一种用于大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、试剂盒和方法与流程

1.本发明涉及分子鉴定技术领域，尤其涉及一种用于大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、试剂盒和方法。


背景技术：

2.大麻是属于大麻科(cannabinaceae)大麻属(cannabis)的一年生雌雄异株的草本植物，主要分布于欧洲、非洲和亚洲的尼泊尔、印度、中国等地区，是地球上最古老的栽培作物之一。大麻纤维是良好的纺织和造纸原料，植株内含有的大麻素被广泛应用于医药卫生领域，种子中富含人体易吸收的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸以及微量元素等多种营养成分，已成为许多国家重要的经济作物。然而，由于花和叶中含有的四氢大麻酚(thc)具有强烈的成瘾性和麻醉性，大麻已被联合国禁毒公约列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品之一。
3.细胞学研究表明，大麻为含有20条染色体(其中18条为常染色体,2条为性染色体)的二倍体植物，雌株染色体型为xx，雄株染色体型为xy。大麻雌雄植株的利用价值不相同，雄株的纤维质量明显高于雌株，雄性植株中不含thc和大麻二酚(cbd)或含量较少，而雌性植株内则二者含量相对较高，因此雌株具有更高的药用价值和滥用潜力。
4.近年来，受到国际上一些国家和地区大麻合法化的影响，我国吸食或滥用大麻人数持续上升，跨国贩卖大麻案件日益增多。因而，对大麻进行快速、准确的司法鉴定及毒源追踪已然成为迫切的社会需求。目前常规的大麻鉴定方法主要是进行形态学和化学成分的分析。然而，在一些案件中，大麻经过加工或与烟叶等混在一起，导致人们无法从形态上识别这类检材。对于大麻化学成分的分析，多采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)法对生物检材中thc进行定性和定量分析；但gc-ms法分析大麻化学成分需要大量新鲜样本，因为thc在陈旧样本中很容易被氧化，且thc的含量会受大麻植株的发育阶段、部位以及种植环境的影响。此外，性别差异对于大麻thc含量影响较大，然而陈旧的大麻样本、经过加工的大麻样本以及在花期之前的大麻都无法从形态上或化学成分上准确判断大麻植株性别。最后，大麻的个体识别及来源地推断在实际案件中也具有重要的意义，而这也恰恰是形态学及化学成分分析做不到的。为了更好的满足司法鉴定中大麻的种属鉴定、个体识别以及来源地推断的需求，科学家尝试寻求新的方法来解决这些问题。
5.随着分子生物学技术的快速发展，在dna水平上对大麻进行鉴定逐渐成为一种研究热点和新的技术手段。目前，对于大麻dna遗传标记的研究主要集中在rapd、aflp、scar、dna条形码和str等方面。研究资料表明：rapd、aflp和scar遗传标记可以对大麻进行种属及性别鉴定；dna条形码可以准确的鉴别大麻及其混伪品，但上述遗传标记均不能对大麻进行个体化识别及地域来源推断。
6.短串联重复序列str是由2～6bp的核心序列串联组成的寡核苷酸序列，因其具有高灵敏度、高鉴别能力、高种属特异性、结果的高度准确性以及易于标准化等优点，被广泛
26；cs1：seq id no.27-28；anucs 305：seq id no.29-30；3735：seq id no.31-32；anucs 302：seq id no.33-34；1528：seq id no.35-36；9043：seq id no.37-38。
13.进一步地，每对扩增引物中至少一条引物采用荧光染料标记，该荧光染料选自fam、hex、trmra、rox中的一种。
14.进一步地，d02-cann1、c11-cann1、dm029、dm016、4910、bo1-cann1的扩增引物采用fam标记；e07-cann1、9269、b05-cann1、h06-cann2、5159、nh09的扩增引物采用hex标记；anucs 501、cs1、anucs 305的扩增引物采用trmra标记；3735、anucs 302、1528、9043的扩增引物采用rox标记。
15.第二方面，本发明还提供了包括上述引物组合物的用于大麻复合鉴定多态性遗传标记的试剂盒，其还包括4
×
pcr反应预混液ⅶ[50mm tris-hcl(ph 8.3)，50mm kcl,1.5mm mgcl2,0.2mm dntps,0.08mg/ml bovine serum albumin(bsa)]和去离子水。
[0016]
第三方面，本发明还提供了采用上述引物组合物或者试剂盒的用于大麻复合鉴定多态性遗传标记的方法，具体用于大麻性别鉴定、个体识别和来源地推断；该方法包括如下步骤：
[0017]
步骤一，采用seq id no.1-38所示序列的扩增引物对待测样品的基因组dna样本进行pcr复合扩增；
[0018]
