一种可快速延伸的高保真DNA聚合酶及其制备方法和应用与流程

一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于重组dna聚合酶领域，具体公开了一种可以快速pcr的pfu dna聚合酶。


背景技术：

2.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)可以方便，快捷，准确地大量复制目的基因片段，是分子生物学研究中不可或缺的技术手段。在pcr反应中，dna聚合酶起着关键作用。
3.pfu聚合酶是dna聚合酶的一种，与其它在pcr反应中使用的聚合酶相比，pfu聚合酶具有出色的热稳定性，并且具有5
’→3’
聚合酶活性和3
’→5’
外切核酸酶活性，可在聚合酶链式反应中纠正错误掺入的碱基，使pcr反应的错配突变几率，保真性更高，在分子克隆和dna测序当中运用十分广泛。但缺点是，野生型pfu dna聚合酶在进行pcr反应时也存在不少缺陷，如延伸速率慢、延伸能力不够，无法对长片段的dna进行扩增。


技术实现要素：

4.针对现有技术不足，本发明的首要目的在于克服普通pfu聚合酶的不足，提供了一种可快速延伸的高保真dna聚合酶，内部代号为quick extend hi-fi dna聚合酶。本发明的第二个目的提供了上述可快速延伸的高保真dna聚合酶的制备方法及其应用。
5.本发明的技术方案如下：
6.可快速延伸的高保真dna聚合酶是由一种突变型pfu聚合酶与一定浓度的突变型pcna及突变型dutpase混合而成，其中突变型pfu聚合酶其氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.野生型pfu dna聚合酶氨基酸序列如seq id no:2所示，所述的突变型pfu dna聚合酶与之相比，具有以下特点：120位酪氨酸突变为赖氨酸，378位谷氨酰胺突变为赖氨酸，610位谷氨酸突变为异亮氨酸。
8.一种突变型pcna其氨基酸序列如seq id no:3所示。
9.所述的突变型pcna与氨基酸序列如seq id no:4所示的野生型pcna相比，具有以下特点：59位丝氨酸突变为缬氨酸，184位谷氨酸突变为精氨酸。
10.一种突变型dutpase其氨基酸序列如seq id no:5所示。
11.所述的突变型dutpase与氨基酸序列如seq id no:6所示的野生型dutpase相比，具有以下特点：35位丙氨酸突变为精氨酸，60位异亮氨酸突变为赖氨酸，139位精氨酸突变为丙氨酸。
12.本发明提供了编码所述突变型pfu dna聚合酶的dna分子，其碱基序列如seq id no:7所示。
13.一种重组表达载体，是将上述编码突变型pfu dna聚合酶的dna分子克隆入表达载体得到。
14.本发明提供了编码所述突变型pcna的dna分子，其碱基序列如seq id no:8所示。
15.一种重组表达载体，是将上述编码突变型pcna的dna分子克隆入表达载体得到。
16.本发明提供了编码所述突变型dutpase的dna分子，其碱基序列如seq id no:9所示。
17.一种重组表达载体，是将上述编码突变型dutpase的dna分子克隆入表达载体得到。
18.所述的表达载体均为原核表达载体；进一步为pet系列载体；更进一步为pet-28a。
19.一种能高效可溶表达上述突变型pfu dna聚合酶的工程菌，是将上述表达载体转化到工程菌中得到。
20.所述的工程菌均为大肠杆菌细胞；进一步为大肠杆菌bl21细胞。
21.上述可快速延伸的高保真dna聚合酶是由一种突变型pfu聚合酶与一定浓度的突变型pcna及突变型dutpase混合而成，其中突变型pfu聚合酶通过工程菌细胞株诱导表达、纯化制备得到；具体包括如下步骤：
22.(1)活化能高效表达可溶上述突变型pfu dna聚合酶的工程菌，得到一级菌种液；
23.(2)以一定比例将一级菌种液接种于含抗生素的lb培养液中，于35～38℃、150～200rpm条件下培养至菌液od600达到0.6～0.8，得到二级菌种液；
24.(3)向二级菌种液中加入iptg诱导剂，诱导浓度为0.8～1.2mm，在步骤(2)培养条件下培养2-5h后，离心收集菌体沉淀；
25.(4)向步骤(3)得到的菌体沉淀中加入预冷的裂解液，充分涡旋混匀；
26.(5)超声破碎菌体(菌体保持冰浴状态)；
27.(6)将破碎后的菌体进行70～80℃水浴保温20～40min,热处理后离心，去除沉淀；保留上清过滤，得到滤液；
28.(7)将滤液进行疏水亲和层析，收集含有目的蛋白的样品；
29.(8)把经疏水亲和层析收集的样品再经肝素-琼脂糖凝胶柱，收集含有目的蛋白的样品；
30.(9)最后将经肝素-琼脂糖凝胶柱收集的样品经阴离子交换层析，得到突变型pfu dna聚合酶。
31.步骤(1)中所述的活化优选包括如下步骤：取工程细胞株甘油菌划线，挑取单克隆，或者直接取所述的工程细胞株甘油菌，接种于含抗生素的lb培养液中，于35～38℃的条件下振荡培养过夜。
