抗体的攻击等，不仅造成机体组织的破坏，也大大减弱了外源性干细胞的生物功能，从而导致干细胞移植效果不够理想。因此，在炎症微环境中保护干细胞、通过干细胞移植改善炎症微环境、最大程度地发挥干细胞的生物学功能，是提高干细胞移植疗效的重要途径。
6.金属多酚网络(metal-phenolic networks，mpn)是指多价金属离子(如三价铁离子，fe
3
；三价铝离子，al
3
；二价铜离子，cu
2
；二价锌离子，zn
2
；二价锰离子，mn
2
；二价镍离子，ni
2
；二价锶离子，sr
2
；二价镁离子，mg
2
等)和多酚类物质(槲皮素，quercetin；单宁酸，tannic acid；多巴胺，dopamine；儿茶酚，catechol；没食子酸，gallic acid；表没食子儿茶素没食子酸酯，egcg等)通过配位作用形成复合物。近年来，mpn作为一种表面修饰技术，因其具有粘附性好、生物相容性高、易于制备等优点，被广泛应用于载药、生物成像和催化等生物医学领域。最新研究表明，金属离子和多酚同样可以在生物界面进行组装，mpn作为一种良好的生物界面包覆材料，可以包覆在细菌、酵母菌、动物细胞以及病毒等表面。li等和park等人均报道了在酵母菌表面包覆mpn外壳，不仅有效保护其免受紫外照射及其他外源性有害物质的侵害，还能使磁性纳米粒子、dna以及核磁共振成像造影剂等嵌合到mpn表面，为细胞表面工程提供了一种多功能材料；juno lee等人对哺乳动物细胞表面进行mpn修饰，在保证细胞营养物质、氧气、代谢产物等自由交换的同时，赋予细胞更强的抗应激损伤能力。以上研究结果表明，mpn可以在不同的生物界面(细菌、酵母菌和动物细胞)进行自组装形成mpn。
7.目前，尚未有使用mpn在3d细胞球表面进行修饰制备新型3d干细胞微球胶囊，并利用其抵御炎症微环境刺激的报道。


技术实现要素：

8.针对上述研究背景，本发明认为使用mpn在3d细胞球表面进行修饰制备新型3d干细胞微球胶囊，有利于进一步发挥干细胞的生理活性，提高干细胞在机体中的存活率。
9.基于上述技术目的，本发明提供以下技术方案：
10.本发明第一方面，提供一种3d干细胞微球胶囊，所述3d干细胞微球胶囊包括内核和壳层，所述的内核为干细胞微球，壳层为金属-多酚网络涂层。
11.首先应当说明的是，上述第一方面提供的3d干细胞微球胶囊中，其内核干细胞微球是一种干细胞的聚集体，由多层干细胞相互粘附而成，采用这种干细胞的聚集体形式优势在于：(1)相比对于单个干细胞进行包覆的形式，本发明提供的这种3d干细胞微球具有更好的抵抗外界刺激的能力，在干细胞移植后，能够有效减少细胞凋亡的概率；(2)本发明提供的这种细胞聚集体更接近于一种类器官，除了能够分泌趋化因子实现抗炎作用，还更加适用于类器官培养和移植领域。
12.上述第一方面所述的金属-多酚网络涂层中，金属离子为ti
4
、al
3
、fe
3
、cu
2
、zn
2
或ni
2
中的一种或几种的组合，金属离子通过配位作用与多酚结合形成复合物。所述金属离子的来源为含有上述金属离子的金属盐化合物，所述金属盐优选为水溶性盐，如相应金属离子的氯化物、硝酸盐或硫酸盐。
13.第一方面进一步优选的一种实施方式中，所述金属离子优选为fe
3
；上述优选的实施方式中，所述金属盐的浓度为0.1～20mg/ml。
14.所述多酚选自槲皮素(quercetin，que)、单宁酸(tannic acid，ta)、多巴胺(dopamine，da)、儿茶酚(catechol)、没食子酸(gallic acid)或表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)中的一种或几种。本发明验证的一种可行的实施方式中，所述多酚为单宁酸。
15.上述优选的技术方案的一种可行的实施方式中，所述金属-多酚网络涂层为一种fe
iii-ta构成的包覆涂层；所述包覆涂层的层数为1～10层；进一步的，为1～8层；更进一步的，为1～5层。
16.所述干细胞为包括但不限于胚胎干细胞、诱导性多能干细胞(ips)、间充质干细胞，间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、牙周膜干细胞中的一种；本发明提供的一种实例中，所述干细胞为牙周膜干细胞。
17.另外，本发明第二方面，还提供第一方面所述3d干细胞微球胶囊的制备方法，包括将多酚和金属离子溶液依次加入干细胞微球的悬液中混均，再加入缓冲溶液调节体系ph值，即可得到所述3d干细胞微球胶囊；所述制备方法的特征在于，所述干细胞微球采用如下方式制备：收集干细胞加入少量培养基重悬获得干细胞培养液，将所述干细胞培养液接种于培养皿盖内侧，翻转培养皿使培养液形成悬液，孵育一段后获得干细胞微球。
18.应当明确的是，上述制备方法中，其他制备方法得到的干细胞微球也能够适用上述金属-多酚网络涂层的包覆，所述干细胞微球制备方法包括悬滴法、低粘附培养法、搅拌瓶法、旋转式生物反应器法、微流控技术法、壳聚糖薄膜法、温度控制法等。本技术使用的方
