一种调控皮肤及其毛发再生的内源性小RNA分子靶标及其应用

一种调控皮肤及其毛发再生的内源性小rna分子靶标及其应用
技术领域
1.本领域涉及医学领域，具体地涉及一种调控皮肤及其毛发再生的内源性小rna分子靶标及其应用。


背景技术：

2.皮肤上皮组织是人体最外层的屏障，主要包括表皮、毛囊、皮脂腺、汗腺等。正常皮肤毛囊由其干细胞/前体细胞的激活-静止循环所驱动而不断进行包括静止期-生长期-退行期在内的循环毛发再生，简称毛发周期。毛囊中的干细胞/前体细胞主要包括位于隆突区域的隆突干细胞(bulge stem cell,简称bu scs)以及位于隆突与真皮乳头之间的毛种质(hair germ,简称hg)细胞。其中，由外来生长信号刺激导致的hg细胞增殖激活是毛囊从静止期转入生长期的初始步骤。
3.毛囊再生能力的紊乱与脱发症等常见皮肤疾病密切相关。例如，雄激素脱发症(androgenetic alopecia,aga)是一种常见的脱发症，其临床特征表现为毛发再生能力大幅度减弱，毛囊萎缩，hg细胞数量显著减少。此外，化疗，焦虑等其他病理性因素也能够导致脱发。除了头皮之外，其它部位的人类皮肤中也广泛存在细小的毛发。目前临床上大面积创面的修复和整形过程中都面临着创面毛发难以再生的问题。而促进这些毛发的再生对于恢复皮肤的正常外观有重要意义。
4.目前，仅有两种被美国食品药品监督管理局(food and drug administration,fda)批准的用于临床治疗aga的药物，分别是局部涂抹的米诺地尔和口服的非那雄胺。临床上，2％的米诺地尔用于治疗女性aga，5％的浓度用于治疗男性aga。非那雄胺仅用于治疗男性，其剂量为每天1mg。然而，这些药物均存在明显的副作用。米诺地尔可能会导致红斑、脱皮、脱发等，而非那雄胺可能导致男性性功能障碍和女性化。因此，若能通过促进毛囊干细胞/前体细胞的再生能力来取代上述药物或降低其用药剂量以削减副作用，将在脱发症治疗中具有重要的实用价值。另一方面，在美容和化妆品领域也存在去除或抑制特定区域毛发生长的需求。目前的主流方法为通过物理或化学方法脱毛。短期性的脱发方法主要利用脱毛膏、蜡去毛、剃须膏等方法直接移除目标区域毛发。但这种脱毛法会激活毛囊自身的再生功能而导致迅速的毛发再生。长期性的脱毛方法主要通过激光直接破坏毛囊，但成本较高，且对皮肤具有一定损伤性。仅适于去除小块区域较粗的毛发，难以用于抑制大片皮肤中细微的毛发生长。
5.微小rnas在动物的发育、生理、疾病和进化方面都有重要作用
6.因此，本领域迫切需要开发一种有效的微小rnas靶标，及其抑制剂或类似物在制备用于促进或抑制皮肤及其毛发再生的药物中的用途。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种有效的微小rnas靶标，及其抑制剂在制备用于促进皮
肤及其毛发再生的药物中的用途。
8.在本发明的第一方面，提供了一种靶向mir-24的活性成分，或含所述活性成分的制剂的用途，所述活性成分用于制备调节皮肤及其毛发生长的药物。
9.在另一优选例中，所述皮肤来源于哺乳动物。
10.在另一优选例中，所述哺乳动物包括(但不限于)人、啮齿动物(如小鼠、大鼠)。
11.在另一优选例中，所述靶向mir-24的活性成分用于上调(或增加)mir-24的数量和/或活性；或用于下调(或减少)mir-24的数量和/或活性。
12.在另一优选例中，所述的靶向mir-24的活性成分包括：mir-24抑制剂或拮抗剂。
13.在另一优选例中，所述的mir-24抑制剂或拮抗剂用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进皮肤及其毛发生长。
14.在另一优选例中，所述的靶向mir-24的活性成分包括：mir-24激动剂或促进剂。
15.在另一优选例中，所述的mir-24激动剂或促进剂用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抑制皮肤及其毛发生长。
16.在另一优选例中，所述的组合物包括：化妆品组合物、或药物组合物。
17.在另一优选例中，调节皮肤及其毛发生长包括：
18.a)抑制皮肤及其毛发生长；和/或
19.b)促进皮肤及其毛发生长。
20.在另一优选例中，所述靶向mir-24的活性成分选自下组：
21.i)选自下组的靶向抑制mir-24的活性成分：小分子化合物、mirna、反义核酸(如反义rna)、mrna、抗体、基因编辑试剂、海绵抑制剂、或其组合；
