一种可快速延伸的高保真DNA聚合酶及其制备方法和应用与流程

技术特征：
1.一种可快速延伸的高保真dna聚合酶，其特征在于，所述聚合酶是混合物，由突变型pfu dna聚合酶、突变型pcna以及突变型dutpase组成。2.根据权利要求1所述的一种可快速延伸的高保真dna聚合酶，其特征在于，所述突变型pfu dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。3.编码如权利要求2所述的突变型pfu dna聚合酶的dna分子，其特征在于，其碱基序列如seq id no：7所示。4.根据权利要求1所述的一种可快速延伸的高保真dna聚合酶，其特征在于，所述突变型pcna的氨基酸序列如seq id no：3所示。5.编码如权利要求4所述的突变型pcna的dna分子，其特征在于，其碱基序列如seq id no：8所示。6.根据权利要求1所述的一种可快速延伸的高保真dna聚合酶，其特征在于，所述突变型dutpase的氨基酸序列如seqid no：5所示。7.编码如权利要求6所述的突变型dutpase的dna分子，其特征在于，其碱基序列如seq id no：9所示。8.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体是将权利要求3所述的编码突变型pfu dna聚合酶的dna分子克隆入表达载体得到。9.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体是将权利要求5所述的编码突变型pcna的dna分子克隆入表达载体得到的。10.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体是将权利要求7所述的编码突变型dutpase聚合酶的dna分子克隆入表达载体得到的。11.根据权利要求8-10任一项所述的重组表达载体，其特征在于：所述的表达载体为原核表达载体。12.一种能高效可溶的表达如权利要求11所述的表达载体上目标蛋白的工程菌，其特征在于，其是将权利要求11所述的重组表达载体转化到工程菌中得到；所述的工程菌为大肠杆菌细胞。13.如权利要求1所述的可快速延伸的高保真dna聚合酶的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：将突变型pfu dna聚合酶与一定浓度的突变型pcna及突变型dutpase混合而成；（1）其中突变型pfu dna聚合酶的制备方法步骤如下：a.将权利要求12中表达突变型pfu dna聚合酶的工程菌活化，得到一级菌种液；b.将一级菌种液按一定比例接种于含抗生素的lb培养液中，于35～38℃、150～200rpm条件下培养至菌液od600 达到0.6～0.8，得到二级菌种液；c. 向二级菌种液中加入iptg诱导剂，诱导浓度为0.8～1.2mm，在步骤b培养条件下培养2-5h后，离心收集菌体沉淀；；d.向步骤c得到的菌体沉淀中加入预冷的裂解液，充分涡旋混匀；e.超声破碎菌体，并使菌体保持冰浴状态；f.破碎后的菌体进行70～80℃水浴保温20～40min, 热处理后离心，去除沉淀；g.向所得上清中加入一定质量硫酸铵，缓慢搅拌10～20min，将液体和沉淀全部转移离心，去除上清；
h. 向沉淀中加入盐析复溶液，涡旋混匀，离心，去除沉淀，保留上清过滤，得到滤液；i.将滤液进行疏水亲和层析，收集含有目的蛋白的样品；j.把经疏水亲和层析收集的样品再经肝素-琼脂糖凝胶柱，收集含有目的蛋白的样品；k.最后将经肝素-琼脂糖凝胶柱收集的样品经阴离子交换层析，得到突变型pfu dna聚合酶；（2）突变型pcna的制备方法步骤同突变型pfu dna聚合酶一致；（3）突变型dutpase的制备方法步骤同突变型pfu dna聚合酶一致。14.如权利要求1所述的一种可快速延伸的高保真dna聚合酶的应用，其特征在于，使用前需测定突变型pcna和dutpase的蛋白浓度。15.根据权利要求14所述的一种可快速延伸的高保真dna聚合酶的应用，其特征在于，使用时将突变型pfu dna聚合酶分别与不同浓度突变型pcna和dutpase混合，在一定的pcr体系中进行不同基因片段的扩增。16.根据权利要求15所述的一种可快速延伸的高保真dna聚合酶的应用，其特征在于，所述pcr体系中的pcr反应缓冲液的组成如下：tris-hcl、mgcl
2 、(nh4)
2 so 4 、kcl、triton x-100、bsa按照10～400mmol：1～3mmol：5～20mmol：5～20mmol：0.5～1.5ml：0.1～0.3g配比混合，ph值为8～10。

技术总结
本发明属于重组DNA聚合酶领域，具体公开了一种可以快速PCR的Pfu DNA聚合酶，所述Pfu DNA聚合酶除了本身具有的高保真特性外，还保持了扩增速度快的特点；与普通Pfu相比，这种DNA聚合酶中添加了两种独特的因子突变型PCNA及突变型dUTPase；本发明公开了突变型Pfu DNA聚合酶的基因全序列，突变型PCNA及dUTPase的基因全序列；同时也公布了表达纯化Pfu DNA聚合酶的方法；本发明提供的添加两种因子的Pfu DNA聚合酶能解决普通Pfu DNA聚合酶本身扩增能力差、产量低和扩增速度慢（0.5 kb/min）的缺陷，极大地缩短了反应时间，使其延伸速度达到了野生型的6-8倍，同时保持其保真性。同时保持其保真性。同时保持其保真性。


技术研发人员：韩俊东 李民强 刘鸿妍
受保护的技术使用者：大连博格林生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2022/4/22