一种利用非激素类化合物制备ZZ基因型中华鳖伪雌个体的方法

一种利用非激素类化合物制备zz基因型中华鳖伪雌个体的方法
技术领域
1.本发明涉及水产品养殖技术领域，尤其涉及一种利用非激素类化合物制备zz基因型中华鳖伪雌个体的方法。


背景技术：

2.中华鳖是我国南方名优水产养殖品种之一，其在养殖过程中，存在典型的雌、雄两性异性。研究证实，中华鳖的性别决定方式为遗传型性别决定，属于zz/zw性别决定类别，即雌鳖为zw染色体，雄鳖为zz染色体。生产中雄鳖生长速度快，裙边宽厚，经济价值要高于雌性。研究证实，在胚胎发育过程中，也即性别决定的关键时期，中华鳖的性别受到外部激素的调控，因此中华鳖的人工控制性别育种技术备受关注。如果可以对中华鳖进行性别控制，将zz中华鳖雌性化，在zz伪雌鳖发育成熟后，就可以和正常的zz雄鳖进行交配，为培育zz全雄中华鳖提供新的途径。
3.现有技术一般采用性类固醇激素诱导的方法对中华鳖进行性别控制，如专利号为cn102487883a，专利名称为一种中华鳖性别控制方法的专利通过施加甲基睾丸素来提高中华鳖的雄性比例；专利号为cn102988986a，专利名称为一种中华鳖胚胎期雄性性别诱导剂及诱导方法的专利通过喷洒自睾酮，甲睾酮或丙酸睾酮的方法来进行雄性诱导。但是经过研究发现，现有的中华鳖性别控制技术中存在明显缺陷：用性类固醇激素多次处理胚胎，工作繁琐，且性别不能完全逆转；且所用的性类固醇激素浓度高、用量大，会对环境产生潜在的污染。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的问题是如何开发一种绿色生态、性别控制效果好、环境污染小、可操作性强的zz伪雌鳖诱导方法。
5.为达到上述目的，本发明提供了一种利用非激素类化合物制备zz基因型中华鳖伪雌个体的方法，包括以下步骤：
6.s1、收集中华鳖胚胎，挑选良好的受精的胚胎，将挑选的胚胎放置在经过消毒的黄沙中，孵化至第15.5期时，用微量注射器向胚胎注射3-5μl 诱导剂，诱导剂的有效成分为特异性激动剂1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基
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1h-吡唑；
7.s2、注射诱导剂后，按照与步骤s1相同的孵化条件孵化至稚鳖出壳；
8.s3、在胚胎发育至27期时，收集性腺，进行组织学分析，鉴定中华鳖为生理性雌性或雄性，统计性别比例；
9.s4、对中华鳖的zz或zw基因型进行鉴定，分析zz伪雌鳖的数量及比例。
10.相对于现有技术，本发明采用独特的诱导剂对胚胎期的中华鳖进行雌性诱导，避免了现有技术中长时间、多次、大剂量地使用性类固醇激素造成的性腺发育不正常或诱导效果不彻底；本发明所提供的诱导方法在中华鳖的胚胎发育过程中性别决定的关键时间段
内，仅需要通过一次低剂量诱导剂注射，即能够实现雌性诱导率100％以上，同时，保证了中华鳖正常的性腺发育及低药物残留；本发明操作简单，效果显著，产生的zz伪雌鳖发育成熟后，可以和正常的zz雄鳖进行交配，为培育zz全雄中华鳖提供新的途径；且该诱导方法对环境的污染小，属于绿色的人工诱导方法。
11.可选地，所述步骤s1中，诱导剂的制备方法为将特异性激动剂溶于9 2-98％的酒精溶剂或二甲基亚砜(dmso)中，诱导剂的特异性激动剂浓度为2μg/μl。诱导剂浓度由试验确定，其注射量可以根据蛋的重量进行调整，对于重量较小的蛋注射较少的诱导剂，对于重量较大的蛋则注射较多的诱导剂，由此既保证了诱导率，又保证了中华鳖正常的性腺发育及无药物残留。
12.可选地，所述步骤s1中，诱导剂的制备方法具体包括以步骤，取20 μl体积的浓度为100mg/ml的dmso诱导剂母液加到400μl的peg30 0中，混合均匀后加入50μl tween-80，混合均匀，继续加入530μl生理盐水定容至1ml得到诱导剂，诱导剂中dmso的含量为2％。
