电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒及其应用

1.本发明属于电化学检测领域，主要涉及一种电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.胆汁酸是一类24碳胆烷酸，以胆固醇为原料、在肝脏中合成。胆汁酸具有重要的生理功能，不仅能促进脂肪的消化、吸收，还可以作为信号分子激活多种受体，介导多种信号调节通路，在人体的葡萄糖、脂肪、自身代谢及能量代谢中发挥重要作用。肝脏疾病时肝细胞受损可引起胆汁酸合成及排泄障碍，胆汁酸的合成明显减少。肝细胞摄取胆汁酸功能障碍，使胆汁酸从血中的清除速率减慢，导致血液和尿液中的胆汁酸含量增高。血清胆汁酸是临床生化常规检测项目，其浓度变化可敏感地反映肝脏功能。研究表明尿液胆汁酸与血清胆汁酸水平有较强的相关性。由于尿液标本无需有创操作即可获得，因此，尿液胆汁酸可以代替血清胆汁酸作为无创、实时监测肝胆疾病的指标。
3.目前，临床主要通过酶循环法测定总胆汁酸，其原理是胆汁酸在3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-hsd)和thio-nad

作用下生成3α-酮类固醇及thio-nadh。新生成的3α-酮类固醇在3α-hsd及nadh的作用下生成胆汁酸及nad

。这样，微量胆汁酸检测信号在多次酶循环过程中被放大，同时使生成的thio-nadh扩增，通过测定thio-nadh的吸光度值变化可求得胆汁酸含量。该方法在临床应用较广泛，但其检测灵敏度在μmol/l级，尚有待提高，且用于检测的专用仪器价格昂贵、体积较大。
4.电化学分析法是根据待测物在溶液中的电化学性质，通过电流、电位和电阻等参数与待测物浓度之间的关系，对待测物实现定性和定量分析。用电化学法测定尿液总胆汁酸具有如下优点：操作简便、可移动性强、检测速度快、试剂盒样品用量少、灵敏度高、选择性好等。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种灵敏度高、使用方便的尿液总胆汁酸检测试剂盒及其应用。
6.本发明的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒的原理为：在丝网印刷碳电极(spce)的工作电极表面加入含有3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-hsd)、氧化型辅酶ⅰ(nad

)和三联吡啶钌(ru(bpy)
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)的磷酸盐缓冲液。再施加一定的氧化恒电位，溶液中的ru(bpy)
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在电极表面被氧化为ru(bpy)
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，待基线稳定后加入待测尿液样本，3α-hsd特异性催化尿液中的胆汁酸生成3α-酮类固醇和nadh。nadh在电极表面失去电子被氧化生成nad

，同时ru(bpy)
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被还原成ru(bpy)
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。一定电位条件下，ru(bpy)
32
在电极表面再次被氧化为ru(bpy)
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，从而产生电化学信号，故能在i-t曲线上对尿液中总胆汁酸含量进行间接电化学定量分析。
7.本发明所述的spce包括一印制电极的聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)基片、pet基片上的外部绝缘膜和基片上的导线接口。其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，分别
为碳工作电极、ag/agcl参比电极和碳对电极。三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下印制的导线与接口相连。所述spce用超纯水冲洗干净，于室温下晾干备用。
8.其中，更优的，所述检测混合液中3α-hsd的活度为1.2ku/l，所述ru(bpy)
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的浓度为7mmol/l，所述nad

的浓度为8mmol/l，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50.0mmol/l，ph值为8.5，所述检测电位为1.20v。
9.其中，所述磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，pbs)由0.1mol/l磷酸氢二钠溶液和0.1mol/l磷酸钠溶液混合而配制。
10.1.本发明所述电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒的具体使用方法如下：
11.1)样品预处理：分别取10μl尿液和990μl超纯水加入1.5ml e
p
管中涡旋混匀，得到一次稀释的尿液样品；再分别取一次稀释的尿液样品10μl和990μl超纯水加入1.5ml e
p
管中涡旋混匀，得到二次稀释的尿液样品；
12.2)分别取8μl 100.0mmol/l nad

