表达靶向CTLA-4的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物的制作方法

表达靶向ctla-4的shrna/shrna-mir的多能干细胞或其衍生物
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达靶向ctla-4的shrna/shrna-mir的多能干细胞或其衍生物。


背景技术：

2.细胞毒t淋巴细胞相关抗原(4cytotoxic t lymphocyte-associated antigen-4，ctla-4)又名cd152，是由ctla-4基因编码的一种跨膜蛋白质，表达于活化的t细胞，与t细胞表面的协同刺激分子受体(cd28)具有高度的同源性，共同享有b7分子配体(b7-1/cd80，b7-2/cd86)，而ctla-4与b7分子结合后能负下调t细胞的反应活性，参与免疫反应的负向调节，因此是一种免疫共抑制分子。其机制，一是与cd28竞争性的结合b7或者招募磷酸酶到ctla-4的胞内结构域部分从而降解t细胞受体(tcr)和cd28的信号，二是降低cd80/cd86在apc的表达水平或者通过转胞吞作用将它们从apc上移除，这样就减少了cd28参与激活t细胞。此外，ctla-4还会介导树突细胞结合cd80/cd86并诱导色氨酸降解酶ido的表达，从而导致tcr的抑制。伴随外源性抗原或肿瘤特异性靶抗原的刺激，t细胞被激活，ctla-4表达水平上升抑制t细胞的免疫反应。因此阻断ctla-4的免疫效应可刺激t细胞增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。基因重组的ctla-4ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。
3.外泌体是指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。目前已经尝试用外泌体携带sirna、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。
4.此外，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除b2m、ciita等基因，实现hla-i和hla-ii细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸t/b细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型pscs，为更广泛的通用型pscs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达ctla4-ig、pd-l1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除b2m、ciita的同时，敲入cd47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸nk等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向ctla-4的shrna和/或shrna-mir。
6.本发明的第二个目的在于提供一种免疫兼容的多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向ctla-4的shrna和/或shrna-mir。该干细胞或衍生物具有同种异体免疫兼容的能力，免疫兼容的方案包括：将多能干细胞或其衍生物基因组中的b2m和/或ciita基因敲除；或者在多能干细胞或其衍生物的基因组敲入免疫兼容分子的表达序列。
7.本发明的第三个目的在于提供一种免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向ctla-4的shrna和/或shrna-mir。
8.本发明所采取的技术方案是：
9.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有ctla-4阻遏分子的表达序列，所述ctla-4阻遏分子为靶向ctla-4的shrna和/或shrna-mir中的至少一种。
10.本发明研究发现，在多能干细胞或其衍生物中导入靶向ctla-4的shrna/shrna-mir表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌的外泌体中包含高丰度的靶向ctla-4的shrna/shmirna以及加工成熟的sirna，外泌体携带这些效应rna分子与靶细胞结合，然后将其释放，从而阻断ctla-4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。
11.作为优选的：所述靶向ctla-4的shrna和/或shrna-mir的靶序列如seq id no.1～seq id no.10所示。
12.作为本发明的另一个优选方案：所述多能干细胞或其衍生物基因组的b2m基因和/或ciita基因被敲除。
13.作为本发明的另一个优选方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。
14.作为优选的：所述与免疫应答相关的基因包括：
15.(1)主要组织相容性复合体基因，包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-dra、hla-drb1、hla-drb3、hla-drb4、hla-drb5、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dpa1和hla-dpb1中的至少一种；
16.(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括b2m和ciita中的至少一种。
17.作为优选的：所述所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：
18.(1)免疫耐受相关基因，包括cd47和hla-g中的至少一种；
19.(2)hla-c类分子，包括人群中比例合计超过90％的hla-c复等位基因，或者超过90％的hla-c复等位基因与b2m构成的融合蛋白基因；
20.(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shrna和/或shrna-mir，所述主要组织相容性复合体基因包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-dra、hla-drb1、hla-drb3、hla-drb4、hla-drb5、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dpa1和hla-dpb1中的至少一种；
21.(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shrna和/或shrna-mir，所述主要组织相容性复合体相关基因包括b2m和ciita中的至少一种。
22.作为优选的：