22.ii)选自下组的靶向激动mir-24的活性成分：小分子化合物、mirna、核酸类似物、或其组合。
23.在另一优选例中，所述靶向mir-24的反义核酸抑制剂的序列选自下组：seq id no:3、seq id no:4，或其组合。
24.在另一优选例中，所述靶向mir-24的核酸类似物的序列选自下组：seq id no:5、seq id no:6，或其组合。
25.在另一优选例中，所述的制剂选自下组：外用制剂、口服制剂、注射剂。
26.在另一优选例中，所述的外用制剂选自下组：霜剂、膏剂、乳液。
27.在另一优选例中，所述制剂选自下组：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。
28.在另一优选例中，所述的制剂还包括：米诺地尔、非那雄胺、或其组合。
29.在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合包含：
30.a)靶向mir-24的活性成分；
31.b)其他药学上可接受的载体或赋形剂。
32.在另一优选例中，所述靶向mir-24的活性成分包含：
33.a1)选自下组的靶向抑制mir-24的活性成分：小分子化合物、mirna、反义核酸(如反义rna)、mrna、抗体、基因编辑试剂、海绵抑制剂、或其组合；或
34.a2)选自下组的靶向激动mir-24的活性成分：小分子化合物、mirna、核酸类似物、或其组合。
35.在另一优选例中，所述靶向mir-24的反义核酸抑制剂的序列选自下组：seq id no:3、seq id no:4、或其组合。
36.在另一优选例中，所述靶向mir-24的核酸类似物的正义链序列选自下组：seq id no:5、seq id no:7、或其组合。
37.在另一优选例中，所述靶向mir-24的核酸类似物的反义链序列选自下组：seq id no:6、seq id no:8、或其组合。
38.在本发明的第三方面，提供了一种调节细胞对生长因子刺激的敏感性的方法，将所述细胞与治疗有效量的靶向mir-24的活性成分接触。
39.在另一优选例中，所述细胞选自：上皮细胞，真皮细胞，间充质细胞。
40.在另一优选例中，所述抑制mir-24的活性成分如上所述。
41.在另一优选例中，所述靶向mir-24的反义核酸抑制剂的序列选自下组：seq id no:3、seq id no:4、或其组合。
42.在另一优选例中，所述靶向mir-24的核酸类似物的正义链序列选自下组：seq id no:5、seq id no:7、或其组合。
43.在另一优选例中，所述靶向mir-24的核酸类似物的反义链序列选自下组：seq id no:6、seq id no:8、或其组合。
44.在本发明的第四方面，提供了一种促调节毛发生长的方法，为有需要的患者在有需要的部位施用医学有效量的靶向mir-24的活性成分。
45.在另一优选例中，所述调节皮肤及其毛发生长包括：
46.a)抑制皮肤及其毛发生长；和/或
47.b)促进皮肤及其毛发生长。
48.在另一优选例中，所述靶向mir-24的活性成分如上所述。
49.在另一优选例中，所述有需要的患者选自：脱发患者、烫伤患者、烧伤患者、溃疡患者、皮肤移植患者、整形患者等需要进行皮肤及毛发再生的人群。
50.在另一优选例中，所述有需要的部位选自：
51.s1)上皮组织、头皮部位、面部及其它身体部分的皮肤；
52.s2)组织工程皮肤。
53.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
54.图1：靶向抑制或敲除mir-24能够有效促进皮肤及其毛发再生。
55.其中(a)：构建mir-24 dko小鼠的示意图。
56.(b)：qrt-pcr检测dko及其同窝qko对照小鼠原代mk中的mir-24簇成员mirna的表达量。每样本n＝3。
57.(c)：同窝qko和dko小鼠在出生后第55天(postnatal days 55,p55)剃毛后到p119和p155时间点的代表性背皮照片(左侧)及其在p120的背皮毛发覆盖率％统计。比例尺1cm。
58.(d):同窝dko和qko小鼠背皮在5.5mm直径区域(虚线圈)定量拔毛200根后(剩余毛
发剃掉)第29天(d29)的代表性照片。比例尺1mm。箭头：黑色的毛发再生迹象。