32.所述的振荡培养的条件优选如下：温度为37℃、转速为150～200rpm。
33.步骤(2)中所述的比例优选为按体积比1:400；抗生素优选为卡那霉素，浓度为50μg/ml。培养的条件如下：温度为37℃、转速为150～200rpm。
34.步骤(3)中所述的iptg的用量优选为按在菌液中的终浓度为1mm计算；诱导的条件为37℃诱导5h。
35.步骤(4)中所述的裂解液的组分如下：20mm tris-hcl,500mm nacl，ph8.0；裂解液＝1g：4～6ml配比计算；进一步按菌体：裂解液＝1g：5ml配比计算。
36.步骤(6)中所述的水浴的条件优选为75℃保温15min；离心的条件为4℃，12000r/min离心10min。
37.步骤(6)中所述的过滤是通过孔径不大于0.45μm的微孔滤膜过滤；进一步为通过孔径为0.45的微孔滤膜过滤。
38.步骤(7)中所述的疏水亲和层析所用的溶液：缓冲液a的组成：20mm tris-hcl、1m nacl，ph8.0；缓冲液b的组成：20mm tris-hcl，ph8.0。
39.步骤(8)中所述的肝素-琼脂糖凝胶柱所用的溶液：缓冲液c的组成：20mm tris-hcl、50mm nacl，ph8.0；缓冲液d的组成：20mm tris-hcl，1m nacl，ph8.0。
40.步骤(9)中所述的离子交换柱所用的溶液：缓冲液e的组成：20mm tris-hcl，200mm nacl，ph8.0；缓冲液f的组成：20mm tris-hcl，1m nacl ph8.0。
41.突变型pcna诱导表达、纯化制备方法同步骤(1)～(9)。
42.突变型dutpase诱导表达、纯化制备方法同步骤(1)～(9)。
43.使用bradford浓度测定试剂盒分别测定突变型pcna和dutpase的蛋白浓度。
44.将突变型pfu dna聚合酶分别与不同浓度突变型pcna和dutpase混合，在一定的pcr体系中进行不同基因片段的扩增。
45.所述突变型pcna。
46.一种pcr体系，所述pcr反应缓冲液的组成如下：tris-hcl、mgcl2、(nh4)2so 4
、kcl、triton x-100、bsa按照10～400mmol：1～3mmol：5～20mmol：5～20mmol：0.5～1.5ml：0.1～0.3g配比混合，ph值为8～10。
47.相对于现有技术，本发明具有以下优点：
48.(1)本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶，其中突变型pfu dna聚合酶与普通野生型pfu酶相比，保真度更高，pcr过程中出现碱基突变的概率降低；
49.(2)本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶中包含两种因子突变型pcna和突变型dutpase，扩增能力增强、扩增速度增快(2-4kb/min，是普通野生型pfu酶的4-8倍)，克服了普通pfu酶扩增能力差、产量低和扩增速度慢(0.5kb/min)的缺陷，极大地缩短了反应时间。
50.(3)本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶以λdna和人基因组为模板，均可以很好地扩增dna片段(≤21kb)。
51.(4)本发明的pcr反应缓冲液为可快速延伸的高保真dna聚合酶提供一个最佳的反应环境，使其更好地发挥pcr性能、。
附图说明
52.图1为本发明的突变型pfu dna聚合酶的纯化结果图；其中，泳道m为10-230kda宽范围的预染的蛋白上样marker，泳道1为细胞破碎液经75℃加热15min，泳道2为离心处理所得的上清液经0.45μm过滤，泳道3为疏水柱亲和层析纯化后所得到的突变型pfu dna聚合酶，泳道4为肝素柱亲和层析纯化后所得到的突变型pfu dna聚合酶，泳道5为阴离子交换层析纯化后所得到的突变型pfu dna聚合酶；
53.图2为突变型pfu dna聚合酶与不同浓度的突变型pcna混合，扩增3kb片段的结果图；其中，泳道m为dna marker，泳道1-5依次为浓度为1、2.5、5、7.5、10ng/μl的突变型pcna分别与突变型pfu dna聚合酶混合的gapdh片段扩增产物；
54.图3为突变型pfu dna聚合酶、一定浓度的突变型pcna与不同浓度的突变型dutpase混合，扩增3kb gapdh片段的结果图；其中，泳道m为dna marker，泳道1-5依次为浓度为1、2、5、10、15ng/μl的突变型dutpase分别与突变型pfu dna聚合酶及突变型pcna混合
的gapdh片段扩增产物；
