一种去势抵抗性前列腺癌核酸适配体及其筛选方法和应用

技术特征：
1.一种去势抵抗性前列腺癌核酸适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列组成包含序列1或序列2中任意一条所示的dna片段。2.根据权利要求1所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的dna序列能选择性连接荧光物质、放射性同位素标记物、磁性纳米微粒、化学药物或生物素-链霉亲和素。3.根据权利要求1所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的dna序列的某一位置进行甲基化、巯基化、氨基化或磷酸化。4.根据权利要求1所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体对去势抵抗性前列腺癌细胞具有良好的靶向亲和性和特异性。5.根据权利要求1所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体能特异性结合去势抵抗性前列腺癌细胞。6.根据权利要求1所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体能特异性识别并结合去势抵抗性前列腺癌组织。7.一种去势抵抗性前列腺癌核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，设计并合成随机单链dna文库及上、下游引物，其序列分别为：随机dna文库:5
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tgcggcagttgaagcaaggc(n40)acggcagcaccagagaacca；上游引物:5
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tgcggcagttgaagcaaggc-3’；下游引物:5
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tggttctctggtgctgccgt-3’；上游引物的5’端用fam标记，下游引物的5’端用生物素标记；dna文库和引物采用固相亚磷酸酰胺合成法，经hplc纯化；步骤2，模板dna提取取2od随机单链dna文库，用1.2ml灭菌双蒸水和0.3ml结合缓冲液binding buffer充分溶解，在95℃变性5min，冰浴10min；分别制备激素依赖性前列腺癌细胞系lncap和去势抵抗性前列腺癌细胞系c4-2的细胞悬液，置于超声破碎仪作用60min，将上述预处理的细胞悬液分别与随机dna文库溶液在37℃振荡孵育2h，经灭菌pbs洗涤后加入等体积酚-氯仿-异戊醇溶剂混匀，离心；移取上方的无机液体再次加入等体积酚-氯仿-异戊醇溶剂混匀，重复此过程2-3次；向所得产物中加入1/10体积的乙酸钠和等体积的异丙醇混匀，置于-20℃冷冻3h，离心，加入-20℃预冷的75％酒精，离心后加入灭菌双蒸水重悬沉淀，充分混匀；步骤3，目的dna提取以步骤2中提取的dna为模板行pcr扩增，向pcr产物中加入1/10体积乙酸钠和等体积的异丙醇混匀，置于-20℃冷冻3h，离心，用-20℃预冷的75％酒精重悬沉淀，离心，用buffer i缓冲液重悬沉淀，置于水浴锅中煮沸10min，然后迅速转移到冰上冰浴30min；移取50μl链霉亲和素磁珠悬液，在磁性分离器上静置1min，弃上清，加入buffer i缓冲液充分振荡重悬，磁性分离，然后与上述经冰浴30min的dna溶液充分振荡重悬、磁性分离，移取上清液加入1/10体积的乙酸钠和等体积的异丙醇混匀，置于-20℃冷冻3h，离心，再次加入-20℃预冷的75％酒精重悬，离心，则白色沉淀即为此一轮筛选得到的单链dna；步骤4，核酸适配体的筛选
以步骤3得到的单链dna作为下一轮筛选的文库和dna模板，重复步骤3的操作，每重复一次为一轮筛选，共进行14轮筛选，最后一轮所得的白色沉淀即为目的dna，即核酸适配体。8.根据权利要求7所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体的筛选方法，其特征在于，结合缓冲液binding buffer的配置方法：分别称取23.83g hepes，43.87g nacl，1.87g kcl，0.83g无水cacl2，1.02g mgcl2·
6h2o，分别用灭菌双蒸水溶解后混合，再用盐酸调ph至7.4，最后灭菌双蒸水定容至1000ml，即得。9.根据权利要求7所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体的筛选方法方法，其特征在于，buffer i缓冲液的配置方法：将tris-hcl、edta溶液及nacl混合，使组分浓度分别达到10mmol/l tris-hcl，1mmol/l edta，1mol/l nacl，最后加入1ml tween-20充分混匀，调整ph至7.4。10.一种权利要求1-6任一项所述的去势抵抗性前列腺癌核酸适配体在检测去势抵抗性前列腺癌组织细胞中的应用。

技术总结
本发明公开了一种去势抵抗性前列腺癌核酸适配体及其筛选方法和应用，该适配体的核苷酸序列组成包含序列1或序列2中任意一条所示的DNA片段；具有分子量小、低免疫原性、高亲和性等优势；此外，本发明核酸适配体采用的筛选技术成本低，可在体外大批量生产，可重复性好，易于运输保存。本发明核酸适配体能以高亲和性高特异性结合去势抵抗性前列腺癌组织细胞。利用本发明核酸适配体能从细胞分子水平早期检测前列腺癌的去势抵抗状态，对于及时调整前列腺癌用药、改善预后具有重要意义。改善预后具有重要意义。改善预后具有重要意义。


技术研发人员：仲津漫 丁健科 杨全新 陈欣
受保护的技术使用者：西安交通大学医学院第二附属医院
技术研发日：2021.04.29
技术公布日：2022/4/15