步骤二，取pcr扩增产物与适量的分子量内标、甲酰胺混匀；将混合物变性、冷却；
[0019]
步骤三，采用遗传分析仪进行分型检测。
[0020]
进一步地，上述pcr复合扩增的扩增体系的总体积为10μl，包括：4
×
pcr反应预混液ⅶ2.5μl，引物混合物(10μl)1μl，去离子水5.5μl，1ng/μl基因组dna1μl。
[0021]
进一步地，上述扩增引物在扩增体系中的浓度分别如下：d02-cann1：0.03μm；c11-cann1：0.03μm；dm029：0.05μm；dm016：0.03μm；4910：0.04μm；b01-cann1：0.06μm；e07-cann1：0.05μm；9269：0.04μm；b05-cann1：0.03μm；h06-cann2：0.04μm；5159：0.04μm；nh09：0.04μm；anucs 501：0.05μm；cs1：0.05μm；anucs 305：0.05μm；3735：0.05μm；anucs 302：0.04μm；1528：0.05μm；9043：0.05μm。
[0022]
进一步地，上述pcr复合扩增的程序为：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，56℃退火1分钟，60℃延伸30秒，共28次循环；60℃终延伸5分钟；15℃保温。
[0023]
进一步地，上述pcr复合扩增采用反应热循环仪；该反应热循环仪选自abi9700、abi 9600、abi2720、bio-rad icycler和bio-rad c1000中的一种。
[0024]
进一步地，分子量内标采用t500 size standard并采用liz荧光标记；荧光校正采用5-dye matrix standards。
[0025]
进一步地，步骤二中，pcr扩增产物、分子量内标和甲酰胺的体积比为1:8.5:0.5。
[0026]
进一步地，上述遗传分析仪选自3100系列、3130系列和3500系列遗传分析仪中的一种。
[0027]
进一步地，步骤一还包括对待测样品的花、茎、叶和/或种子进行dna提取制备基因组dna样本。
[0028]
进一步地，步骤二中变性的条件为95℃，3分钟；冷却的条件为冰上冷却3分钟。
[0029]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0030]
1、本发明同时扩增大麻17个常染色体str基因座和2个性别鉴定位点，优于前期研
cann1的扩增引物采用fam标记；e07-cann1、9269、b05-cann1、h06-cann2、5159、nh09的扩增引物采用hex标记；anucs 501、cs1、anucs305的扩增引物采用trmra标记；3735、anucs 302、1528、9043的扩增引物采用rox标记。
[0044]
此外，试剂盒包括上述用于大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、4
×
pcr反应预混液ⅶ和去离子水。
[0045]
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0046]
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0047]
实施例1
[0048]
本实施例提供一种用于大麻复合鉴定多态性遗传标记的方法，包括如下步骤：
[0049]
1.适用于法医学应用的大麻str基因座的筛选；
[0050]
依据文献报道和基因数据库，查找目前已开发的大麻str基因座，但并不是所有的这些str基因座都适用于大麻复合扩增体系的研究。筛选多态性str基因座，剔除其中的二核苷酸重复的基因座。最终选择17个最优的常染色体str基因座和2个性别鉴定位点进行试剂盒开发，所述的基因座为d02-cann1、c11-cann1、dm029、dm016、4910、b01-cann1、e07-cann1、9269、b05-cann1、h06-cann2、5159、nh09、anucs 501、cs1、anucs 305、3735、anucs 302、1528和9043。其中性别鉴定位点dm029与x染色体相关，所有样本均出单一峰，性别鉴定位点dm016与y染色体相关，所有雄性样本均出单一峰，雌性样本不出峰。
[0051]
2.设计扩增引物组分；
[0052]
建立包含五色荧光标记(fam、hex、tamra、rox和liz)的复合扩增检测试剂盒，分子量内标采用liz荧光标记(t500)。
[0053]
本实施例所述的遗传标记及其对应的扩增引物序列、标记荧光和反应终浓度如表1所示。
[0054]
表1复合扩增所使用的引物序列、反应终浓度和标记荧光
[0055]
[0056]
[0057][0058]
3.多重pcr扩增体系的构建与优化；
[0059]
对构建的复合扩增分型体系进行包括引物配比浓度、dna模板量、退火温度、循环数等pcr反应条件的调整优化，得到均衡稳定的pcr产物分型结果，实现19个遗传标记的复合扩增。