23.所述靶向主要组织相容性复合体基因的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.24～seq id no.111中的至少一种；
24.所述靶向主要组织相容性复合体相关基因的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.11～seq id no.23中的至少一种。
25.作为本发明的优选方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shrna和/或mirna加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shrna和/或mirna加工复合体相关基因包括dhrosha、ago1、ago2、dicer1、exportin-5、trbp(tarbp2)、pact(prkra)、dgcr8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为靶向pkr、2-5as、irf-3和irf-7中的至少一种的shrna和/或shrna-mir。
26.作为优选的：所述靶向pkr、2-5as、irf-3或irf-7的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.112～seq id no.171中的至少一种。
27.作为优选的：所述靶向ctla-4、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、pkr、2-5as、irf-3或irf-7的shrna或shrna-mir的表达框架如下：
28.(1)shrna表达框架：由5’到3’依次包括shrna靶序列、茎环序列、shrna靶序列的反向互补序列、poly t；
29.(2)shrna-mir表达框架：使用shrna-mir靶序列替换microrna-30或者microrna-155中的靶序列得到。
30.作为优选的：所述茎环序列长度为3～9个碱基；所述poly t长度为5～6个碱基。
31.上述表达框架可根据需要在5’端加上组成型启动子或诱导型启动子，例如u6启动子、h1启动子，以及配套的启动子调控元件。
32.作为本发明的另一个优选方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子和/或shrna和/或mirna加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达，从而得到一种免疫兼容可逆的表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞或其衍生物。
33.作为优选的：所述诱导型基因表达系统包括tet-off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。
34.作为优选的，所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因，所述外泌体加工合成基因包括steap3、syndevan-4、l-天冬氨酸氧化酶片段、cd63-l7ae和cx43 s368a中的至少一种。
35.在干细胞或其衍生物的基因组中导入外泌体加工合成基因可以提高外泌体的分泌效率，及其对shrna、shmirna和加工成熟的sirna的包裹效率。
36.作为优选的：所述ctla-4阻遏分子的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shrna和/或mirna加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法，所述基因编辑的方法包括基因敲入。
37.作为优选的：所述ctla-4阻遏分子的表达序列、外泌体加工合成基因、免疫兼容分子的表达序列、shrna和/或mirna加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入位点为基因组安全位点。
38.作为优选的：所述基因组安全位点包括aavs1安全位点、egsh安全位点、h11安全位
点中的一种或多种。
39.以上所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；
40.以上所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。
41.以上所述的多能干细胞或其衍生物在制备ctla-4高表达肿瘤治疗药物中的应用。
42.一种制剂，其含有以上所述的多能干细胞或其衍生物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
43.以上所述的多能干细胞或其衍生物分泌得到的包含ctla-4阻遏分子的外泌体。
44.本发明的有益效果是：
45.本发明的方案1：一种表达靶向ctla-4的shrna/shrna-mir的多能干细胞或其衍生物，可应用于自体细胞诱导的ipscs或者是mscs这类低免疫源性细胞。在自体细胞诱导的ipscs基因组中导入靶向ctla-4的shrna/shrna-mir的表达序列后，ipscs能够大量表达靶向ctla-4的shrna/shrna-mir，并被细胞分泌的外泌体包裹。外泌体携带这些效应rna分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断ctla-4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。
46.本发明的方案2：一种免疫兼容的表达靶向ctla-4的shrna/shrna-mir的多能干细胞或其衍生物，可应用于同种异体细胞治疗。由于多能干细胞或其衍生物中的b2m、ciita基因被敲除，或者其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力，使得移植物可以在受体内源源不断地表达靶向ctla-4的shrna/shrna-mir。这些效应rna分子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断ctla-4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。
47.本发明的技术方案3：一种免疫兼容可逆的表达靶向ctla-4的shrna/shrna-mir的多能干细胞或其衍生物。此技术方案中的多能干细胞或其衍生物的基因组中导入了诱导型基因表达系统和免疫兼容分子的表达序列，诱导型基因表达系统可以调控免疫兼容分子的表达，而诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，进一步控制疫兼容分子表达序列的表达量，从而实现多能干细胞或其衍生物免疫兼容的可逆性调控。当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，从而使得进行同种异体细胞治疗时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高供体细胞与受体之间的免疫兼容能力。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达hla
