非洲猪瘟病毒多基因串联DNA疫苗及应用

非洲猪瘟病毒多基因串联dna疫苗及应用
技术领域
1.本发明属于生物疫苗技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒多基因串联dna疫苗及应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟（africa swine fever，asf）是由非洲猪瘟病毒（african swine fever virus, asfv）引起猪发病的一种高度传染性的动物疫病，死亡率几乎为100%。1921年，非洲猪瘟在肯尼亚被首次发现，随后传入欧洲，2007年传入格鲁吉亚，并通过格鲁吉亚传至包括俄罗斯在内的许多东欧国家。2018年，非洲猪瘟传入我国，由于没有疫苗可用，给养猪业和我国经济造成巨大的经济损失，造成了恶劣的政治影响，国家急需安全、有效的疫苗防控疫情。
3.asfv为一种有囊膜的双链dna病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一已知的dna虫媒病毒。其结构复杂，由囊膜、衣壳、内膜、核心壳和基因组五个部分组成，呈二十面体结构。asfv基因组全长为170-190 kb，包含150多个开放阅读框，编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。正是由于asfv基因组庞大及结构复杂，加之感染与免疫机理不清，灭活疫苗不能提供免疫保护，减毒活疫苗存在严重安全隐患，基因工程疫苗保护效果差等诸多原因，导致至今无安全、有效的asf疫苗。
4.我国作为全球养猪第一大国，不仅生产超过全球50%的猪肉，而且也是我国最主要的动物源性肉品，养猪业的健康可持续发展，不仅影响居民生活消费，食品安全，而且直接影响国家经济的发展。针对目前我国asf现状，国家急需安全、有效的疫苗用于防控和净化asf，保障我国养猪业安全、健康可持续发展，保障国家生物安全和食品安全。
5.为了解决asf灭活疫苗无效，减毒活疫苗存在严重免疫副反应，基因工程亚单位疫苗免疫效果差等制约asf疫苗研发的技术瓶颈，本研究利用dna疫苗优势，即以细胞免疫为主，兼具体液免疫全面免疫效果的特性，采用基因操作技术构建了携带asfv主要结构蛋白基因的重组dna，以期研发出安全、有效的asf dna疫苗，为防控asf提供理论依据和技术支撑，保障养猪业健康可续发展。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种非洲猪瘟病毒多基因串联dna疫苗，目的二在于提供一种编码非洲猪瘟病毒多蛋白的串联dna，目的三在于提供一种用于构建非洲猪瘟病毒dna疫苗的重组抗原，目的四在于提供一种包含编码上述重组抗原的核苷酸序列的重组表达载体，目的五在于提供串联dna、重组抗原或重组表达载体在制备针对非洲猪瘟病毒的dna疫苗方面的应用，目的六在于提供上述dna疫苗在制备非洲猪瘟病毒疫苗或药物中的应用。本发明将非洲猪瘟病毒已经验证的免疫保护相关抗原基因p30、p54以及未被验证的a224l进行合理串联，所得重组dna疫苗具有良好的免疫原性，且抗体对asfv具有很好的中和效果。
1载体，在293 t细胞中进行表达，所述的重组dna疫苗含有以下（a）或（b）所示的核苷酸序列：（a）所示的p30、p54串联的dna序列；（b）所示的p30、p54、a224l串联的dna序列；所述的重组dna疫苗，该（a)、（b)还含有一段核酸序列（e）：（e）所示的一个cpg-odn寡核苷酸序列。
17.本发明将非洲猪瘟病毒已经验证的免疫保护相关抗原基因p30、p54以及未被验证的a224l进行合理串联后，插入到pvax-1载体上，构建得到一种非洲猪瘟病毒p30、p54和a224l串联dna疫苗。实验证明，该重组dna疫苗具有良好的免疫原性，在免疫的猪中诱导产生高水平的体液免疫应答以及细胞免疫应答，且抗体对asfv具有很好的中和效果。且同时证明了拟核蛋白a224l具有诱导保护性免疫应答的能力，能够提高该重组dna疫苗的免疫效果。
18.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
19.实施例1 p30、p54、a224l串联重组质粒的制备1、p30、p54和a224l顺序串联重组质粒的设计根据ncbi上asfv ii 型 p30(mk333180.1）、p54(mk333180.1）以及a224l(mk333180.1）的基因序列。在不同的基因之间引入linker序列ggssgg，从而使其形成一个整体。其中，将p30、p54、a224l串联的dna序列如seq id no：01所示，将将p30、p54串联的dna序列如seq id no：02所示。在ncbi上查找pvax-1载体的基因序列（genbank登录号, mq106463.1），根据是否串联a224l基因，将p30、p54基因按顺序串联并连接到载体上命名为pvax-a35；将p30、p54、a224l基因按顺序串联并连接到载体上命名为pvax-a345，核苷酸序列如序列表1所示。其中空载体组作为对照，命名为pvax。