55.图4为本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶与其它商品酶不同延伸时间扩增4kb核酸片段的对比图；其中，泳道m为dna marker，泳道1-3为延伸时间1min的结果图，泳道4-6为延伸时间2min的结果图；其中泳道1、5为本发明提供的可快速延伸的高保真dna聚合酶的扩增结果，泳道2、6为快速pcr的高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司的fastpfu dna polymerase，货号ap221)的扩增结果，泳道3、4为突变型pfu dna聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司的phanta max super-fidelity dna polymerase，货号p505)的扩增结果；
56.图5为本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶扩增不同长度核酸片段的结果图；其中，泳道m为dna marker，泳道1-7为以λdna为模板，得到的长度分别为1kb、2kb、4kb、6kb、9kb、15kb、18kb的目的片段的pcr产物；
57.图6为本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶与其它商品酶以人基因组dna为模板扩增18kb片段的对比图；其中，泳道m为dna marker，泳道1为本发明提供的可快速延伸的高保真dna聚合酶的扩增结果；泳道2为快速pcr的高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司的fastpfu dna polymerase，货号ap221)的扩增结果；泳道3为突变型pfu dna聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司的phanta max super-fidelity dna polymerase，货号p505)的扩增结果。
具体实施方式
58.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。
59.所述序列seq id no：1-9如下表1所示
60.表1 seq id no：1-9序列。
61.62.63.64.[0065][0066]
实施例1
[0067]
构建含编码本发明突变型pfu dna聚合酶的核苷酸序列的重组载体
[0068]
(1)根据本发明的突变型pfu dna聚合酶的氨基酸序列进行大肠杆菌表达系统的密码子优化，获得能在大肠杆菌中进行高效表达的dna分子，利用拼接pcr的方法，人工合成编码突变型pfu dna聚合酶的dna分子，具体如seq id no:2所示。
[0069]
(2)将编码本发明的突变型pfu dna聚合酶的dna分子与表达载体pet-28a进行重组。将突变型pfu基因(序列如seq id no：1所示)和pet28a载体进行ncoi和xhoi双酶切，37℃孵育20min后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。采用t4dna酶进行连接反应，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞dh5a中。
[0070]
(3)挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，并将阳性单克隆进行测序，验证编码突变型pfu dna聚合酶的dna分子的正确性。培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即
为含有编码突变型pfu dna聚合酶的dna分子的重组载体，命名为pet28a-pfu。并将测序正确的菌种转化至大肠杆菌感受态细胞bl21中，获得表达菌株，命名为pfu dna聚合酶菌株。
[0071]
实施例2
[0072]
本发明的突变型pfu dna聚合酶在重组大肠杆菌中的表达和鉴定
[0073]
(1)将实施例1获得的能够表达本发明突变型pfu dna聚合酶的菌种接种至2ml lb培养基(含卡那霉素50ug/ml)中，放置于37℃摇床中震荡培养8h，得到种子液。以1:400接种于摇瓶100ml lb液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)，摇菌过夜。
[0074]
(2)取过夜培养的种子液按体积比1:15接种至200ml lb培养基(含卡那霉素50ug/ml)中，37℃摇床中继续震荡培养3h，od600为0.8。
[0075]
(3)向每瓶菌液加入iptg至终浓度为1mm，37℃继续震荡诱导5h。
[0076]
(4)8000g离心10min收菌，收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重并-80℃保存。
[0077]
实施例3
[0078]
本发明的突变型pfu dna聚合酶纯化
[0079]
(1)菌体超声破碎
[0080]