59.(e):按d图所述的定量拔毛小鼠在拔毛后第10天拔毛区域背皮上皮整体免疫荧光染色(左图)及其中ki67染色阳性hg比例统计(右图)。比例尺：25μm。ki67染色为白色。箭头和虚线圈代表hg。
60.(f):如上方的示意图所示，p50小鼠背皮剃毛后在局部涂抹高或低剂量米诺地尔(miolo或miohi)或溶剂对照(veh)后第21天(d21)的代表性(n＝3)背皮照片。比例尺：1cm。虚线框：涂药区域。
61.(g):如上f图所述，用miolo或veh局部涂抹同窝qko和dko小鼠后d21时间点的代表性背皮照片(左图)及其虚线框涂药区域的再生毛发覆盖率％统计(右图)。比例尺：1cm，每个样本n＝3。
62.(h):荧光定量pcr分析mir-24表达量。样本为稳定地感染了scramble或mir-24过表达慢病毒(-scr/-m24)的qko或dko mk(d或q)。细胞预先在cnt-basal培养基中处理了16小时。每个样本n＝4。
63.(i):上述h图所述的四种mk细胞在不同百分比的生长培养基(横轴，在cnt-basal中稀释的cnt-pr的百分比)中的生长速率统计。纵轴：cck-8法测量的5天(测量第5天对比测量起点)生长倍数。实验前，细胞预先在cnt-basal培养基中处理了16小时。每个样本n＝3。
64.(j):荧光定量pcr分析mir-24表达量。样本为转染antagomir-scramble(scr)或antagomir-24(a-m24)后24小时的wt mk细胞。每个样本n＝3。
65.(k):上面j图所述的mk细胞由cck-8法测量的2天扩增倍率(测量第2天对比测量起点)统计。测量起点为转染后12小时。每个样本n＝3。
66.以上所有统计图中p值通过双尾t检验计算，误差条(error bar)代表standard error，散点代表单个数据点。
67.图2：过表达mir-24能够有效抑制皮肤及其毛发再生。
68.其中(a)k14-rtta,tre-mir24双转基因(double transgenic,dtg)小鼠模型示意图。
69.(b)荧光定量pcr分析mir-24及其附近mirna的表达量。样本为p52(自p49起dox诱导)dtg/wt同窝鼠经dispase分离的尾上皮。每个样本n＝3。
70.(c)p150 wt/dtg同窝鼠的代表性(n＝3)背部皮肤照片和头发覆盖率统计数据。no dox/ dox：小鼠自p52起不经强力霉素诱导或经强力霉素诱导。比例尺：1厘米。每个样本n＝3。
71.(d)荧光定量pcr分析mir-24表达量。样本为转染agomir-scramble(ago-scr)或agomir-24(ago-m24)后6小时的dko mk细胞。每个样本n＝3。(e)上面d图所述的mk细胞由cck-8法测量的3天扩增倍率(测量第3天对比测量起点)统计。测量起点为转染后12小时。每个样本n＝3。
72.以上所有统计图中p值通过双尾t检验计算，误差条(error bar)代表standard error，散点代表单个数据点。
具体实施方式
73.本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现抑制一种特定的微小rna，优选
地为mir-24,能有效调控皮肤及其毛发的再生，在此基础上完成了另外本发明。
74.具体地，本发明发现了抑制mir-24的表达在促进皮肤及其毛发再生的同时，不影响皮肤的发育。进一步地，本发明的实施例表明，抑制mir-24的表达能够提高物理拔毛刺激和生发药物米诺地尔导致的毛发再生敏感性。在此基础上，本发明提供了mir-24的反义核酸抑制剂、mirna海绵抑制剂、或特定小分子药物靶向抑制mir-24，在制备用于促进皮肤及其毛发再生的药物中的用途。
75.此外，本发明还发现了上调mir-24的表达能在够抑制皮肤及其毛发再生的同时，不影响皮肤的发育。在此基础上，本发明提供了mir-24的类似物、靶向激动mir-24的小分子化合物，在制备抑制皮肤及其毛发生长的药物中的用途。
76.术语
77.如本文所用，本发明的“活性成分”为抑制mirnas的活性成分，优选地为抑制mir-24的活性成分，其包含靶向mir-24的抑制剂。
78.在另一优选例中，所述抑制mir-24的活性成分选自下组：靶向抑制mir-24的小分子化合物、靶向mir-24的mirna、靶向mir-24的反义核酸(如反义rna)抑制剂、mrna、抗体、基因编辑试剂、靶向mir-24的海绵抑制剂、或其组合。