20.、pvax-a35、pvax-a345重组基因阳性质粒的构建及提取在设计时，将p30，p54，a224l的基因序列克隆入载体pvax-1中，基因两端的酶切位点是hind iii和xba i，得到重组质粒pvax-a345；将p30，p54的基因序列克隆入载体pvax-1中，得到重组质粒pvax-a35；pvax-1载体按照genbank（登录号：mq106463.1）上序列进行设计，核苷酸序列如seq id no：03所示。委托金斯瑞生物公司按照上述设计的重组质粒合成pvax-a35, pvax-a345，pvax-1，并进行测序，结果正确。之后将公司合成并已验证过的以上三种质粒的穿刺菌按照同样的方式进行无内毒素质粒提取：吸取100ul穿刺菌加于10ml 的kan 抗性的lb中，于恒温摇床37度、220转速下摇4小时，之后将其全部转入1l的kan 抗性的lb中，恒温摇床37度、220转速下过夜，次日按照天根无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书进行质粒提取。
21.、重组蛋白的表达及鉴定将质粒pvax，pvax-a345和pvax-a35分别转染293t细胞验证重组质粒表达靶标蛋白水平，具体操作如下：将这三种阳性质粒按照lipo3000转染试剂说明书，转染进提前铺好的密度为70%左右的293 t细胞（一个6孔板）中，继续培养48 h后，吸取细胞上清，并加入np40细胞裂解液裂解细胞，收集细胞并进行超声破碎，随后12000 r离心10 min，取上清，进行sds-page和western blotting分析。
22.wb具体操作步骤：
将三种质粒转染后得到的上清分别取80ul加入20ul的5
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蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸5min，进行sds-page，之后转膜，用5%的脱脂奶粉封闭2h，用非洲猪瘟阳性猪血清一抗和抗猪血清二抗进行孵育，验证免疫原性。得到图1，具体步骤如下所示：a)收集好制备后的待测上清，并进行上样处理；b)进行sds-page；c)转膜：取下page胶，放置处理好的pvdf膜上300ma 120min；d)5％bsa4℃过夜封闭；e)一抗室温孵育1h；0.05％pbst洗涤3次10min/次；f)二抗室温孵育1h；0.05％pbst洗涤5次5min/次；g)显色；h)拍照。
23.除了pvax空载体以外，pvax-a345和pvax-a35均能与非洲猪瘟阳性血清反应，说明蛋白具有反应原性（如图1所示）。
24.实施例2 疫苗制备及免疫效力实验：1、疫苗的制备将无内毒素大量提取得到的质粒，用pbs缓冲液重悬使其质粒浓度达到250μg/ml，吸取2 ml，得到重组质粒总含量为500μg的免疫疫苗。
25.、免疫效力试验试验动物及分组选用健康、无asfv感染、6-8周龄雌性猪11头，随机分为3组，包括：pvax-a35组4头，2ml/头；pvax-a345组4头，2ml/头；阴性对照组3头，2ml/头。将制备好的dna疫苗，根据不同分组肌肉注射免疫猪，初次免疫21天后加强免疫1次。
26.抗体检测通过elisa检测首次免疫后，0、14、21、28、35和42天血清中asfv p30、p54、a224l特异性igg的水平。在14、21、28、35和42天的p1(pvax-a345)、p2(pvax-a35)组血清样品中均检测出p30和p54特异性抗体，统计学分析差异不显著（如图2、图3所示），同时在p1(pvax-a345)组血清样品中检测出a224l抗体（如图4所示）。结果证明：重组的pvax-a345和pvax-a35均诱导了有效的体液免疫应答。
27.体外淋巴细胞增殖试验首次免疫35天后分离猪血液淋巴细胞，用灭活asfv体外刺激猪血液淋巴细胞，用cfse淋巴细胞增殖试验检测t淋巴细胞增殖反应。p1(pvax-a345)和p2(pvax-a35)组淋巴细胞的增殖能力均明显高于阴性对照组。p1(pvax-a345)组淋巴细胞增殖能力高于p2(pvax-a35)组（统计学分析差异显著，p《0.05）。结果如图5所示。
28.细胞因子检测流式检测t细胞活化结果。通过对血液中分离的pbmc细胞处理后进行流式检测，发现用灭活病毒刺激后可以使t细胞活化，形成活化的cd4 t细胞与cd8 t细胞；对胞内il-2，tnf-α与ifn-γ细胞因子进行染色后，流式检测结果显示产生的ifn-γ与tnf-α细胞因子含量较多，而il-2细胞因子相较于另两个细胞因子含量低。其中p1(pvax-a345)组产生的细胞因子数要高于p2(pvax-a35)组（统计学分析差异显著），说明a224l基因发挥了促进作用。
ifn-γ，tnf-α与il-2细胞因子的产生，以及t细胞活化成cd4 ，cd8 t细胞进一步说明免疫后机体产生了良好的抗原特异性的细胞免疫，而活化的cd8 t细胞对清除asfv感染具有重要作用。结果如图6所示。
29.血清中和试验中和实验结果。采用病毒基因组提取试剂盒，分别提取各孔asfv基因组，采用asfv qpcr试剂盒进行扩增，根据ct值和建立的标准曲线计算各样品中asfv的拷贝数，计算血清中和病毒的能力。结果发现，当血清稀释度为1：5时，灭活血清可以降低病毒p72基因的拷贝数，即具有中和asfv的能力，其中携带a224l的p1(pvax-a345)可以提供约96.26%的病毒中和率，而p2(pvax-a35)可提供约90.35%的病毒中和率。虽然在检测p1(pvax-a345)组和p2(pvax-a35)组的p30、p54特异性抗体时抗体水平差异不明显，但由于p1(pvax-a345)组产生了a224l特异性抗体，在中和试验中，携带a224l的三基因串联质粒pvax-a345相较于双基因串联质粒pvax-a35免疫后能够产生了更强的中和病毒的能力（统计学分析差异显著，p《0.05），说明a224l基因具有免疫原性，能够提高dna疫苗对asfv的中和效果。结果如图7所示。
30.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。