一种鸡胚胸肌成肌细胞的分离培养方法与流程

1.本发明涉及一种鸡胚胸肌成肌细胞分离培养方法，属于生物技术领域的细胞分离培养方法。


背景技术：

2.骨骼中的肌细胞起源于间充质干细胞，肌肉间充质干细胞经过系谱定向成为成肌细胞，随后分化形成肌纤维。干细胞的系谱定向通过内源性信号和外源性信号共同调控，而间充质干细胞对成肌细胞的分化，影响肌纤维的数目、类型和横截面积，骨骼肌组织的发生和发育是决定肉品质的重要基础。骨骼肌的发生是一个非常复杂的过程，是涉及众多相关功能基因有序、可控表达的结果。包括成肌细胞的基因组的转录和表达，同时也受生长因子、细胞外基质和细胞之间相互接触的影响。当成肌细胞开始分化为肌纤维时，需要激活特定的关键诱导因子-生肌调节因子，决定了骨骼肌的形成。因此，成肌细胞可以作为肌肉发育的理想载体，通过体外成肌细胞培养试验来探究骨骼肌生长发育机理，同时，观察鸡胚成肌细胞增殖和分化过程，进行肌纤维生肌调控因子和蛋白表达通路的研究，是探究鸡肌纤维生长和发育的理想模型。
3.目前，鸡胚成肌细胞原代分离主要通过传统酶消化法——双酶消化法，根据细胞贴壁速度的快慢，利用细胞的物理特性对细胞进行纯化。传统酶消化法需要两种不同的消化酶对肌肉组织进行消化，操作步骤繁琐，且需用到大量试验仪器和耗材，耗时长，使用这种方法培养结果往往不能达到要求，导致细胞培养效率低纯度差的原因可能有以下几点：1、鸡胚胸肌较小，未发育完全的筋膜和骨头镶嵌在胸肌中，分离时容易被忽略，要分离出纯粹的胸肌进行消化培养较为困难。2、原代成肌细胞十分脆弱，对消化酶十分敏感，当组织经过多种酶长时间消化和高速离心后，对细胞损伤大，降低细胞活性，健康细胞得率低。3、传统酶消化法分离原代鸡胚胸肌成肌细胞时，操作步骤复杂，需要准备和使用大量耗材，增加成本。因此，如何高效率、高质量和低成本的快速分离出活性高、数量多的成肌细胞是研究鸡肌纤维形成和生长的关键技术问题，对进一步探究通过营养手段调控家禽肌肉生长发育的机理具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足之处，提供一种快速获得高质量、高数量和低成本的鸡胚成肌细胞分离培养方法，为探究鸡肌纤维形成和生长提供优质实验材料，对进一步调控家禽肌肉发育的机理打下坚实基础。
5.本发明的技术方案如下：
6.鸡胚处理选取发育良好的12胚龄鸡胚(图1)，用75％酒精喷拭消毒3遍后，放置于超净台内，取用第一套镊子敲击鸡胚钝端气室，用镊子小心取出鸡胚；使用添加1％双抗的pbs冲洗鸡胚。
7.收集胸肌取用第二套小镊子背部轻轻揭开鸡胚胸肌皮肤，使胸肌完全裸露出来；
使用第三套镊子小心夹起一侧胸肌，向上微提，用第一套眼科手术剪小心围绕镊子剪下胸肌，随后用同样的方法采集另一侧胸肌，将剪下的胸肌放置于第一套盛有含1％双抗的pbs的培养皿内保持湿润；用第四套镊子寻找胸肌周围的筋膜和内部脆骨，用第二套眼科手术剪刀小心剔除筋膜和脆骨，把纯胸肌置于第二套盛有含1％双抗的pbs的培养皿中清洗3遍后，将胸肌置于2ml高糖培养基中，用眼科手术弯剪修剪为体积为1mm3大小的肉块。
8.胸肌消化将剪碎后的胸肌移入15ml离心管中，800g离心5min，吸弃上清液，用胰蛋白酶溶液将剪碎后的肌肉在37℃消化2-5min，消化过程中看不到明显肉团，胰蛋白酶颜色变浅变混浊，溶液呈略微粘稠状态，加入等体积细胞培养液终止消化。
9.过滤，离心将直径为100μl的一次性无菌细胞筛网置于50ml离心管上进行过滤，把混合液通过筛网流入离心管中，把过滤后的细胞混液加入新的15ml离心管中，200g离心3min，吸弃上清液，得到的下层沉淀即为细胞。