ꢀⅰ
类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，进而受体免疫系统通过识别不匹配的hla
ꢀⅰ
类分子或通过交叉hla
ꢀⅰ
类分子抗原提呈(经典非兼容hla之间的抗原提呈/识别)突变的分子，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。
48.此外，还可以通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间，让供体细胞逐步表达
低浓度的hla分子来刺激受体，使得受体对供体细胞逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。此时，即使供体细胞表面表达不匹配的hla
ꢀⅰ
类分子，也能够被受体免疫系统兼容，这样可以使得在诱导关闭供体细胞中免疫兼容分子的表达后，受体免疫系统一方面能够重新识别供体细胞中hla
ꢀⅰ
类分子提呈的有基因突变的细胞，清除病变细胞；另一方面，未发生突变的部分由于被上述诱导物训练产生同种异体hla
ꢀⅰ
类分子耐受而不会被受体免疫系统清除。由外源诱导物介导的移植物免疫耐受程序还可以在受体彻底耐受后，植入无诱导或其他方式诱导开启或关闭hlaⅰ类分子表面表达的移植物。
附图说明
49.图1，aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒图谱。
50.图2，aavs1 ki vector(shrna,诱导型)质粒图谱。
51.图3，aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒图谱。
52.图4，aavs1 ki vector(shrna-mir,诱导型)质粒图谱。
53.图5，sgrna clone b2m-1质粒图谱。
54.图6，sgrna clone b2m-2质粒图谱。
55.图7，sgrna clone ciita-1质粒图谱。
56.图8，sgrna clone ciita-2质粒图谱。
57.图9，cas9(d10a)质粒图谱。
58.图10，sgrna clone aavs1-1质粒图谱。
59.图11，sgrna clone aavs1-2质粒图谱。
具体实施方式
60.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
61.1实验材料
62.1.1ctla-4阻遏分子
63.ctla-4阻遏分子为靶向ctla-4的shrna或shrna-mir，其靶序列如表1所示。
64.表1靶向ctla-4的shrna或shrna-mir的靶序列
65.no.starttarget sequence(dna)region序列号1267cctgtcttctgcaaagcaatgorfseq id no.12454agttgaccttcctagatgattorfseq id no.23602ggcaacggaacccagatttatorfseq id no.34603gcaacggaacccagatttatgorfseq id no.45493ccagtggaaatcaagtgaaccorfseq id no.56506agtgaacctcactatccaaggorfseq id no.67544cgggactctacatctgcaaggorfseq id no.7
8559gcaaggtggagctcatgtaccorfseq id no.89604gcaacggaacccagatttatgorfseq id no.910609ggaacccagatttatgtaattorfseq id no.10
66.1.2干细胞或其衍生物
67.多能干细胞可选自胚胎干细胞(escs)、诱导多能干细胞(ipscs)以及其他形式的多能干细胞，例如hpscs-mscs、nscs、ebs细胞。其中：
68.ipscs：使用我们所建立的第三代高效安全的episomal-ipscs诱导系统(6f/bm1-4c)，pe3.1-og
--
ks和pe3.1-l-myc
--
hmir302 cluster经电转进入体细胞中，rm1培养2天，含2um parnate的biociso-bm1培养2天，含2um parnate、0.25mm sodium butyrate、3um chir99021和0.5um pd03254901的biociso-bm1培养2天，在用干细胞培养基biociso培养到17天左右即可挑取ipscs克隆，所挑取的ipscs克隆经纯化、消化、传代以获得稳定的ipscs。具体构建方法参见：stem cell res ther.2017nov 2；8(1):245。
69.hpscs-mscs：将ipscs使用干细胞培养基(biociso，含10um tgfβ抑制剂sb431542)培养25天，期间80-90汇合度进行消化传代(2mg/ml dispase消化)，1:3传代到matrigel包被的培养板中，接着esc-msc培养基(knockout dmem培养基，含10％ksr、neaa、双抗、谷氨酰胺、β-巯基乙醇、10ng/ml bfgf和sb-431542)进行培养，每天换液，80-90汇合度进行传代(1:3传代)，连续培养20天即可。具体构建方法参见：proc natl acad sci u s a.2015；112(2):530-535。
70.nscs：将ipscs使用诱导培养基(knockout dmem培养基，含10％ksr，含tgf-β抑制剂，bmp4抑制剂)培养14天，挑取玫瑰花环状的神经细胞到低粘附培养板中进行培养，培养基使用比例为1:1的dmem/f12(含1％n2，invitrogen)和neurobasal培养基(含2％b27，invitrogen)，还含有20ng/ml bfgf和20ng/ml egf，进行培养，消化使用accutase进行消化传代即可。具体构建方法参见：faseb j.2014；28(11):4642-4656。
71.ebs细胞：将汇合度达到95％的ipscs使用bioc-pde1消化6min后使用机械刮传法将细胞刮成块状，沉降降细胞团块，沉降的细胞团块转移到低粘附培养板中使用biociso-eb1培养7天，隔天换液。7天后转移到matrigel包被的培养板中继续使用biociso进行贴壁培养，7天后即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(ebs)。具体构建方法参见：stem cell res ther.2017nov 2；8(1):245。
72.所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织。
73.1.3基因组安全位点
74.本发明技术方案中，基因敲入的基因组安全位点可选自aavs1安全位点、egsh安全位点，或者其它安全位点：
75.(1)aavs1安全位点