菌体(-80℃冰箱保存，裂菌前确保细菌融化，否则会影响裂菌效果)，按照菌体：裂解液＝1g：5ml配比加入裂菌液(20mm tris-hcl,500mm nacl，ph8.0)，充分涡旋混匀，确保不存在成团的菌体。室温下作用10min，中间每隔几分钟涡旋一次。使用超声细胞破碎仪破碎菌体：冰浴情况下进行超声，工作时超声功率指针在400w附近，工作3s间隔3s，超声99次，超声1-2轮。
[0081]
(2)菌体热处理
[0082]
超声后菌液进行75℃水浴处理15min，水浴，热处理后会看到菌液呈现乳白色状。取样20μl备用(样品1)。
[0083]
(3)离心去除杂蛋白
[0084]
4℃条件下，13000g离心10min，留上清，弃沉淀。上清进行0.45μm过滤，取样20μl备用(样品2)，剩余样品直接进行纯化。
[0085]
(4)疏水柱亲和层析纯化
[0086]
选用phenyl purose 6fast flow 5ml的层析柱(购自ge healthcare)，缓冲液为buffer a(20mm tris-hcl，1m nacl,ph8.0)，buffer b(20mm tris-hcl，ph8.0)，0.45μm滤膜过滤备用。
[0087]
将phenyl purose 6fast flow 5ml与纯化仪相连，采用超纯水清洗系统和柱子，置换出储存纯化柱内的乙醇(20％乙醇保存)。将a泵连接buffer a，b泵连接buffer b，采用50％a 50％b进行平衡纯化柱，流速5-7ml/min，然后将过滤后样品溶液(步骤3所得)进行上样。上样完毕，先用50％a 50％b清洗柱子，再用buffer b进行梯度洗脱，并收集洗脱峰,取样20μl备用(样品3)。收样结束后，调整100％b，洗去柱子上残留的蛋白质以及核酸。然后将ab泵全部连接超纯水泵洗，再将ab泵全部连接20％乙醇，泵洗后，将纯化柱内液体更换为20％乙醇，可于4℃保存。
[0088]
(5)肝素柱亲和层析纯化
[0089]
选用heparin purose 6fast flow 5ml的层析柱(购自ge healthcare)，缓冲液为buffer c(20mm tris-hcl、50mm nacl，ph8.0)，buffer d(20mm tris-hcl、1m nacl，
ph8.0)，0.45μm滤膜过滤备用。
[0090]
将heparin purose 6fast flow 5ml与纯化仪相连，采用超纯水清洗系统和柱子，置换出储存纯化柱内的乙醇(20％乙醇保存)。将a泵连接buffer c，b泵连接buffer d，采用100％c进行平衡纯化柱，流速5-7ml/min，然后将步骤(4)中疏水柱所得样品上样。上样完毕，先用buffer c清洗柱子，再用buffer d进行梯度洗脱，并收集洗脱峰,取样20μl备用(样品4)。收样结束后，调整100％d，洗去柱子上残留的蛋白质以及核酸。然后将ab泵全部连接超纯水泵洗。然后将ab泵全部连接20％乙醇，泵洗后，将纯化柱内液体更换为20％乙醇，可于4℃保存。
[0091]
(6)阴离子交换柱层析
[0092]
选用的层析柱为q purose 6fast flow 5ml(购自ge healthcare)，缓冲液为buffer e(20mm tris-hcl、200mm nacl，ph8.0)，buffer f(20mm tris-hcl、1m nacl，ph8.0)，0.45μm滤膜过滤备用。
[0093]
将q purose 6fast flow 5ml接入akta纯化仪柱位阀中，采用超纯水清洗系统和柱子，置换出储存纯化柱内的乙醇(20％乙醇保存)。将a泵连接buffer e，b泵连接buffer f，采用100％e进行平衡纯化柱，流速5-7ml/min，然后将步骤(5)中肝素柱所得样品上样。上样过程中，收集流穿峰样品收。收样结束后，取样20μl备用(样品5)，调整100％f，清洗柱子。然后将ab泵全部连接超纯水泵洗。然后将ab泵全部连接20％乙醇，泵洗后，将纯化柱内液体更换为20％乙醇，可于4℃保存。
[0094]
将样品1-5进行sds-page电泳检测，结果如图1所示。
[0095]
突变型pcna载体构建、诱导表达、纯化制备方法同实施例1-3。
[0096]
突变型dutpase载体构建、诱导表达、纯化制备方法同实施例1-3。
[0097]
实施例4
[0098]
测定突变型pcna和突变型dutpase的蛋白浓度
[0099]
采用bradford试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白标准溶液梯度稀释，并各取10μl加入到96孔酶标板中，再取10μl待测蛋白样品加入到96孔酶标板中。每孔加入250μl bradford蛋白质定量试剂，混匀后室温放置3-5min，测595nm的吸光值，以蛋白标准液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，注意将零点去除，得出标准曲线线性公式及r2值。再根据所测得的蛋白样品吸光值，计算蛋白样品的浓度。测得突变型pcna和突变型dutpase的蛋白浓度分别为180ng/μl、2.2mg/ml。