10.接种，纯化将上步获得的细胞中加入1ml细胞培养液重悬浮，将细胞悬液接种到含10ml dmem细胞培养液的直径为10cm的细胞培养皿中，使用8字摇匀法使细胞均匀分布在细胞培养皿中，在光学显微镜下观察到细胞在培养皿中均匀分布后放入温度为37℃，二氧化碳含量为5％的细胞培养箱中正常培养；40min后将未贴壁的细胞同细胞培养液一起移入新的细胞培养皿中，差速贴壁2次后，即可得到纯度较高的成肌细胞，进行原代培养。
11.培养，传代上步所得原代成肌细胞在细胞培养液中继续原代培养48h后(图2)即可进行传代，在细胞培养皿中加入1ml胰蛋白酶，1min后加入2ml细胞培养液终止消化，500g离心3min，吸弃上清液，下层沉淀即为所需的成肌细胞；加入2ml细胞培养液重悬浮，吸取20μl悬浮液滴入细胞计数板计数，根据计数结果，按照试验方案将细胞悬浮液接种到加入细胞培养液的细胞培养皿中进行试验。
12.本发明所提供的方法选取12胚龄鸡胚胸肌，胸肌处理先用眼科手术弯剪剔除骨头和筋膜，随后将胸肌剪碎，剪碎后的胸肌全部置于胰蛋白酶溶液中在37℃水浴消化，这样处理能够在一定程度上剔除骨细胞和其他细胞，加快成肌细胞爬出速度和纯度，减少成肌细胞在胰蛋白酶中的消化时间，降低胰蛋白酶对成肌细胞的损害。关于鸡胚胸肌剪碎后用胰蛋白酶处理的方法与传统酶消化法相比来说能够更快的进行成肌细胞纯化处理，因为传统酶消化法需要先用胶原酶消化肌肉后，再加入胰蛋白酶消化，长时间的酶消化会降低成肌细胞活性，而剔除骨头和筋膜后将胸肌剪碎立即用胰蛋白酶消化2-5min，不仅达到了去除杂质细胞，使成肌细胞快速爬出的目的，且短时间的胰蛋白酶消化不会对成肌细胞活性造成太大影响，能够快速得到活性高的成肌细胞进行培养。
13.本发明所用pbs为无酚红、无钙和无镁的磷酸盐缓冲盐水，高糖培养基为含4.5g/ld-glucose培养基(含酚红),胰蛋白酶为0.25％trypsin-edta,双抗含量为10000units/ml penicillin、10000ug/ml streptomycin,胎牛血清等均购自gibco。
14.本发明的新的技术效果
15.本发明所提供的方法具有以下优点：
16.1.操作简单，价格低廉。利用胰蛋白酶消化剪碎后的鸡胚胸肌到成肌细胞培养，免去了传统酶消化法繁冗步骤和时间，只需用到少数仪器和胰蛋白酶，节省仪器和试剂费用，降低成本。
17.2.细胞活性好，纯度高。利用胰蛋白酶法消化鸡胚胸肌，在短时间内迅速得到大量
成肌细胞，且短时间胰蛋白酶消化不会对成肌细胞活性造成大的损伤，可以得到活性较好的成肌细胞，另外结合差速贴壁法，进一步提高了细胞纯度。且对原代成肌细胞培养后可以获得足够数量的成肌细胞，满足试验要求。
18.3.生长周期短，结果重复性好。培养的成肌细胞生长活性好，周期短，原代成肌细胞培养24h后即可看见细胞贴壁，48h后即可长满培养皿80％以上进行传代，生长旺盛。
19.4.本发明使用鸡胚胸肌进行原代成肌细胞分离和传代培养，获得的细胞具有分化为肌纤维和肌肉的能力，为探究肉鸡肌纤维生长和分型等调控肌肉发育的机理提供实验材料。
附图说明
20.图1为12胚龄肉仔鸡鸡胚图片。
21.图2为细胞纯化后培养48h图片。
具体实施方式
22.下面结合实施例做详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提的条件下进行实施，并给出详细实施方式和具体的操作过程。实施例中所用pbs为无酚红、无钙和无镁的磷酸盐缓冲盐水，高糖培养基为含4.5g/l d-glucose培养基(含酚红),胰蛋白酶为0.25％trypsin-edta,双抗含量为10000units/ml penicillin、10000ug/ml streptomycin,胎牛血清等均购自gibco.