76.aavs1位点(别名“ppp1r2c位点”)位于人类基因组第19号染色体上，是一个经过验证、能够确保转入dna片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录，且该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。
77.(2)egsh安全位点
78.egsh安全位点位于人类基因组第1号染色体上，是一个经过论文验证、能够确保转
入dna片段预期功能的另一个“安全港”位点。
79.(3)其它安全位点
80.h11安全位点(也叫hipp11)，位于人的22号染色体，是eif4enif1与drg1这两个基因之间的一个位点，由simon hippenmeyer于2010年发现并命名，由于h11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。h11位点被验证是一个基因间的安全的转录激活区域，是aavs1、egsh位点之外的一个新的“安全港”位点。
81.1.4诱导型基因表达系统
82.本发明技术方案中，诱导型基因表达系统可选自：tet-off系统或者二聚体关闭表达系统：
83.(1)tet-off系统
84.在没有四环素存在时，tta蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tta蛋白的结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。
85.本发明将tet-off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。
86.(2)二聚体关闭表达系统
87.二聚体介导的基因表达调控系统：化学调控靶基因转录的方法有很多种，最常见的是利用影响转录因子活性的别构调节物进行调控。其中的一个方法是运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白fkbp12(fkbp与fk506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为frap【frbp-雷帕霉素相关蛋白，即mtor(哺乳动物的雷帕霉素靶点)】有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将dna结合区域融合到一个或多个fkbp结构域，将转录抑制域融合到frap的93位氨基酸部位，称为frb，这样足以结合fkbp-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与dna结合区域相结合的位点的基因进行转录。
88.1.5免疫兼容分子的选择
89.所述免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中同种异体免疫排斥相关基因的表达。具体免疫兼容分子的种类及序列如表2所示：
90.表2免疫兼容分子
91.[0092][0093]
以上shrna或shrna-mir免疫兼容分子的靶序列如表3所示：
[0094]
表3 shrna或shrna-mir的靶序列
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
number:nm_001195573)、exportin-5(accession number:nm_020750)、trbp(accession number:nm_134323)、pact(accession number:nm_003690)和dgcr8(accession number:nm_022720)，以便细胞不占用其他mirna的加工，影响细胞功能。
[0105]
此外，在ifn诱生的过程中，双链rna所依赖的蛋白激酶(double-stranded rna-dependent protein kinase,pkr)，它是整个细胞信号转导通路的关键因子，同时还有2’,5’寡腺苷酸合成酶(2,5-oligoadenylate synthetase,2-5as)，这两种酶与dsrna诱生ifn密切相关。pkr能通过磷酸化真核细胞转录因子，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于g0/g1和g2/m期，并诱导凋亡，而dsrna可以促进2-5as合成，结果导致rnase即rnasel的非特异性活化，降解细胞内所有的mrna，致细胞死亡。i型干扰素的诱导特异性是通过irf转录因子家族成员实现的，在细胞缺乏irf-3和irf-7的表达下，在很多病毒感染情况下i型干扰素是不能被诱导分泌的。缺乏ifn的应答，要使其恢复，需要上述两种蛋白质的共表达才行。
[0106]
本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点处敲入免疫兼容分子shrna-mir表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的针对抑制pkr、2-5as、irf-3和irf-7基因的shrna和/或shrna-mir表达序列，降低dsrna诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。
[0107]
shrna/mirna加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、免疫兼容分子在基因组安全位点的插入位置顺序没有限定，它们之间可以以任何次序排列，而不会相互干扰或者影响基因组其它基因的结构和功能。
[0108]
具体的抗干扰素效应分子的靶序列如表4所示。
[0109]
表4抗干扰素效应分子的靶序列
[0110]
[0111]
[0112][0113]
下面表6-表7的抗干扰素效应分子敲入方案中，各实验组别的shrna或shrna-mir序列均为采用表4中的靶序列1构建得到的shrna或shrna-mir免疫兼容分子。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的shrna或shrna-mir免疫兼容分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。
[0114]
1.7免疫兼容分子、抗干扰素效应分子shrna或shrna-mir的通用框架
[0115]
免疫兼容分子、抗干扰素效应分子shrna或shrna-mir的通用框架序列如下所示：
[0116]
(1)shrna组成型表达框架为：
[0117]
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgctagcgccacc(seq id no.172)n1...n
21
ttcaagaga(seq id no.173)n
22
...n
42
tttttt
[0118]
其中：
[0119]
a、n1...n
21
为对应基因的shrna靶序列，n
22
...n
42
为对应基因的shrna靶序列的反向互补序列；
[0120]
b、如果质粒需要表达多个基因的shrna，则每个基因分对应一个shrna表达框架，然后无缝连接起来；
[0121]