法为悬滴法，其制备的具体步骤如下：
19.向贴壁生长的干细胞中加入消化液、清洗并收集，加入少量培养液重悬获得干细胞悬液并进行细胞计数，将培养皿盖内侧朝上放置，将干细胞悬液滴加至培养皿盖内侧，滴加后缓慢翻转培养皿盖，置于洁净的平面孵育48-72小时后收集培养液获得干细胞微球；所述培养液中细胞浓度为20000-50000个细胞/30～50μl。
20.在上述干细胞微球的制备中，所述培养皿盖放置于洁净的平面上进行培养，基于本领域人员的一般理解，干细胞培养对环境具有一定的要求，如培养温度，如在co2环境中培养等，因此，所述洁净平面的具体实例可能来源于孵箱、生物培养柜、细胞培养箱等。
21.进一步的，所述干细胞悬液的制备方式如下：将长至80％-90％的贴壁培养的干细胞用加入胰酶消化0.8～1.2分钟，终止消化后，收集至10～20ml离心管中，1000～1500rpm离心4～6分钟获得干细胞沉淀，向干细胞沉淀中加入培养基重悬后计数。
22.进一步的，培养液接种至培养皿盖的剂量为24000～26000个细胞/30～40μl。
23.另外，第二方面所述金属-多酚网络涂层的制备中，所述金属离子溶液中金属盐的浓度为0.1～20mg/ml，所述金属盐与多酚的摩尔比为1：5～5：1。
24.优选的，所述缓冲液为ph＝7～8的3-吗啉丙磺酸(mops)缓冲液，所述mops缓冲液浓度为15～25mm。
25.在多酚-金属网络的构建过程中，多酚和金属离子间的化学配位作用随着ph的升高而增强；在ph》7的条件下，金属多酚在较强的化学配位作用以及氢键、苯环共轭等作用力下在细胞微球表面自发组装成超分子网络。由于多酚是一种酸性物质，因此，本技术制备过程中还引入了缓冲溶液，对ph进行调节，从而实现多酚-金属网络涂层的构建。
26.本发明第三方面，提供第一方面所述3d干细胞微球胶囊在干细移植治疗领域的应用。
27.所述在3d干细胞微球移植治疗领域的应用，包括但不限于以下任意一种形式：
28.(1)将第一方面所述3d干细胞微球胶囊施用于有治疗需求的个体；
29.(2)将第一方面所述3d干细胞微球胶囊用于制备药物；
30.(3)用于制备包含第一方面所述3d干细胞微球胶囊的药物组合物。
31.上述(1)方面的应用中，所述有治疗需求的个体包括但不限于牙周炎等炎症的治疗、促进血管生成和骨再生等。
32.上述(2)方面所述药物中，以第一方面所述3d干细胞微球胶囊作为唯一活性成分，所述药物中还包括药学上所必需的载体。
33.上述(3)方面所述药物组合物中，包括第一方面所述3d干细胞微球胶囊，还包括其他活性成分，所述其他活性成分的添加视治疗需求进行调整。
34.以上一个或多个技术方案的有益效果是：
35.1、本发明的制备方法利用mpn的自组装能力在细胞微球表面进行组装，开发了一种mpn包覆3d细胞微球的胶囊结构(spheroid@[fe
iii-ta]胶囊)，制备的干细胞微球胶囊内核为细胞微球，外壳为mpn。mpn外壳可以保护细胞球抵御多种有害刺激，增强干细胞对炎症微环境的耐受性，提高干细胞移植细胞的存活率和治疗效果。
[0036]
2、mpn外壳可自行逐步降解，细胞球内部细胞可随之释放，在目标组织部位继续发挥作用。
[0037]
3、本发明采用金属多酚配位化学在干细胞微球表面进行组装，胶囊大小可以通过控制单个细胞球内细胞数目进行调控，mpn层的厚度可以通过金属和多酚的含量和比例以及包覆次数进行调控。本发明的制备方法简单，可操作性好，有效增强干细胞微球应对有害刺激。
附图说明
[0038]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0039]
图1为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊；
[0040]
其中，图1a为肉眼观，图1b为光学显微镜图像。
[0041]
图2为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊的形貌表征；
[0042]
其中图2a为sem图，图2b为eds分析结果。
[0043]
图3为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊的荧光标记外壳的共聚焦图片；
[0044]
其中，图3左上为荧光(罗丹明b，rhodamine b)标记的胶囊外壳；
[0045]
图3左下为钙黄绿素(calcein-am)标记的活细胞球；
[0046]
图3右图为左侧两张荧光图片的merge图像。
[0047]
图4为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊的mpn外壳降解图。
[0048]
图5为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊可以减少进入3d细胞球内的细菌量；
[0049]