23.实施例中所用的细胞培养液配置如下(以50ml体积为例)：
24.胎牛血清：10ml；高糖培养基:40ml；双抗：0.5ml。
25.实施例：
26.选取于12胚龄发育良好的鸡胚10枚，75％酒精喷洒消毒后带入细胞间，再次使用75％酒精棉消毒后放入超净台，使用手术剪柄轻轻敲破胚蛋钝端，用小镊子围绕气室将蛋壳取走，拨开白膜，将鸡胚倒入直径为10cm的培养皿中，取出鸡胚，使用含1％双抗的pbs冲洗鸡胚2-3次，去除胸肌以上部位，将鸡胚胸肌上的粘液和血渍冲洗干净。使用弯头小镊子背部拨开鸡胚胸肌皮肤，让胸肌完全暴露，使用眼科手术弯剪取出胸大肌，放入含1％双抗的pbs中保持湿润。使用手术弯剪和弯头镊子去除胸肌上残余的骨头和筋膜，在1％的pbs中清洗3遍，放入2ml高糖培养基中，使用眼科手术弯剪将胸肌修剪成体积为1mm3大小的肉块。将剪碎后的胸肌和高糖培养基一起转移到15ml离心管中，800g离心5min，吸弃上清，得到的底部肉块即为分离成肌细胞的鸡胚胸肌，向离心管中加入5ml胰蛋白酶，使用移液枪反复吹打，肉块与胰蛋白酶充分接触，进行消化。
27.把加入胰蛋白酶的离心管放入37℃水浴锅中，消化2-5min，消化过程中随时观察管内颜色变化。可以在水浴锅内晃动离心管，加快消化过程，待管内看不到明显肉团，胰蛋白酶颜色变浅变混浊，溶液呈粘稠状即可终止消化。
28.离心管中加入5ml细胞培养液终止消化，使用直径为100μm的一次性无菌细胞筛网置于50ml离心管口过滤，去除未消化的肉糜和杂质，将过滤后的液体转移到新的15ml离心管中200g离心3min，弃上清，得到下层沉淀即为细胞。
29.离心管中加入2ml细胞培养液，吹打重悬浮，动作轻柔，缓缓吹打，不要有泡沫产
生，避免细胞受损，吹打均匀后，将细胞接种到提前加入10ml细胞培养液的10cm细胞培养皿中，使用8字摇匀法使细胞均匀分布在培养皿底部，在光学显微镜下观察到细胞是否均匀分布在培养皿内，随后立即放入细胞培养箱中进行培养。40min后将未贴壁细胞随细胞培养液一同转移到新的细胞培养皿中，差速贴壁两次后，即可得到纯化后的成肌细胞，进行原代成肌细胞培养。
30.纯化后的原代成肌细胞在细胞培养液中原代培养48h后即可长满培养皿的80％以上，进行传代。吸取废液，加入2ml 含1％双抗的pbs清洗细胞，去除未贴壁细胞和杂质，吸取清洗液，在培养皿中加入1ml胰蛋白酶，消化1min后，在显微镜下可以观察到细胞收缩、变圆和变透明，加入2ml细胞培养液终止消化，收集细胞至15ml离心管中，500g离心3min，吸弃上清液，所得沉淀即为成肌细胞。
31.将血球计数板及盖片用75％酒精擦拭干净后，在显微镜下找到血球计数板视野。离心管加入2ml细胞培养液重悬浮后，吸取20μl液体加入细胞计数板，使细胞悬液充满盖片和计数板之间的空隙，没有气泡产生。使用细胞计数器计算4部分细胞总数，根据记上不记下，记左不计右的原则计算压线细胞数。每毫升细胞数＝4部分细胞数总和/4
×
104个。计算得：成肌细胞数为4.168
×
107个/ml。
32.根据试验要求，将细胞悬浮液按照不同密度种板。96孔板接种1
×
104个细胞(200μl)，6孔板接种1
×
105个细胞(2ml)，10cm细胞培养皿接种1
×
106个细胞(10ml)，注意均匀接种。
33.本发明在操作时，一定要注意消化肌肉组织过程中，胰蛋白酶消化时间不能超过5min，避免降低细胞活性。消化2min后，若仍有肉眼可见的肉块存在，在水浴锅中持续震荡30s，静置30s，震荡过程重复2到3次即可保证获得分离出较多的细胞。通过筛网和差速贴壁可以获得纯度较高的原代成肌细胞。因此，使用本方法可以在较短的时间内获得大量活性较好的可培养的原代成肌细胞，缩短细胞培养时间，提高试验效率，保证试验顺利进行。
34.本分离培养方法在操作过程中具有简化分离细胞步骤，减少仪器和耗材使用等特点，能够快速分离出细胞，原代成肌细胞经纯化后贴壁培养48h即可进行传代培养，最终得到数量多、活性好，生长旺盛的细胞，结果重复性好，满足开展成肌细胞各类相关科学试验要求。