c、带不同抗性基因的组成型shrna质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；
[0122]
d、n表示a、t、g、c碱基；
[0123]
e、seq id no.172为u6启动子序列；
[0124]
f、seq id no.173为茎环序列。
[0125]
(2)shrna诱导型表达框架为：
[0126]
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggactttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtc
id no.181)，aavs1-hr-r(seq id no.182)，然后回收产物。
[0151]
c.其它质粒元件的获取：设计引物，直接对含该质粒元件的质粒进行亚克隆，然后回收产物。
[0152]
d.质粒组装：把前面步骤获取的各种产物通过overlap pcr或者使用重组酶(南京诺唯赞生物，c113-01)通过重组的方法连接起来组成一个环状质粒。各分组的抗体、免疫兼容分子插入ki质粒的操作参加实验方案部分。
[0153]
下面表6和表7各实验方案组阻遏分子、免疫兼容分子、抗干扰素效应分子、基因序列插入ki质粒的操作原则如下：
[0154]
靶向ctla-4的shrna放入对应质粒的shrna表达框架2(组成型)、靶向ctla-4的shrna-mir放入对应质粒的shrna-mir表达框架2(组成型)，免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shrna放入对应质粒的shrna表达框架1内，shrna-mir放入对应质粒的shrnamir表达框架1内，其它基因放入对应质粒的mc的位置。
[0155]
注：sgrna clone b2m质粒包含sgrna clone b2m-1和sgrna clone b2m-2质粒。sgrna clone ciita质粒包含sgrna clone ciita-1和sgrna clone ciita-2质粒。
[0156]
各表达质粒如图1-图11所示。
[0157]
2.1.2肿瘤治疗细胞的构建
[0158]
(一)sgrna构建
[0159]
1、质粒
[0160]
外源基因的敲入采用cas9(d10a)质粒和sgrna质粒系统。cas9(d10a)质粒图谱如图3所示，aavs1安全位点的sgrna质粒图谱如图4、图5所示，egsh安全位点的sgrna质粒图谱如图6、图7所示。
[0161]
2、同源臂
[0162]
(1)、aavs1同源臂aavs1-hr-l和aavs1-hr-r的核苷酸序列分别如seq id no.181和seq id no.182所示。
[0163]
(2)、egsh同源臂egsh-hr-l和egsh-hr-r的核苷酸序列分别如seq id no.183和seq id no.184所示。
[0164]
3、sgrna序列
[0165]
sgrna-aavs1-1：5
’-
tataaggtggtcccagctcgggg-3’(seq id no.185)；
[0166]
sgrna-aavs1-2：5
’-
agggccggttaatgtggctctgg-3’(seq id no.186)。sgrna-egsh-1：5
’-
ggtggaagcttcattccagatgg-3’(seq id no.187)；
[0167]
sgrna-egsh-2：5
’-
gacctgcctcattaaatatcagg-3’(seq id no.188)。
[0168]
4、质粒构建方法
[0169]
(1)使用限制性内切酶bbsi酶切sgrna空载体，然后回收。
[0170]
(2)合成sgrna引物(含载体黏性末端)。
[0171]
(3)引物加水稀释成10um，配反应体系于沸水煮5min，后冷却至室温，获得退火产物。
[0172]
反应体系：上游引物：2ul，下游引物：2ul，水：12.8ul
[0173]
(4)使用dna连接反应试剂盒(takara，6022)把前面步骤载体和退火产物连接起来，获得包含基因靶序列的sgrna质粒。
[0174]
(二)基因编辑过程
[0175]
1.aavs1基因敲入的单细胞克隆操作步骤(1)电转程序：
[0176]
供体细胞准备：人多能干细胞
[0177]
试剂盒：human stem cellkit 1
[0178]
仪器：电转仪
[0179]
培养基：biociso
[0180]
诱导质粒：cas9d10a、sgrna clone aavs1-1、sgrna clone aavs1-2、aavs1 neo vectoⅰ、aavs1 neo vectorⅱ[0181]
注：egsh基因敲入使用的诱导质粒：cas9d10a、sgrna clone egsh-1、sgrna clone egsh-2、egsh-neo/egsh-puro(donor)这里的donor质粒与aavs1的比较，只有左右重组臂不一样，其它元件都一样。由于egsh的基因编辑过程与aavs1的相同，后面就不再重复列举。
[0182]
(2)电转后的人多能干细胞进行含g418和puro的双抗生素培养基进行筛选
[0183]
(3)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。
[0184]
2.aavs1基因敲入的单细胞克隆株培养试剂
[0185]
(1)培养基：biociso 300μg/ml g418 0.5μg/ml puro
[0186]
(应提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温。注意：不应将biociso置于37℃进行预热，避免生物分子活性降低。)
[0187]
(2)基质胶：hesc级matrigel
[0188]
(传代或复苏细胞前，将matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100x matrigel不能低于0.5小时；1:200x matrigel不能低于2小时。)
[0189]
(3)消化液：使用dpbs溶解edta至终浓度为0.5mm，ph7.4
[0190]
(注意：edta不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。)
[0191]
(4)冻存液：60％biociso 30％escs级fbs 10％dmso
[0192]
(冻存液最好现配现用。)
[0193]
3.常规维持传代培养过程
[0194]
(1)传代的最佳时刻以及传代比例
[0195]
a.传代最佳时刻：细胞整体汇合度达80％～90％。
[0196]
b.传代最佳比例：1:4～1:7传代，次日最佳汇合度应维持在20％～30％。
[0197]
(2)传代过程
[0198]
a.事先将包被好的细胞培养瓶皿中的matrigel吸走弃掉，加入适量培养基(biociso 300μg/ml g418 0.5μg/ml puro)，并放入37℃、5％co2培养箱中孵育；
[0199]
b.待细胞符合传代的要求，吸掉培养基上清，加入适量的0.5mm edta消化液到细胞瓶皿中；
[0200]