[0060]
本实施例所述的包含大麻17个常染色体str基因座和2个性别鉴定位点的多重pcr扩增体系如表2所示，其中dna需从大麻属样本，如花、茎、叶、种子中提取。
[0061]
表2包含大麻17个常染色体str基因座和2个性别鉴定位点的多重pcr扩增体系
[0062][0063]
反应体系在各种反应热循环仪(如abi 9700、abi 9600、abi 2720、bio-radicycler等)上采用以下的程序可以得到良好的结果：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，56℃退火1分钟，60℃延伸30秒，共28次循环；60℃终延伸5分钟；15℃保温。
[0064]
4.分析方法的建立与复合扩增产物的检测；
[0065]
建立3100系列、3130系列或3500系列遗传分析仪光谱校正(matrix)文件。毛细管电泳加样时，1μl pcr扩增产物与8.5μl甲酰胺、0.5μl分子量内标(t500size standard)混合；混合物在95℃变性3分钟，随后置于冰上冷却3分钟；采用上述型号遗传分析仪对19个遗传标记进行分型检测。通过毛细管电泳获得各标记不同等位基因的电泳迁移参数，并以此为基础，分别根据genemapperid v3.2.1和id-x v1.5软件的格式要求编写相应的bin文件和panel文件，创建电泳分析方法。
[0066]
其中，采用上述方法的ladder分型图谱如图1所示，采用上述方法对雌性样本dna的分型图谱如图2所示，对雄性样本dna的分型图谱如图3所示。
[0067]
实施例2
[0068]
本实施例为采用实施例1提供的方法对大麻属样本dna进行检测。
[0069]
收集一例大麻属样本不同组织(花、茎、叶和种子)，进行dna提取和定量。对上述
dna样本采用实施例1构建的试剂盒进行19个遗传标记的复合扩增。所有样本在遗传标记上均得到有效扩增产物。
[0070]
实施例3
[0071]
本实施例按照swgdam要求对实施例1提供的方法进行法医学验证(同一性、灵敏度、种属特异性以及法医学参数计算)，进而判断该方法的优越性，具体的操作如下：
[0072]
(1)同一性研究：将同一植株花、叶和茎的基因组dna定量到1ng/μl，使用实施例1提供的方法分别进行检测。
[0073]
结果显示(图4)实施例1构建的试剂盒具有良好的组织同一性：同一植株的花、叶和茎具有相同的基因分型。
[0074]
(2)灵敏度研究：将大麻基因组dna倍比稀释为2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μl和0.015625ng/μl，使用实施例1提供的方法对上述浓度的大麻基因组dna分别进行检测，每个模板量样本重复检测3次。
[0075]
结果显示(图5)实施例1构建的试剂盒具有高灵敏度：在dna模板量低至0.125ng时可以获得遗传标记的完整基因分型。
[0076]
(3)种属特异性研究：将狗、猫、鼠、羊、猪、牛、兔、鸡、鸭、猴子、龙葵、虞美人、桑叶、罂粟、鼠尾草和葎草的基因组dna定量到5ng/μl，使用实施例1提供的方法对上述非大麻源基因组dna分别进行检测。
[0077]
结果显示(图6)实施例1构建的试剂盒具有种属特异性：除鼠尾草和葎草外其他物种的dna均未检测到产物峰，尽管在鼠尾草和葎草样本中观察到一些产物峰，但大多数不在等位基因位置上，且与大麻正常的峰型也不相同，不会影响结果的判读。
[0078]
(4)法医学参数计算：将126份大麻基因组dna定量到1ng/μl，使用实施例1提供的方法分别进行检测。统计并计算17个常染色体str基因座的杂合度、多态性信息含量、个体识别概率、非父排除概率、累积个体识别概率、累积非父排除概率，以及各样本性别信息。
[0079]
结果显示(表3)实施例1构建的试剂盒具有较好的系统效能：17个常染色体str基因座在126份大麻样本中的杂合度范围为0.2381～0.7937，多态性信息含量范围为0.2754～0.9419，个体识别概率范围为0.4624～0.9855，非父排除概率范围为0.0410～0.5873，累积个体识别概率为1-3.0
×
10-15
，累积非父排除概率为1-7.4
×
10-3
；大麻性别鉴定位点dm029和dm016在检测样本中均能满足性别鉴定的要求，在所有雄性样本中检测到dm029及dm016两个峰，在雌性样本中仅有dm029单一峰。
[0080]
表3大麻17个常染色体str基因座的法医学参数
[0081][0082][0083]
由上述实施例可知，本发明所述的含有荧光标记的可并行检测大麻属样本17个常染色体str基因座和2个性别鉴定位点的引物组合物、试剂盒和方法为我国大麻的法医学研究中性别鉴定、个体识别、来源地推断、str数据库的建立提供了一个全新的检测手段。
[0084]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。