[0100]
实施例5
[0101]
确定突变型pcna的工作浓度
[0102]
将突变型pcna进行稀释，再依次与突变型pfu dna聚合酶混合，分别扩增3kb人类gapdh基因片段。引物序列如下：正向引物序列为gap-3kb-f：5
’‑
agtgagtggaagacagaatgga-3’＝seq id no：10，反向引物序列为gap-3kb-r：5
’‑
gcagaatgacagagaaggtgaa-3’＝seq id no：11。50μl pcr反应体系为：20mm tris-hcl、10mm kcl、10mm(nh 4)2so4，2mm mgcl2、0.1％(v/v)triton x-100、0.1g/l bsa、200μm dntps、10ng人基因组dna、0.4μm上下游引物、0.05u/μl突变型pfu dna聚合酶，不同含量的突变型pcna(分别为0.02、0.05、0.1、0.15、0.2ng/μl)，ph8.8；
[0103]
pcr程序如下：30次循环：95℃预变性180sec；95℃变性30sec；56℃退火30sec；72
℃延伸120sec；72℃终延伸300sec。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，当突变型pcna的浓度为5ng/μl时，pcr扩增条带最亮，确定工作浓度为5ng/μl。将该浓度的突变型pcna与突变型pfu dna聚合酶混合均匀备用(暂命名突变型pcna-pfu dna聚合酶)。
[0104]
实施例6
[0105]
确定突变型dutpase的工作浓度
[0106]
将突变型dutpase进行稀释，再依次与实施例5中突变型pcna-pfu dna聚合酶混合，分别扩增3kb人类gapdh基因片段。引物序列如实施例5，50μl pcr反应体系为：20mm tris-hcl、10mm kcl、10mm(nh 4)2so4，2mm mgcl2、0.1％(v/v)triton x-100、0.1g/l bsa、200μm dntps、10ng人基因组dna、0.4μm上下游引物、0.05u/μl突变型pcna-pfu dna聚合酶，不同含量的突变型pcna(分别为0.02、0.04、0.1、0.2、0.3ng/μl)，ph8.8；
[0107]
pcr程序如下：30次循环：95℃预变性180sec；95℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸60sec；72℃终延伸300sec。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，当突变型dutpase的浓度为10ng/μl时，，pcr扩增条带最亮，确定工作浓度为10ng/μl。将该浓度的突变型dutpase与突变型pcna-pfu dna聚合酶混合均匀，即为本发明提供的可快速延伸的高保真dna聚合酶。
[0108]
实施例7
[0109]
本发明所述的可快速延伸的高保真dna的延伸速率
[0110]
以λdna为模板，用实施例6制备的可快速延伸的高保真dna聚合酶，和市售高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司的fastpfu dna polymerase，货号ap221)，及突变型pfu dna聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司的phanta max super-fidelity dna polymerase，货号p505)，在不同延伸时间下分别扩增长度为4kb的目的片段，引物序列如下：正向引物序列为λ-121-fw：5
’‑
acaggtgctgaaagcgaggctttttg-3’＝seq id no：12，反向引物序列为λ-4kb-rv：5
’‑
gatggccatacgaccggagcctat-3’＝seq id no：13。50μl pcr反应体系为：20mm tris-hcl、10mm kcl、10mm(nh 4)2so4，2mm mgcl2、0.1％(v/v)triton x-100、0.1g/l bsa、200μm dntps、10ng人基因组dna、0.4μm上下游引物、0.05u/μl可快速延伸的高保真dna聚合酶，ph8.8；市售pfu dna聚合酶反应体系参考商品说明书进行配制。
[0111]