c.将细胞放入37℃、5％co2培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可，轻柔吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；
[0201]
d.离心后，弃上清，用培养基重悬细胞，轻柔反复吹打细胞数次至混匀，然后将细
胞转移至事先准备好包被matrigel的瓶皿中；
[0202]
e.细胞转移至细胞瓶皿后，前后左右水平摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％co2培养箱中进行培养；
[0203]
f.次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基每天正常按时换液。
[0204]
4.细胞冻存
[0205]
(1)按照常规传代的操作步骤，使用0.5mm edta消化细胞至大部分细胞收缩变圆但尚未漂浮，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5ml/支)；
[0206]
(2)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降1℃)；
[0207]
(3)次日立即将细胞转移入液氮。
[0208]
5.细胞复苏
[0209]
(1)提前准备好matrigel包被的细胞瓶皿，复苏细胞前，吸掉matrigel，向细胞瓶皿中加入适量的biociso，置于37℃、5％co2培养箱中孵育；
[0210]
(2)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃，使细胞快速融解，仔细观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；
[0211]
(3)提前加入10ml dmem/f12(1:1)基础培养基至15ml离心管，并平衡至室温，使用巴氏吸管吸取1ml dmem/f12(1:1)缓慢加入冻存管中，轻柔混匀，将细胞悬液转移到准备好的含有dmem/f12(1:1)的15ml离心管中，200g离心5分钟；
[0212]
(4)小心弃掉上清，加入适量biociso，轻轻混匀细胞，种到提前准备好的细胞瓶皿中，水平前后左右摇匀后，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％co2培养箱中培养；
[0213]
(5)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则biociso更换为biociso 300μg/ml g418 0.5μg/ml puro。
[0214]
(三)aavs1基因敲入检测方法
[0215]
1.单细胞克隆aavs1基因敲入检测
[0216]
(1)aavs1基因敲入检测说明
[0217]
a.试验目的：pcr检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子；
[0218]
b.试验方法:首先在donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组ppp1r12c(非重组臂部分)设计另一条引物。如果donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现)；
[0219]
c.试验方案引物序列及pcr方案如表5所示：
[0220]
表5试验方案引物序列及pcr方案
[0221][0222][0223]
注：egsh基因敲入的检测方法跟aavs1基因敲入检测原理和方法一样，这里不再描述。
[0224]
2.2检测方法
[0225]
2.2.1表达ctla-4阻遏分子及外泌体的多能干细胞或其衍生物的检测方法
[0226]
利用外泌体提取试剂盒(bestbio，lot#bb-3901)提取培养表达被外泌体包裹的ctla-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物后的培养上清中的外泌体。培养上清4℃条件下3000g离心15min，收集上清后在4℃条件下10000g离心20min，收集上清，按4:1比例加入提取液a，上下颠倒1min，4℃过夜。4℃条件下10000g离心60min，收集外泌体沉淀即可。
[0227]
再利用流式细胞计量测定法对多能干细胞表达的ctla-4阻遏分子的阻断效果进行测试。在cho细胞的培养基中添加含ctla-4阻遏分子的外泌体，并对外源表达ctla-4的cho细胞进行培养72h。消化成单个细胞并用pbs洗涤细胞2次后，将fitc标记的ctla-4抗体融合蛋白加入到试管中，37℃温育30分钟。使用流式细胞仪进行流式细胞计量分析。根据染色的平均荧光强度(mfi)，即可测量出多能干细胞表达的ctla-4阻遏分子抑制cho细胞表达ctla-4的效果。
[0228]
2.2.2 51
cr释放法检测ctla-4阻遏分子对t细胞杀伤肿瘤的影响
[0229]
1)效应细胞的准备：
[0230]
t细胞分离：使用ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)，再使用dynabeads
tm cd3(invitrogen
tm
，货号：11151d)试剂盒分离出t细胞。将细胞
重悬在含10％fbs的rpmi1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1
×
107细胞/ml。
[0231]
2)靶细胞的准备
[0232]
肿瘤(rcc肾癌)细胞，将其消化重悬，通过台盼蓝染色计数细胞，配成1
×
107细胞/ml的细胞悬液。
[0233]
3)
51
cr释放试验
[0234]
t细胞先用表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞的培养基上清培育48h，再与肿瘤细胞接触时，t就会攻击肿瘤细胞造成细胞裂解死亡。而未经表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞的培养基上清培育的会发生肿瘤细胞不被t细胞所识别，会发生免疫逃逸。所以通过检测培养基中
51
cr的量，即可反应出t细胞杀伤肿瘤的能力。
51
cr的释放到培养液中的量越少，肿瘤细胞越容易发生免疫逃逸。
[0235]
定量检测细胞介导的细胞毒作用，以放射性同位素
51
cr标记靶细胞，与效应分子或细胞共孵育，根据靶细胞裂解所释放的
51
cr放射脉冲数(cpm)而判断细胞毒活性。
[0236]
a.将靶细胞用100μci(ci,放射性活度单位)的na
51
cro4在37℃标记120min，每15分钟震摇一次，标记后再用清洗液离心清洗5次，最后重悬于培养液中，配成1
×
106细胞/ml备用。
[0237]
b.将靶细胞及t细胞加入96孔培养板中，每孔加100μl靶细胞(2.5
×
103个)及100μl效应细胞(e/t＝1:2、1:5、1:10，e/t为靶细胞与效应细胞t的比)，同时设立自然释放对照孔(100μl靶细胞 100ul培养基)和最大释放孔(100μl靶细胞 100ul 2％sds)。放置37℃，5％co2培养孵育4h。取出后用移液器吸出各孔上清液后，离心取上清液100μl，用γ计数仪测量cpm值。