其中，图5a为荧光图，图5b为流式图。
[0050]
图6为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊可以降低h2o2刺激下3d细胞球内ros的产生；
[0051]
其中，图6a为荧光图，图6b为流式图。
[0052]
图7为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊可以降低h2o2刺激下3d细胞球内细胞的凋亡。
[0053]
图8为实施例1制备的spheroid@[fe
iii-ta]微球胶囊与对照组的细胞活性荧光图。
具体实施方式
[0054]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0055]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0056]
术语解释：
[0057]
干细胞微球：本技术文件中所述干细胞微球，表示由干细胞相互黏附聚集形成的多层细胞构成的球状结构。
[0058]
由于体内体外各种复杂的微环境存在，干细胞微球在移植入体内过程中面临各种不良刺激，从而导致干细胞微球存活率不高，本发明提供了一种采用mpn在3d细胞球表面进行修饰的3d干细胞微球胶囊；通过mpn层包覆可以通过对外界不良刺激的保护来有效提高3d干细胞微球的存活率，提高干细胞移植的治疗效果。
[0059]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0060]
实施例1
[0061]
一种3d干细胞微球胶囊(stem cell spheroid@mpn microcapsule)的制备方法，包括步骤如下：
[0062]
将长至80％的贴壁培养的间充质干细胞用胰酶消化1分钟，终止消化后，收集至15毫升离心管中，1200rpm，离心5分钟，重悬后计数，按25000个细胞/35微升的比例将细胞悬滴滴加至倒置的培养皿盖上方，缓慢翻转培养皿盖，孵育48小时后形成mscs细胞微球。收集mscs细胞微球，无菌生理盐水洗涤、离心后加入490μl生理盐水重悬，将5μl ta(40mg/ml)和5μl fecl3·
6h2o(10mg/ml)依次加入到490μl细胞球悬液中，每加入一种成分，充分吹打混匀，之后加入500μl mops，用生理盐水洗涤3次，去除多余的ta和fecl3·
6h2o，重复上述步骤3次，得到新型3d干细胞微球胶囊。
[0063]
实施例2
[0064]
本实施例中，提供又一种3d干细胞微球胶囊(stem cell spheroid@mpn microcapsule)的制备方法，包括步骤如下：
[0065]
将生长至90％的贴壁培养的间充质干细胞用胰酶消化1.5分钟，终止消化后，收集至15毫升离心管中，1000rpm，离心6分钟，重悬后计数，按50000个细胞/50微升的比例将细胞悬滴滴加至倒置的培养皿盖上方，缓慢翻转培养皿盖，孵育72小时后形成mscs细胞微球。收集mscs细胞微球，无菌生理盐水洗涤、离心后加入500μl生理盐水重悬，将5μl ta(200mg/ml)和5μl fecl3·
6h2o(2mg/ml)依次加入到500μl细胞球悬液中，每加入一种成分，充分吹打混匀，之后加入500μl mops，用生理盐水洗涤3次，去除多余的ta和fecl3·
6h2o，重复上述步骤3次，得到新型3d干细胞微球胶囊。
[0066]
本发明针对上述实施例1中提供的3d干细胞微球胶囊的形貌进行观察，并对干细胞微球胶囊的降解性能和体外活性进行了测定。从图1可以看出，本发明提供的3d干细胞微球胶囊呈现近球形，经mpn包覆后细胞球外表面呈紫黑色。从图2a可以看出，经mpn包覆后细胞球外表面较为粗糙，元素分析结果显示干细胞微球胶囊有铁元素的分布；图3可看出干细胞微球表面包覆着mpn外壳。
[0067]
图4为将干细胞微球胶囊置于适合细胞粘附的培养板中，mpn外壳会逐渐降解，内部细胞逐渐贴壁，并从球体内部爬出。
[0068]
图5为体外细胞培养结果，在该测试中采用荧光标记的牙龈卟啉单胞菌与细胞微球共培养，通过观察荧光强度发现没有包覆多酚-金属网络的干细胞微球具有更强的荧光聚集，证明mpn外壳可保护干细胞微球减少牙龈卟啉单胞菌的侵入。
[0069]
图6为h2o2体外刺激细胞微球，发现干细胞微球胶囊中的细胞内ros的产生比未包被mpn外壳的细胞球内的ros明显减少。图7是检测了上述刺激处理后细胞的凋亡，发现干细胞微球胶囊中的凋亡细胞数比未包被mpn外壳的细胞球明显减少。图8是用活死细胞染色来
检测干细胞微球胶囊和未包被mpn外壳的细胞球分别在1，2，3天培养后的细胞活性，结果显示随着培养天数增加，未包被mpn外壳的细胞球活性弱于干细胞微球胶囊，说明干细胞微球胶囊结构有利于细胞的活性维持。
[0070]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。