一种高通量创制植物EMS突变群体的方法与流程

一种高通量创制植物ems突变群体的方法
技术领域
1.本发明涉及小麦突变技术领域，具体涉及一种高通量创制植物ems突变群体的方法。


背景技术：

2.小麦(triticum aestivum)是重要的粮食作物，在全球范围内广为种植，以小麦为主粮 的人口约占世界总人口数的33％。在我国，小麦仅次于水稻，为第二大粮食作物。因此， 小麦的高产和稳产对于我国粮食安全起着举足轻重的作用。
3.普通小麦(aabbdd，2n＝6x＝24)为异源六倍体作物，基因组庞大且复杂，约为17gb， 且存在大量的基因冗余和约80％的重复序列，这限制着小麦功能基因组学的发展。而随着 基因组测序技术日渐成熟，对小麦基因功能的研究成为重点。目前，从基因序列着手，创 建突变群体，鉴定突变体表型的反向遗传学手段已逐渐成为研究基因功能和解析复杂表型 的重要方法。
4.目前，创建小麦突变体库的方法主要包括自然变异、物理诱变、化学诱变和生物诱变 等。具体方法如下：
5.1、自然变异
6.自然变异是指不加人工控制，生物个体在自然情况下发生的变异。优良的自然变异个 体在育种工作中能够发挥非常重要的作用。但在高等植物中，自然变异的频率较低，产生 的变异类型较少，无法满足功能基因组学的研究。
7.2、物理诱变
8.物理诱变主要指利用射线、离子和中子等物理辐射因素及空间环境因素诱变种子或植 物离体组织，从而获得突变体的过程。物理诱变处理过程较为简便，能够进行大批量的诱 变，易出现明显的变异表型。物理诱变产生的突变类型主要包括小片段染色体的插入或缺 失、单碱基变异、染色体倒位及易位等。目前全球已有100多个国家利用辐射诱变技术改 良粮食作物、经济作物和苗木花卉等。此外，我国利用辐射诱变技术在小麦品种培育上取 得的成就在亚洲乃至世界居于首位。物理诱变通常导致突变类型复杂、生物体损伤严重、 也会出现多种突变等，目前通过物理诱变创建小麦突变体库的报道相对较少。
9.3、化学诱变
10.化学诱变指利用能够引起突变的化学物质对植物种子或组织进行诱变处理的过程，主 要的化学诱变剂包括烷化剂类和叠氮化合物类。化学诱变主要造成点突变和小片段缺失， 对生物体结构损伤较小，突变谱广，更容易产生有益突变。目前常用的化学诱变剂为烷化 较多的ems(ethyl methane sulfonste,甲基磺酸乙酯)，与其他诱变剂相比，ems诱变能 够产生较多的显性突变体，易于表型筛选；ems诱导产生点突变的频率较高，而造成的 染色体畸变较少，生理损伤轻。总体而言，ems诱变范围广，产生的突变类型也相对丰 富，常用于小麦突变群体的创制。
11.4、生物突变
12.随着转基因技术的不断发展，外源序列能够被高效地转入生物体内并整合到染色体 上，进而造成基因突变，影响基因功能。目前常用的插入原件包括t-dna，基因陷阱和 转座子标签等。插入突变在基因功能研究中发挥重要的作用，针对性强，效率高。但是， 受遗传转化效率和组织培养特性等因素的影响，插入突变还无法广泛地应用于小麦中。随 着基因编辑技术的成熟，高通量基因编辑技术在创制小麦突变群体中也将发挥重要作用。
13.由于小麦基因组庞大，因此创建饱和的ems突变群体需要大量的处理和田间种植工 作。传统的小麦突变体群体创建方法如下：1)ems处理预实验，确定ems处理浓度；2) 称取适量成熟种子，放入100ml ems溶液中，在150rpm、25℃条件下，震荡处理10h；3) 使用双层纱布封堵三角瓶口，流水冲洗4h；4)将用水浸湿的发芽纸铺在塑料盒中，然后 将ems处理过的种子(m1代)在发芽纸上进行发芽，并在塑料盒顶部覆盖保鲜膜进行保 湿发芽；5)发芽后将活力较高的幼苗移栽到温室或者将发芽后5天的幼苗直接种植到大田 中。该突变群体创建方法存在诸多弊端。首先，该ems处理方法通量较低，若要创建饱和 的突变群体，需要多次处理，耗费时间；其次，传统发芽种植的方法需要消耗大量的人力 和物力，在高通量的突变体种植工作中无法实现。因此，针对研究的需要及目前在植物突 变群体创建方法中存在的一些缺陷，创建一种高通量创建植物ems突变体的新方法，创建 饱和的ems突变体库。