[0238]
注：一般要求
51
cr自然释放率《10％
[0239]
c.结果计算：根据公式计算
51
cr自然释放率和t细胞的活性：
[0240][0241][0242]
2.2.3小鼠肿瘤治疗方法
[0243]
在人源化nsg小鼠(the jackson laboratory(jax))中，对其右腋下皮下注射5
×
106肿瘤细胞(rcc肾癌，mc结肠癌，hcc肝癌)细胞，待肿瘤长到60mm3大小时，进行尾静脉注射200ulpbs(含人免疫细胞和1
×
106的表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞衍生物)进行肿瘤治疗，其中只注射含人免疫细胞的组作为对照组。20天后处死小鼠，然后比较各组之间肿瘤大小，并进行差异性统计分析。
[0244]
3实验方案
[0245]
首先，将表达ctla-4阻遏分子(shrna、shrna-mir)，以及外泌体加工合成相关基因、抗干扰素效应分子、shrna和shrna-mir加工复合体相关基因的表达序列敲入基因组安全位点(safe harbour)以实现多能干细胞衍生物表达外泌体组成元件及被外泌体包裹的ctla-4阻遏分子。从而使多能干细胞或其衍生物能在肿瘤治疗上进行应用。接着，我们还可
以通过基因编辑技术对其进行改造，改造成组成型免疫兼容的通用型多能干细胞或其衍生物和免疫兼容可逆的通用型多能干细胞或其衍生物，进而能在同种异体中进行肿瘤治疗。
[0246]
在进行免疫兼容改造的时候，可以先在hpscs上进行进行改造，改造完成后再分化成多能干细胞的衍生物进行运用；也可以在hpscs分化成多能干细胞的衍生物后再进行免疫兼容改造。
[0247]
各实验组的方案如表6和表7所示，“ ”号表示基因或核酸序列的敲入，
“-”
号表示基因敲除。
[0248]
各实验组的表达质粒的构建总体原则为：靶向ctla-4的shrna放入对应质粒的shrna表达框架2(组成型)、靶向ctla-4的shrna-mir放入对应质粒的shrna-mir表达框架2(组成型)，免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shrna放入对应质粒的shrna表达框架1内，shrna-mir放入对应质粒的shrnamir表达框架1内，其它基因放入对应质粒的mc的位置。
[0249]
注：sgrna clone b2m质粒包含sgrna clone b2m-1和sgrna clone b2m-2质粒。sgrna clone ciita质粒包含sgrna clone ciita-1和sgrna clone ciita-2质粒。
[0250]
各表达质粒如图1-图11所示。
[0251]
表6组成型表达实验方案
[0252]
[0253]
[0254][0255]
(1)aa1分组：
[0256]
aavs1 ki vector(shrna，组成型)质粒的shrna表达框架2放入ctla-4的shrna靶序列，shrna表达框架1放入其他分子的shrna靶序列(若存在多个shrna则无缝连接起来)，mcs放入基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt，seq id no.197)连接起来，下同)。
[0257]
(2)aa2分组：
[0258]
aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒的shrna表达框架2放入ctla-4的shrna靶序列，shrna表达框架1放入其他分子的shrna靶序列(若存在多个shrna则无缝连接起来)，mcs放入基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。
[0259]
aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒的shrna-mir表达框架1放入其他分子的shrna-mir靶序列(若存在多个shrna-mir则无缝连接起来)。
[0260]
(3)aa3分组：
[0261]
aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒的shrna表达框架2放入ctla-4的shrna靶序列，shrna表达框架1放入其他分子的shrna靶序列(若存在多个shrna则无缝连接起来)，mcs放入基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。
[0262]
sgrna clone b2m质粒的靶序列放入b2m的sgrna靶序列(seq id no.198和seq id no.199)；
[0263]
sgrna clone ciita质粒的靶序列放入ciita的sgrna靶序列(seq id no.200和seq id no.201。
[0264]
(4)aa4分组：
[0265]
(同aa1分组的方法)
[0266]
(5)aa5分组：
[0267]
(同aa2分组的方法)
[0268]
(6)ab1分组：
[0269]
aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入ctla-4的shrna-mir的靶序列，shrna-mir表达框架1放入其他分子的shrna-mir靶序列(若存在多个shrna-mir则无缝连接起来)，mcs放入基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。
[0270]
aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒的shrna表达框架1放入其他分子的shrna靶序列(若存在多个shrna则无缝连接起来)。
[0271]
(7)ab2分组：
[0272]
aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入ctla-4的shrna-mir靶序列，shrna-mir表达框架1放入其他分子的shrna-mir靶序列(若存在多个shrna-mir则无缝连接起来)，mcs放入基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。
[0273]
(8)ab3分组：
[0274]
aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入ctla-4的shrna-mir靶序列，shrna-mir表达框架1放入其他分子的shrna-mir靶序列(若存在多个shrna-mir则无缝连接起来)，mcs放入基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。
[0275]
sgrna clone b2m质粒的靶序列放入b2m的sgrna靶序列，
[0276]
sgrna clone ciita质粒的靶序列放入ciita的sgrna靶序列。
[0277]
(9)ab4分组：
[0278]
(同ab1分组的方法)
[0279]
(10)ab5分组：