79.在另一优选例中，所述靶向mir-24的反义核酸抑制剂的序列选自下组：seq id no:3、seq id no:4、或其组合。
80.微小rnas
81.微小rnas(micrornas,mirnas)是约22个核苷酸的内源性短链非编码rna，在动物的发育、生理、疾病和进化方面都有重要作用。作为一种重要的内源性小核酸因子，mirnas可以被对应的反义小核酸抑制剂(antogomir，anti-mir等)或富集mirna靶位点的海绵性抑制剂(mirna sponge)或特定的小分子药物靶向抑制，是一类重要的治疗标靶。
82.mir-24
83.mir-24是一个在正常皮肤上皮组织中高度表达的mirna。它在小鼠皮肤中的持续过表达能够导致皮肤和毛囊发育缺陷，并导致小鼠在出生后数天内死亡。这些研究声称mir-24可能具有促进表皮细胞末端分化的作用，但并未涉及其与皮肤及其毛发再生过程的关联。
84.药物组合物
85.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物所述药物组合物包括：
86.a)选自下组的抑制mirnas的活性成分：小分子化合物、mirna、反义核酸(如反义rna)、mrna、抗体、基因编辑试剂、mirna海绵抑制剂、或其组合。
87.b)选自下组的药物：米诺地尔、非那雄胺、或其组合。
88.c)药学上可接受的载体或赋形剂。
89.在另一优选例中，所述抑制mirnas的活性成分为抑制mir-24的活性成分。
90.在另一优选例中，所述抑制mir-24的活性成分选自下组：靶向抑制mir-24的小分子化合物、靶向mir-24的mirna、靶向mir-24的反义核酸(如反义rna)抑制剂、mrna、抗体、基因编辑试剂、靶向mir-24的海绵抑制剂、或其组合。
91.在另一优选例中，所述靶向mir-24的反义核酸抑制剂的序列选自下组：seq id no:3、seq id no:4、或其组合。
92.在另一优选例中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明还可与其他治疗剂一起使用。
93.使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的组合物施用于哺乳动物，其中所述的本发明活性成分的给药剂量通常为0.001mg/kg～1000000mg/kg体重。
94.当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
95.本发明的主要优点在于：
96.a)本发明首次提出了抑制mir-24的表达可以有效促进皮肤及其毛发再生。
97.b)本发明发现敲除mir-24不仅能够促进皮肤及其毛发的再生，还不影响皮肤的发育。
98.c)本发明发首次发现抑制mir-24的表达可以提高物理拔毛刺激和生发药物米诺地尔导致的毛发再生敏感性，从而帮助提高毛发生长速率。
99.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
100.材料和方法
101.一、用于敲除mir-24实施例
102.1)动物模型
103.1.1)k14-cre小鼠：k14启动子启动过表达cre蛋白，由中国科学院上海营养与健康研究所秦骏研究员赠予，遗传背景为c57bl/6，是在皮肤上皮进行条件性基因敲除的工具小鼠。
104.1.2)mir-24-1-flox小鼠：我们委托南方模式生物有限公司通过crispr-cas9技术分别在c57bl/6野生型小鼠mir24-1基因区域(chr13:63301208-63301275)的上下游300bp左右的位置定点敲入loxp位点。得到mir24-1
loxp
小鼠(简称floxp)，理论敲除区域为chr13：63300966-63301497，完全覆盖了小鼠mir24-1基因区域，且并未影响到任何已知的周边基因。
105.1.3)mir-24-2-ko小鼠：我们委托南方模式生物有限公司通过crispr-cas9技术分别在c57bl/6野生型小鼠mir24-2基因区域(chr8:84208815-84208921)的定点敲除包含mir-24成熟体序列的35个碱基对。得到mir24-2
ko
小鼠(简称ko)，理论敲除区域为chr8:84208873-84208907，完全覆盖了小鼠mir-24成熟体序列区域，且并未影响到任何已知的周边基因。
106.为了实现皮肤上皮细胞中的mir-24条件性敲除，我们将上述floxp小鼠与ko小鼠