技术实现要素：

14.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种高通量创制植物ems突变群体的方法。 本发明解决了传统小麦突变群体创建无法得到高通量突变群体的问题；可高通量对小麦种 子进行处理，无需按照传统突变体构建过程中种子发芽后再进行大田移栽，可直接在大田 中点播种子，得到高通量ems突变群体。
15.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
16.本发明的第一方面，提供一种种子处理装置，包括圆柱形的筒体，所述筒体的顶部设 有开口；所述筒体倾斜设置在可移动的筒体架上，所述筒体的底部与固定于筒体架上的转 动电机连接；所述开口的周圈设有若干搭扣；所述种子处理装置还包括与筒体活动连接的 密封盖和冲洗盖；所述密封盖的正面和冲洗盖的正面均设有与搭扣相对应的搭扣柱；所述 冲洗盖上还设有进水口和若干出水口，所述出水口上设有过滤网。
17.优选的，所述筒体架上设有两个支架，每个支架上设有两个转动滚轮，所述筒体的外 壁位于转动滚轮上。
18.优选的，所述出水口均布于进水口的周围，所述出水口的形状为扇环形。
19.优选的，所述密封盖的背面和冲洗盖的背面均设有与开口相对应的密封圈。
20.本发明的第二方面，提供所述的种子处理装置在创建高通量ems突变群体中的应用。
21.本发明的第三方面，提供一种高通量创制植物ems突变群体的方法，包括以下步骤：
22.(1)种子处理：将水和ems配置成浓度为0.4～1.2％(v/v)的ems溶液；将待处 理的种子和ems溶液置于种子处理装置中，将密封盖固定在筒体上；启动转动电机，处 理10h；处理完毕后关闭转动电机，取下密封盖，倒出ems废液进行中和，将冲洗盖固 定在筒体上，将水管固定在冲洗盖的进水口，通入清水，启动转动电机，对种子清洗去除 ems残留，清洗完
毕获得处理后的种子；
23.(2)田间种植：在待播种的土壤中进行打孔，得到若干种植孔，向每个种植孔中点 播4粒种子，然后覆盖营养土，进行田间管理，种子出苗后得到高通量ems突变群体。
24.优选的，步骤(1)中，所述ems溶液浓度为0.7或0.8％(v/v)。
25.优选的，步骤(1)中，所述种子为小麦种子；所述种子和ems溶液的用量比例为每 400粒种子添加100ml ems溶液。
26.优选的，步骤(1)中，所述筒体的转动速度为400r/min；所述清洗的时间为4h。
27.优选的，步骤(2)中，步骤(2)中，所述营养土包括泥炭土和蛭石，所述泥炭土和 蛭石的体积比为1：1；所述种植孔的直径为3cm，深度为5cm；每个种植孔之间间隔20 cm。
28.优选的，步骤(2)中，当环境最低温度小于10℃时，在播种后的土壤上覆盖地膜。
29.本发明的有益效果：
30.本发明高通量ems处理种子、田间打孔、种子种植于种植孔内、孔内覆盖营养土、孔 上覆盖地膜，解决了传统小麦突变群体创建无法得到高通量突变群体的问题；可高通量对 小麦种子进行处理，无需按照传统突变体构建过程中种子发芽后再进行大田移栽，可直接 在大田中点播种子，获得高通量ems突变群体。本发明对于创建饱和的ems突变体库具有 重要指导意义。
附图说明
31.图1：种子处理装置的结构示意图；
32.图2：密封盖和冲洗盖的背面结构示意图；
33.其中：1.筒体，2.开口，3.筒体架，4.转动电机，5.搭扣，6.密封盖，7.冲洗盖，8.搭 扣柱，9.进水口，10.出水口，11.过滤网，12.支架，13.转动滚轮，14.密封圈。
34.图3：成苗率统计图；
35.图4：种子处理装置的照片，a筒体；b密封盖；c冲洗盖；
36.图5：田间种植萌发与长势，a田间覆膜；b实施例1的济麦38萌发与长势；c实 施例2的山农30萌发与长势。
具体实施方式
37.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有 指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。