[0280]
(同ab2分组的方法)
[0281]
(11)ac1分组：
[0282]
aavs1 ki vector(shrna，组成型)质粒的shrna表达框架2放入ctla-4的shrna靶序列。
[0283]
(12)ac2分组：
[0284]
aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入ctla-4的shrna-mir靶序列。
[0285]
表7诱导型表达(免疫兼容可逆)实验方案
[0286]
mir则无缝连接起来)，mcs放入基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。
[0295]
aavs1 ki vector(shrna,诱导型)质粒的shrna表达框架1放入其他分子的shrna靶序列(若存在多个shrna则无缝连接起来)。
[0296]
(16)bb2分组：
[0297]
(同bb1分组的方法)
[0298]
4实验结果
[0299]
实施例1表达包含ctla-4阻遏分子外泌体的多能干细胞或其衍生物的检测方法
[0300]
将表6和表7各实验组方案敲入ipscs、mscs、nscs、ebs细胞的基因组安全位点aavs1，37℃，0.5％co2培养箱培养，收集培养基上清，利用外泌体提取试剂盒(bestbio，lot#bb-3901)提取培养表达被外泌体包裹的ctla-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物后的培养上清中的外泌体。培养上清4℃条件下3000g离心15min，收集上清后在4℃条件下10000g离心20min，收集上清，按4:1比例加入提取液a，上下颠倒1min，4℃过夜。4℃条件下10000g离心60min，收集外泌体沉淀即可。
[0301]
再利用流式细胞计量测定法对多能干细胞表达的ctla-4阻遏分子的阻断效果进行测试。在cho细胞的培养基中添加含ctla-4阻遏分子的外泌体，并对外源表达ctla-4的cho细胞进行培养72h。消化成单个细胞并用pbs洗涤细胞2次后，将fitc标记的ctla-4抗体融合蛋白加入到试管中，37℃温育30分钟。使用流式细胞仪进行流式细胞计量分析。根据染色的平均荧光强度(mfi)，即可测量出多能干细胞表达的ctla-4阻遏分子抑制cho细胞表达ctla-4的效果。
[0302]
n(对照)组是指没有添加含ctla-4阻遏分子的外泌体进行培养的表达ctla-4的cho细胞。
[0303]
表8各实验组表达的ctla-4阻遏分子对ctla-4抑制效果
[0304][0305]
从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的ctla-4阻遏分子能有效抑制靶细胞的ctla-4蛋白的表达，从而达到阻断ctla-4效果。
[0306]
实施例2表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果
[0307]
将表6-表7各实验组方案敲入ipscs、mscs、nscs、ebs细胞的基因组安全位点aavs1，得到表达ctla-4阻遏分子细胞，使用
51
cr释放试验检验其抗肿瘤效果。
[0308]
n(对照)组是指未用表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞的培养基上清处理的t细胞。
[0309]
表9各实验组表达的ctla-4阻遏分子对t细胞杀伤肿瘤细胞的影响
[0310]
[0311][0312]
通过以上实验，可以证明本发明制备的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的ctla-4能够有效抑制ctla-4而起到抗肿瘤作用。
[0313]
实施例3ctla-4阻遏分子在多种肿瘤治疗中进行应用
[0314]
我们选择b2m和ciita基因敲除方案组(aa3、ab3、ac3、ad3)的免疫兼容细胞(hpscs、mscs、nscs、ebs)中进行测试。
[0315]
在人源化nsg小鼠肿瘤模型中，我们对其进行注射各组实验细胞，观察其对rcc肾癌，mc结肠癌，hcc肝癌的治疗的效果。为避免免疫兼容问题，我们所使用的免疫细胞与hpscs及hpscs源衍生物均来源于同一人的。
[0316]
n(对照)组是指未注射实验细胞的nsg小鼠肿瘤模型。独立样本t检验(*p《0.01)。
[0317]
表10表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果
[0318][0319]
通过以上实验，可以证明本发明制备的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的ctla-4能够有效抑制ctla-4而起到抗肿瘤作用。
[0320]
实施例4免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试
[0321]
通过上述实施例，表达ctla-4阻遏分子的hpscs及hpscs源衍生物能有效抑制
ctla-4而起到抗肿瘤作用。我们还必须考虑hpscs及hpscs源衍生物的免疫兼容问题。因此我们选取一个合适的组合对免疫兼容进行测试。
[0322]
我们利用mscs的低免疫源性的特点，在人源化nsg小鼠肿瘤模型中，对其进行注射能够表达ctla-4阻遏分子(靶向ctla-4的shrna)的hpscs源免疫兼容mscs，观察其肿瘤(rcc肾癌)治疗的效果。注:所使用的免疫细胞与hpscs源mscs来源于为非同一人。
[0323]
对照组是指未注射表达阻遏分子的组成型免疫兼容mscs的nsg小鼠肿瘤模型。
[0324]
加dox组别的处理是：在小鼠饮食中添加0.5mg/ml的dox，进行饲养小鼠，从注射表达阻遏分子细胞开始，一直使用，直到试验结束。
[0325]
表11免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果
[0326][0327]
以上实验表明：仅表达阻遏分子的mscs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在一定时间，所以其能够发挥一定的肿瘤治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-9，包括组成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的mscs在体内存在时间更长，其发挥肿瘤治疗效果更佳，而组5为b2m和ciita基因敲除组，其完全消除hla-i和hla-ii类分子产生的影响，因此其肿瘤治疗效果最佳。但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清除，从而有组8-11方案设定。组10-11中在进行注射表达阻遏分子细胞进入小鼠的同时，对小鼠使用dox诱导剂(一直使用)，注射表达阻遏分子细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其在体内存在时间与未经免疫兼容改造的mscs相当，其肿瘤治疗效果也与未经免疫兼容改造的mscs相当。