和k14-cre小鼠杂交。得到基因型为k14-cre，mir24-1
loxp/loxp
，mir24-2
ko/ko
的mir-24条件性敲除小鼠(简称dko)。
107.2)核酸序列：本实施例中所应用的所有微小rna序列如下表1所示：
108.表1用于用于mir-24表达实施例中的微小rna序列表
[0109][0110]
注：1.对于seq id no.:3和4，s下标代表硫代骨架修饰，chol代表胆固醇修饰，全链甲氧基修饰。
[0111]
2.mir-24核心序列：ggcucag。
[0112]
3)总rna提取及荧光定量pcr
[0113]
细胞rna提取：将6孔板的培养基吸走后，用dpbs清洗贴壁细胞一次，吸走dpbs后，每孔加入500μl trizol(invitrogen)，室温裂解10分钟后使用zymo#r2070试剂盒进行rna提取。或者每孔加入500μl rz(天根)室温裂解10分钟后使用天根#dp419进行rna提取。具体步骤参见产品说明书。
[0114]
mirna反转录及荧光定量pcr：使用吉玛基因的#e22007试剂盒对mir-24/mir-205/mir125b进行反转录和荧光定量pcr。使用takara#638315试剂盒对mir-23a/mir-23b/mir27a/mir27a进行反转录，用abm#mastermix-ms进行荧光定量pcr。具体步骤参见各自说明书。两种方法都使用u6为内参基因，使用2
-△△
ct
方法计算相对表达量。所有样本均标准化到图中说明的对照样本水平。
[0115]
4)小鼠表皮细胞(mk)原代分离及培养
[0116]
取出生后4天之内的新生鼠，经75％乙醇清洗后，在dpbs中剪掉头部、四肢和尾巴后，沿躯干两侧分离背皮。在干净的dpbs中清洗之后置于2.5mg/ml dispase(roche#4942078001)中，4℃过夜。第二天，用干净的dpbs清洗背皮，置于trypsin-versene(lonza#17-161f)中，室温消化15分钟。将消化后的背皮剪碎，用等体积的pfe(dpbs 5％v/v fbs 1mm edta)终止消化。将上述混合液移到新的50ml离心管中，反复吹打30次，过70μm细胞筛。4℃300g离心5分钟，弃上清。dpbs重悬细胞沉淀，4℃300g离心5分钟，弃上清。将细胞沉淀用growth培养基(cnt-pr 1％pen-strep 10μμy-27632)重悬后铺到细胞培养皿中。
[0117]
5)antagomir转染mk
[0118]
以转染6孔板为例，选用qiagen effectene#301427转染试剂盒，antagomir终浓度为200nm，步骤如下：
[0119]
1.混合400pmol(～2.3μg)的antagomir与buffer ec，总体积为100μl。
[0120]
2.加入18.4μl enhacer(8:1)，轻弹混匀后室温静置3分钟。
[0121]
3.加入6.9μl effectene(3:1)，轻弹混匀后室温静置10分钟。
[0122]
4.将mk换为新鲜培养基后，逐滴滴入上述转染复合物。转染12小时后进行下游实验。
[0123]
6)cck-8法细胞增殖能力检测
[0124]
对不同mk增殖能力的检测主要采用两种方法：
[0125]
1)cck-8(碧云天#c0039)检测不同天数的吸光值来计算细胞相对增殖倍数。
[0126]
2)用双色竞争实验方法来检测靶标细胞的相对竞争能力强弱。
[0127]
cck-8方法操作如下：
[0128]
1.将mk铺到96孔板中，每孔加入100μl培养基，留4-6个不加细胞只有培养基的孔，作为空白孔。
[0129]
2.铺板16小时后，待检测每孔加入10μl cck-8，置于37℃培养箱1.5小时。
[0130]
3.使用酶标仪检测450nm波长的吸光度。
[0131]
4.将样品孔减去空白孔，记为第一天的吸光度a1。
[0132]
5.铺板后第n天左右重复步骤2-4，记为第n天的吸光度an。
[0133]
6.an/a1记为该细胞的n天增殖倍数。
[0134]
8)mk对生长刺激敏感性检测
[0135]
mk铺板后第二天，用不含任何生长因子的基础培养基cnt-basal(#cnt-pr-bm.1)处理16小时，按照如下比例混合basal/growth：0％、12.5％、25％、50％、100％。五天后使用cck-8方法检测吸光值。每种比例吸光值/0％吸光值即为该比例下的细胞相对增殖倍数。对不同细胞而言，同一比例下相对增殖倍数较高的细胞对生长刺激较为敏感。