38.正如背景技术部分介绍的，传统的小麦突变体群体创建方法如下：1)ems处理预实 验，确定ems处理浓度；2)称取400粒小麦种子，放入100ml ems溶液中，在150rpm、 25℃条件下，震荡处理10h；3)使用双层纱布封堵三角瓶口，流水冲洗4h；4)将用水 浸湿的发芽纸铺在塑料盒中，然后将ems处理过的种子放置于发芽纸上，并在塑料盒顶 部覆盖保鲜膜进行保湿发芽；5)发芽后将活力较高的幼苗移栽到温室或者将发芽后5天 的幼苗直接种植到大田中。该突变群体创建方法存在诸多弊端。首先，该ems处理方法 通量非常低，若要创建饱和的突变群体，需要多次处理，耗费时间；其次，传统发芽种植 的方法需要消耗大量的人力和物力，在高通量的突变体种植工作中无法实现。
39.基于此，本发明的目的是提供一种高通量创制植物ems突变群体的方法。本发明通 过种子处理装置对小麦种子进行大规模的ems处理，如图1所示，种子处理装置包括圆 柱形的筒体1，所述筒体1的顶部设有开口2；所述筒体1倾斜设置在可移动的筒体架3 上，所述筒体1的底部与固定于筒体架3上的转动电机4连接；所述开口2的周圈设有若 干搭扣5；所述种子处理装置还包括与筒体1活动连接的密封盖6和冲洗盖7；所述密封 盖6的正面和冲洗盖7的正面均设有与搭扣5相对应的搭扣柱8；所述冲洗盖7上还设有 进水口9和若干出水口10，所述出水口10上设有过滤网11。
40.所述筒体架3上设有两个支架12，每个支架12上设有两个转动滚轮13，所述筒体1 的外壁位于转动滚轮13上。所述出水口10均布于进水口9的周围，所述出水口10的形 状为扇环形。所述密封盖6的背面和冲洗盖7的背面均设有与开口2相对应的密封圈14。
41.传统方式采用三角瓶置于摇床上处理10h，以每个摇床最多处理10个三角瓶、每瓶 加入100ml ems和400粒小麦种子，一个摇床最多处理4000粒小麦种子，折合160g小 麦种子。而采用本发明的种子处理装置，10h内可处理10kg小麦种子，本发明处理小麦 种子的量是传统方法处理量的62.5倍。并且传统方法需要先在实验室中使小麦种子发芽， 然后将幼苗移栽至田间，这一过程不但费时费力，得到的突变群里数量也很少。并且移栽 会降低小麦幼苗的成活率，进一步降低了突变群体的数量，无法得到高通量突变群体。本 发明则通过高通量处理小麦种子，直接进行田间播种，根据试验发现，ems溶液的浓度 为0.7～0.8％(v/v)时，小麦种子的突变机率在20～30％，在每个种植孔播种4粒种子，使 每个种植孔基本上都能得到1株突变幼苗，实现了高通量的突变群体种植。但种植方式会 影响后续小麦的萌发率，不同的种植方式可能会使小麦不萌发。本发明通过试验发现设置 一定规格的种植孔并覆盖等体积比的泥炭土和蛭石，然后覆盖地膜，可以确保小麦种子的 萌发，得到高通量突变群体。
42.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的 实施例详细说明本技术的技术方案。
43.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买 得到。
44.实施例1：济麦38ems突变群体的种植
45.1)ems处理预实验：设计0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2％(v/v) 9个ems(麦克林)梯度，处理济麦38小麦种子，置于人工气候室发芽12天，调查ems 处理种子的萌发成苗率，如图3所示，圆形表示成苗计数植株(有芯叶，生长旺盛)，三 角形表示非成苗植株(发芽，无生长活力)，长方形表示非成苗植株(无芯叶)，统计成 苗植株占总植株的比例，确定济麦38小麦种子萌发成苗率在20％-30％之间的ems浓度。
46.2)种子的处理：用0.8％(v/v)的ems浓度处理济麦38小麦种子。在种子处理装置 中加入50l去离子水、400ml ems和10kg济麦38种子(图4a)，盖上密封盖(图4b)， 启动转动电机，种子处理装置在20℃的条件下，以400r/min转动10h，完成处理。取下 密封盖，将ems废液倒入10％的硫代硫酸钠中进行中和反应，盖上冲洗盖(图4c)，冲 洗盖内置不锈钢网以防止种子在冲水过程中洒落，自来水冲洗4h清除ems残留，取出 种子。
47.3)田间种植：2021年10月29日进行突变群体的田间种植，进行田间打孔得到的种 植孔的直径和深度分别为3cm和5cm。种植孔前后、左右间隔都为20cm。每个种植孔底 部点
突变群体整体出苗率为40％。
75.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人 员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。