pcr程序如下：30次循环：95℃预变性90sec；95℃变性30sec；58℃退火30sec；72℃延伸60sec/72℃延伸120sec；72℃终延伸300sec。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，表明本发明提供的可快速延伸的高保真dna聚合酶延伸速率可达2-4kb/min，与市售突变型pfu dna聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)近乎一致，但市售高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)延伸速率仅仅为1-2kb/min。
[0112]
实施例8
[0113]
为本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶对不同长度核酸片段的扩增测试。
[0114]
以λdna为模板，采用实施例7所述可快速延伸的高保真dna聚合酶的反应体系，分别扩增长度为1kb、2kb、4kb、6kb、9kb、15kb、18kb的目的片段，不同片段所用的引物序列如下：
[0115]
通用正向引物列:5
’‑
acaggtgctgaaagcgaggctttttggcctctgtcgtttc-3’＝seq id no：14；
[0116]
1kb-rp:5
’‑
cattagtgaaacgcttcatggtgagc-3’＝seq id no：15；
[0117]
2kb-rp:5
’‑
acggatgcccctttaatggggatc-3’＝seq id no：16；
[0118]
4kb-rp:5
’‑
ctatccagtcgcagttcccccaggcactgcgggcttcctg-3’＝seq id no：17；
[0119]
6kb-rp:5
’‑
tctgctcatttgccgccagcagttgggcggttgtgtacat-3’＝seq id no：18；
[0120]
9kb-rp:5
’‑
ctgcccggtcgcagtccagtctgcatcttcatcatcgaga-3’＝seq id no：19；
[0121]
15kb-rp:5
’‑
caccgagcaccatactggcaccgagagaaaacaggatgcc-3’＝seq id no：20；
[0122]
18kb-rp:5
’‑
cctccatgctgaggccaatacccgcgacataatgtttgcc-3’＝seq id no：21。
[0123]
pcr程序如下：30次循环：95℃预变性90sec；95℃变性15sec；68℃退火/延伸15sec-10min(≤5kb时延伸速率2-4kb/min，＞5kb时延伸速率1-2kb/min)；72℃终延伸10min。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，表明本发明提供的可快速延伸的高保真dna聚合酶对于不同长度的片段都能有很好的扩增效果。
[0124]
实施例9
[0125]
为本发明的可快速延伸的高保真dna聚合酶对复杂模板长片段的扩增实验。
[0126]
以人基因组为模板，用实施例6制备的可快速延伸的高保真dna聚合酶，和市售高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司的fastpfu dna polymerase，货号ap221)，及突变型pfu dna聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司的phanta max super-fidelity dna polymerase，货号p505)，分别扩增长度为18kb的目的片段，引物序列如下：正向引物序列为globin-18k-fw：5
’‑
acatgattagcaaaagggcctagcttggactcaga-3’＝seq id no：22，反向引物序列为globin-18k-rv：5
’‑
tgcacctgctctgtgattatgactatcccacagtc-3’＝seq id no：23。采用实施例7所述可快速延伸的高保真dna聚合酶的反应体系，市售pfu dna聚合酶反应体系参考商品说明书进行配制。
[0127]
pcr程序如下：30次循环：95℃预变性60sec；98℃变性10sec；68℃退火/延伸12min；72℃终延伸10min。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，市售高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)虽然能够扩增出目的基因，但目的基因的产量明显低于本发明提供的可快速延伸的高保真dna聚合酶，而市售突变型pfu dna聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)的目的基因产量较高，有很强的非特异性扩增。这表明本发明提供的可快速延伸的高保真dna聚合酶在复杂模板长片段扩增效果较好，特异性较强。
[0128]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围。