[0136]
9)定量拔毛实验
[0137]
先用剃毛刀在小鼠背部剃毛，圈出直径为5.5mm的圆形区域，在解剖显微镜下用镊子尽可能均匀地在指定区域拔200根毛，注意，每次只能拔一根。为日后准确确定拔毛区域，拔毛后用小剪刀将整个圆形区域的毛剪至最短。拔毛后第1天及第29天用解剖显微镜和皮肤显微镜分别对拔毛区域进行拍照。
[0138]
10)米诺地尔诱导毛发再生阈值实验
[0139]
用无水乙醇：水：1,2-异丙醇＝5：3：2的溶液作为溶剂溶解mce#hy-b0112的米诺地尔粉末，分别配制0.01g/ml(1％)和0.02g/ml(2％)的米诺地尔溶液。将小鼠背部剃毛后，在小鼠背中线的中点处用“十”字将小鼠背皮分为四个区域，每个区域涂抹100μl米诺地尔溶液，连续涂抹14天。涂抹0.01g/ml溶液记为miolo，涂抹0.02g/ml溶液记为miohi。涂抹结束后7天进行拍照分析。
[0140]
11)统计分析
[0141]
两组样本之间的统计学差异用双尾t检验进行分析，显示结果采用平均值
±
标准误来展示。p值大于等于0.05视为没有统计学差异，小于0.05视为有统计学差异，小于0.01、小于0.001则表示有显著的统计学差异。
[0142]
二、用于激动mir-24过表达实施例
[0143]
1)动物模型
[0144]
1.1)k14-rtta小鼠：k14启动子启动过表达rtta蛋白，由北京生命科学研究所陈婷
研究员赠予，遗传背景为c57bl/6，是在皮肤上皮进行诱导性性基因过表达的工具小鼠。
[0145]
1.2)tre-mir24小鼠：我们委托上海南方模式生物科技股份有限公司制作在有rtta的情况下，在强力霉素驱动下可过表达mir-24的转基因小鼠。
[0146]
为了实现皮肤上皮细胞中的mir-24诱导性过表达，我们将上述tre-mir24小鼠与k14-rtta小鼠杂交。得到基因型为k14-rtta，tre-mir24的mir-24诱导性过表达小鼠(简称dtg)。
[0147]
2)核酸序列：用于本实施例中的微小rna的序列如下表2所示：
[0148]
表2.用于激动mir-24过表达实施例中的微小rna序列表
[0149][0150][0151]
注：1.对于seq id no.:5和6，s下标代表硫代骨架修饰，chol代表胆固醇修饰，全链甲氧基修饰。
[0152]
2.mir-24核心序列：ggcucag。
[0153]
3)总rna提取及荧光定量pcr
[0154]
细胞rna提取：将6孔板的培养基吸走后，用dpbs清洗贴壁细胞一次，吸走dpbs后，每孔加入500μl trizol(invitrogen)，室温裂解10分钟后使用zymo#r2070试剂盒进行rna提取。或者每孔加入500μl rz(天根)室温裂解10分钟后使用天根#dp419进行rna提取。具体步骤参见产品说明书。
[0155]
mirna反转录及荧光定量pcr：使用吉玛基因的#e22007试剂盒对mir-24/mir-205/mir125b进行反转录和荧光定量pcr。使用takara#638315试剂盒对mir-23a/mir-23b/mir27a/mir27a进行反转录，用abm#mastermix-ms进行荧光定量pcr。具体步骤参见各自说明书。两种方法都使用u6为内参基因，使用2
-△△
ct
方法计算相对表达量。所有样本均标准化到图中说明的对照样本水平。
[0156]
4)小鼠背皮整体染色
[0157]
取新鲜的小鼠全层背皮(≥2mm*2mm，剃毛，但不需要去掉皮下脂肪进行如下步骤操作：
[0158]
配制封闭液：pbs 10％v/v normal goat serum 2％m/v bsa 0.2％v/v triton-x。0.22μm滤器过滤，4℃储存。注意：normal goat serum(jackson#005-000-121)按照说明书加入双蒸水后，55℃30分钟热灭活后使用。
[0159]
将上述组织置于5mm edta(pbs稀释)中,37℃6小时(背皮，最短可4小时)。后续所有操作都在1.5ml离心管中进行。用镊子撕开表皮和真皮。此时包括表皮和毛囊的上皮组织应该成整体分离。将分离下来的整体上皮组织置于4％多聚甲醛中，室温1小时或4℃过夜。pbs洗三次，每次5分钟。根据需要进行edu染色，具体步骤按照thermo#c1063试剂盒进行。如不需要，直接进入封闭。室温封闭2小时。用1中封闭液稀释一抗，4度过夜。pbs洗三次，每次5分钟。用1中封闭液稀释二抗，室温1小时。pbs洗三次，每次5分钟。