，12μl 10.0ku/l 3α-hsd，7μl 100.0mmol/l ru(bpy)
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，23μl超纯水和50μl 100.0mmol/l pbs溶液，ph值为8.5，混合配制成检测液；
13.3)将步骤2)得到的检测液50μl滴加到spce工作区域，所述spce与电化学工作站相连。在恒电位下进行电流-时间(i-t)曲线分析，至基线恒定时加入步骤1)得到的5.0μl待测尿液样品于所述工作电极表面，通过计算i-t曲线中增加的峰电流，从而对待测尿液样品中的总胆汁酸含量进行间接定量测定，恒电位参数设置为1.20v。
14.2.本发明所述电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒有益效果如下：
15.1)本发明所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒，通过使用丝网印刷碳电极配合电化学工作站对尿液总胆汁酸进行定量测定，检测仪器操作简单、价格低廉；
16.2)本发明所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒中所用的丝网印刷电极，制作成本低廉，制作过程简单、快速，可实现批量生产，spce为一次性使用电极，既能避免传统柱电极打磨抛光的时间精力损耗，又能有效避免柱电极重复使用过程中可能造成的实验交叉污染问题；
17.3)本发明所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒，仅需稀释处理即可消除尿液样本的基质干扰，操作简便、快速；
18.4)本发明所述的电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒，响应快速、灵敏度高，具有较好的重复性和准确度，可对尿液中的总胆汁酸进行快速、准确定量；
19.5)本发明所述的电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒能实现尿液中的总胆汁酸含量测定，可以在无创条件下监测患者的尿液胆汁酸水平，辅助临床诊断肝胆疾病。
附图说明
20.图1为本发明所述尿液总胆汁酸电化学法检测原理示意图。
21.图2为本发明中氧化峰电流对尿液总胆汁酸浓度的标准曲线图。
22.图3为本发明电化学检测试剂盒检测尿液总胆汁酸结果与第五代酶循环法检测血清总胆汁酸结果的相关性分析图。
具体实施方式
23.本发明提供了一种电化学法检测尿液总胆汁酸的试剂盒及其使用方法，为使本发
明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
24.本发明电化学工作站仅以chi852c电化学工作站为例，其购于上海辰华仪器有限公司。
25.实施例1：本发明所述丝网印刷碳电极的制备
26.本发明所述丝网印刷碳电极是在pet基板上依次印刷碳浆、ag/agcl浆和绝缘浆。具体包括如下步骤：
27.1)清洗pet基板，晾干后在pet基板上印刷碳浆，制作碳工作电极和碳糊辅助电极，常温干燥；
28.2)在上述pet基板上印刷含有氯化银的银浆，制成ag/agcl参比电极，常温干燥；
29.3)避开圆形工作区域，在上述pet基板上印刷绝缘浆，将导线覆盖住；
30.4)上述工作电极、辅助电极和参比电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下的导线与接口相连，然后于30℃～40℃烘干，保存备用；
31.5)电极使用超纯水冲洗干净，室温下晾干备用。
32.实施例2：本发明所述电化学法检测尿液总胆汁酸试剂盒使用的具体步骤：
33.1)尿液样品预处理：分别取10μl尿液和990μl超纯水加入1.5ml e
p
管中涡旋混匀，得到一次稀释的尿液样品；再分别取一次稀释的尿液样品10μl和990μl超纯水加入1.5ml e
p
管中涡旋混匀，得到二次稀释的尿液样品；
34.2)分别取8μl 100mmol/l nad

，12μl 10ku/l 3α-hsd，7μl 100mmol/l ru(bpy)
32
，23μl超纯水和50μl浓度为100.0mmol/l的pbs溶液，ph值为8.5，加入1.5ml e
p
管中涡旋混匀，得到检测混合液；
35.3)取步骤2得到的混合液50μl滴加在spce的工作区域，所述spce与电化学工作站相连，在1.20v恒电位下进行电流-时间(i-t)曲线分析，至基线恒定时加入步骤1)得到的5μl待测尿液样品于所述工作电极表面，计算i-t曲线中增加的峰电流，其氧化峰电流的增加量与尿液胆汁酸浓度的对数在一定范围内呈线性关系，从而对待测尿液样品中的总胆汁酸进行间接定量测定。
36.实施例3：
37.本实施例考察所述电化学检测试剂盒的氧化峰电流与尿液胆汁酸浓度间的相关性，结果如图2所示。向尿液基质中加入系列浓度(1.0～100.0μmol/l)的胆汁酸标准溶液，经104倍稀释后，在最优的检测条件下进行测定。在1.0～100.0μmol/l浓度范围内，氧化峰电流与胆汁酸浓度的对数呈良好的线性关系，回归方程为：i＝2.3065lgc 8.182，r2＝0.9922。lod为0.2μmol/l(s/n＝3)。
38.实施例4：
39.本实施例是考察本发明所述试剂盒用于测定尿液总胆汁酸的精密度。向尿液基质中加入低、中、高浓度的胆汁酸标准溶液，配制成终浓度分别为5.0μmol/l，40.0μmol/l和80.0μmol/l的工作液。经过104倍稀释后，在最优条件下测定尿液总胆汁酸的浓度。对各浓度工作液分别进行日内重复测定5次，日间连续测定5天，分别计算各浓度的日内和日间相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)，以考察该方法的日内、日间精密度，结果如表1所示。日内标准偏差低于9.2％，日间标准偏差低于9.5％，表明本发明所述电化学
检测试剂盒具有较好的重复性。
40.表1精密度实验
[0041][0042]
实施例5：
[0043]
本实施例是考察本发明所述试剂盒用于测定尿液总胆汁酸的回收率。向尿液基质中加入胆汁酸标准品溶液配制成含低(5.0μmol/l)、中(40.0μmol/l)、高浓度(80.0μmol/l)胆汁酸的工作液，各浓度平行测定5次，进行回收率实验。相对回收率＝(加标后测得尿液中胆汁酸的浓度-加标前测得尿液中胆汁酸浓度)/加入的胆汁酸标准品浓度
×
100.0％，结果见表2。尿液中总胆汁酸的平均回收率在97.2％～101.9％之间，相对标准偏差均≤9.5％，表明本发明所述电化学检测试剂盒具有较好的准确性。
[0044]
表2回收率实验
[0045][0046]
实施例6：
[0047]
本实施例是考察本发明所述电化学检测试剂盒测定尿液总胆汁酸与临床常用的第五代循环酶法测定血清总胆汁酸的相关性。分别用本发明所述试剂盒检测50例受试者的尿液样本与第五代循环酶法测定对应的50例血清样本中总胆汁酸含量，结果见图3。结果表明，本发明所述电化学检测试剂盒测定尿液总胆汁酸结果与现有方法测定血清总胆汁结果具有良好的相关性(r＝0.9800，p＝0.000)，说明本发明所述电化学检测试剂盒能用于尿液中总胆汁酸含量测定。