[0160]
封片：在载玻片上先加200微升左右的封片液ebioscience#00-4959-52
[0161]
再将表皮的外表面贴近载玻片，毛囊面(或者叫真皮面)贴近盖玻片放置，盖上盖玻片，尽量赶走气泡。指甲油封片。
[0162]
使用蔡司cell observer z-stack模式拍照分析。
[0163]
5)小鼠表皮细胞(mk)原代分离及培养
[0164]
取出生后4天之内的新生鼠，经75％乙醇清洗后，在dpbs中剪掉头部、四肢和尾巴后，沿躯干两侧分离背皮。在干净的dpbs中清洗之后置于2.5mg/ml dispase(roche#4942078001)中，4℃过夜。第二天，用干净的dpbs清洗背皮，置于trypsin-versene(lonza#17-161f)中，室温消化15分钟。将消化后的背皮剪碎，用等体积的pfe(dpbs 5％v/v fbs 1mm edta)终止消化。将上述混合液移到新的50ml离心管中，反复吹打30次，过70μm细胞筛。4℃300g离心5分钟，弃上清。dpbs重悬细胞沉淀，4℃300g离心5分钟，弃上清。将细胞沉淀用growth培养基(cnt-pr 1％pen-strep 10μμy-27632)重悬后铺到细胞培养皿中。
[0165]
6)agomir转染mk
[0166]
以转染6孔板为例，选用qiagen effectene#301427转染试剂盒，agomir终浓度为200nm，步骤如下：
[0167]
混合400pmol(～2.3μg)的agomir与buffer ec，总体积为100μl。
[0168]
加入18.4μl enhacer(8:1)，轻弹混匀后室温静置3分钟。
[0169]
加入6.9μl effectene(3:1)，轻弹混匀后室温静置10分钟。
[0170]
将mk换为新鲜培养基后，逐滴滴入上述转染复合物。转染12小时后进行下游实验。
[0171]
7)cck-8法细胞增殖能力检测
[0172]
对不同mk增殖能力的检测主要采用两种方法：1)cck-8(碧云天#c0039)检测不同天数的吸光值来计算细胞相对增殖倍数。2)用双色竞争实验方法来检测靶标细胞的相对竞争能力强弱。
[0173]
cck-8方法操作如下：
[0174]
将mk铺到96孔板中，每孔加入100μl培养基，留4-6个不加细胞只有培养基的孔，作为空白孔。
[0175]
铺板16小时后，待检测每孔加入10μl cck-8，置于37℃培养箱1.5小时。
[0176]
使用酶标仪检测450nm波长的吸光度。
[0177]
将样品孔减去空白孔，记为第一天的吸光度a1。
[0178]
铺板后第n天左右重复步骤2-4，记为第n天的吸光度an。
[0179]
an/a1记为该细胞的n天增殖倍数。
[0180]
实施例1 mir-24的敲除增强毛发生长，且不影响皮肤发育
[0181]
方法
[0182]
小鼠中内源性mir-24可以分别由13号染色体(mir24-1)和8号染色体(mir24-2)上的两个独立基因编码。两个mir24基因均位于mir23-mir27-mir24簇中。我们通过基因工程技术直接敲除了mir24-2基因(mir24-2
ko/ko
)，同时在mir24-1基因两侧敲入了loxp位点(mir24-1
loxp/loxp
)。将这些小鼠互相杂交并再krt14-cre小鼠(jakson lab)杂交(图1a)，我们得到了皮肤上皮特异性的mir-24敲除小鼠[k14-cre，mir24-1
loxp/loxp
，mir24-2
ko/ko
],简称dko。同时，我们称在这种繁殖过程中得到的，仅缺失了一个mir24-2拷贝的[mir24-1
loxp/loxp
，mir24-2
ko/
]小鼠为qko，此为我们在下面研究中用到的主要对照小鼠。
[0183]
对上述基因工程小鼠表皮细胞(mk)的荧光定量pcr(qrt-pcr)分析,毛发生长分析。
[0184]
研究结果
[0185]
通过对上述基因工程小鼠表皮细胞(mk)的荧光定量pcr(qrt-pcr)分析，确认了dko小鼠皮肤上皮细胞中的mir-24表达大幅度下调，而其他mir23-mir27-mir24簇的成员mirna未受影响(图1b)。
[0186]
通过对上述小鼠的毛发生长分析，发现mir-24的敲除显著增强了皮肤及其毛发的再生能力。
[0187]
dko小鼠的自然毛发再生速率显著加快(图1c)。值得一提的是，dko小鼠的皮肤和毛发外观与qko对照小鼠并无可见区别(图1c)，说明mir-24敲除并无影响皮肤发育和结构的副作用。
[0188]
实施例2 mir-24的敲除提高物理拔毛刺激导致的毛发再生敏感性
[0189]
方法
[0190]
对上述基因工程小鼠表皮细胞(mk)，进行物理拔毛刺激。
[0191]
结果
[0192]
之前已有研究显示在小鼠皮肤中定量拔毛的密度需要超过一定的阈值才能触发毛发再生。而不足以触发qko小鼠毛发再生的定量拔毛密度仍可有效触发dko小鼠的毛发再生(图1d，1e)。
[0193]
因此可以断定，dko小鼠对物理拔毛刺激导致的毛发再生的敏感性显著提高。
[0194]
实施例3 mir-24的敲除提高生发药物米诺地尔触发的毛发再生的敏感性
[0195]
方法
[0196]
在野生型小鼠(wt)中表面，分别涂抹1％、2％浓度的米诺地尔溶液(用于临床女性脱发治疗的浓度)。在dko小鼠表面分别涂抹1％、2％浓度的米诺地尔溶液。
[0197]
结果
[0198]
dko小鼠对生发药物米诺地尔触发的毛发再生的敏感性显著提高。在野生型小鼠(wt)中，2％浓度(用于临床女性脱发治疗的浓度)米诺地尔溶液的表面涂抹可以有效激活毛发再生，但1％浓度的米诺地尔溶液则无效(图1f)。
[0199]
而在dko小鼠中，1％浓度的米诺地尔溶液即可有效激活毛发再生(图1g)。
[0200]
因此断定，dko显著提高了小鼠表皮细胞(mk)对生长因子导致的细胞增殖的敏感性，而这种效应可以被mir-24过表达显著抑制(图1h，1i)。
[0201]
此外，我们还发现转染mir-24的反义核酸抑制剂(antagomir)可以有效降低皮肤上皮细胞中的mir-24水平(图1j)，并促进其生长(图1k)。
[0202]
综上所述，通过构建并分析皮肤上皮组织特异性的mir-24条件性敲除小鼠模型，发现它的敲除并不影响正常皮肤发育与结构，但却能够显著加速毛发周期的速率。更重要的是，这种敲除显著提高了皮肤对毛发再生刺激因素(例如米诺地尔或拔毛)的敏感性，使得我们可以利用显著低于正常剂量的生发药物来有效诱导毛发再生。
[0203]
通过细胞实验，我们发现mir-24敲除显著提高了皮肤上皮细胞对生长因子刺激的敏感性。此外，我们还发现mir-24的反义核酸抑制剂能够显著降低皮肤上皮细胞中的mir-24水平，并促进其生长。
[0204]
因此推断，通过反义核酸抑制剂、mirna海绵抑制剂、或特定小分子药物靶向抑制mir-24，或通过基因工程方法敲除mir-24是促进皮肤及其毛发再生的有效新途径。
[0205]
实施例4mir-24过表达抑制毛发生长
[0206]
方法
[0207]
为避免组成型过表达mir-24的致死性问题，我们模仿先前建立的四环素诱导型mirna过表达转基因系统，构建了tre-mir24,k14-rtta双转基因(double transgenic,dtg)小鼠模型(图2a)。
[0208]
在这些小鼠中，强力霉素(doxycycline,dox)可强烈诱导皮肤上皮特异性过表达mir-24，而不会干扰mirc22簇(包括三个成员：mir23b,mir27b,mir24-1)和mirc11簇(包括三个成员：mir23a,mir27a,mir24-2)的其他相邻mirna(图2b)。
[0209]
设置w t同窝鼠空白对照组、未经dox诱导的dtg小鼠对照组、dox诱导的dtg小鼠实验组。并与对上述小鼠进行毛发生长分析。
[0210]
结果
[0211]
本发明人发现mir-24的过表达显著抑制了皮肤及其毛发的再生能力。
[0212]
第一，我们的数据表明，与wt同窝鼠或未经dox诱导的dtg小鼠相比，dox诱导的dtg小鼠在第三次毛囊周期中的毛发生长明显延迟(图2c)。
[0213]
第二，我们也在体外检测了mir-24对皮肤上皮前体细胞增殖的抑制作用。我们发现转染mir-24的核酸类似物(agomir)可以有效提高皮肤上皮细胞中的mir-24水平(图2d)，并抑制其生长(图2e)。
[0214]
因此可以推断，mir-24的激动剂，或者通过转染mir-24的核酸类似物使得mir-24过表达的方法，可以提高细胞中mir-24水平，从而抑制皮肤及其毛发生长。
[0215]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。