13.可选地，所述步骤s1包括通过手电筒照射确定胚胎气室的位置，使气室朝上，用医用酒精消毒后，在气室上方的卵壳上用不锈钢注射器针头刺破卵壳，用微量注射器向胚胎的气室中注射诱导剂，之后用组织胶水粘合注射位置，并使气室的位置朝上，摆放于黄沙中继续孵化。由此通过注射的方式将诱导剂作用于胚胎，使诱导剂更接近胚胎个体，保证诱导效果，提高雌性诱导率，且可以减少注射量，降低生产成本，诱导剂注射后，用组织胶水粘合注射位置并使气室的位置朝上，可以避免诱导剂流失，保证雌性诱导率。
14.可选地，所述步骤s1中，孵化条件为温度25-33℃，空气相对湿度70％
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90％。由此中华鳖胚胎在适宜的环境孵化，利于胚胎发育。
15.可选地，所述步骤s3中，采用组织学切片h&e染色法进行生理性性别鉴定，采用雌性相关基因foxl2、雄性相关基因sox9的免疫荧光染色法进行生理性性别鉴定。由此通过性腺组织学染色进行生理性性别鉴定，操作方便，检测结果可视化。
16.可选地，所述步骤s4中，采用pcr法鉴定基因型。由此pcr鉴定技术进行基因检测，检测结果准确，证实了本发明能够彻底将zz中华鳖雌性化。
17.可选地，所述步骤s4中，所用上游引物的序列为5
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gatcgaattac atcctgcct-3’，下游引物的序列为5
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taaattaggactggaagacacc
‑ꢀ3’
。
附图说明
18.图1是本发明实施例一中中华鳖性腺切片组织学h&e染色图片；
19.图2是本发明实施例一中中华鳖性腺切片foxl2和sox9免疫组织化学染色示意图；
20.图3是本发明实施例一中中华鳖性别逆转比率统计图。
具体实施方式
21.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
22.本发明实施例中的孵化期参照中华鳖胚胎发育分期标准。
23.实施例一
24.本实施例为利用非激素类化合物制备zz基因型中华鳖伪雌个体的方法，由特异性
激动剂1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1h-吡唑进行诱导，化学式为c
24h22
n2o3，cas号：263717-53-9，具有绿色生态、性别逆转率高、环境污染小且可操作性强的特点。具体步骤包括：
25.s1、将特异性激动剂溶于98％酒精溶剂中，混合均匀得到特异性激动剂浓度为2μg/μl的诱导剂，特异性激动剂为1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1h-吡唑。收集中华鳖胚胎，挑选良好的受精的胚胎，将挑选的胚胎放置在经过消毒的黄沙中，孵化条件为温度25-33℃，空气相对湿度70％-90％。孵化至第15.5期时，通过手电筒照射确定胚胎气室的位置，使气室朝上，用医用酒精消毒后，在气室上方的卵壳上用不锈钢注射器针头刺破卵壳，用微量注射器向胚胎的气室中注射5μl诱导剂，之后用组织胶水(3m；pn: 1469sb)粘合注射位置，并使气室的位置朝上，摆放于黄沙中继续孵化。
26.s2、注射诱导剂后，按照与步骤s1相同的孵化条件进行孵化，至稚鳖出壳。
27.s3、在胚胎发育至27期时，收集性腺，进行组织学分析，鉴定中华鳖生理性为雌性或雄性，统计性别比例。
28.采用组织学切片h&e染色法进行生理性性别鉴定，结果如图1所示，图中gc表示生殖细胞；cor表示性腺皮质区；sc表示sertoli细胞(生殖细胞周围的支持细胞)；med表示髓质区。正常的zz雄性胚胎在发育至27期时，性腺皮质区退化形成单细胞层，髓质区高度发达，sertoli细胞围绕生殖细胞形成原始性索。正常的zw雌性胚胎性腺皮质区发达并含有大量生殖细胞，髓质退化。而注射诱导剂后，zz胚胎的性腺皮质区发达含有大量生殖细胞，髓质区退化，呈现出典型的雌性性腺结构。该图证实，本实施例所用的诱导剂能够诱导zz雄性性逆转为雌性。
29.采用雌性相关基因foxl2、雄性相关基因sox9的免疫荧光染色法进行生理性性别鉴定，可以与h&e染色法进行相互验证，结果如图2所示。通过免疫荧光染色的方法检测了诱导剂处理后胚胎发育至27期中华鳖胚胎性腺中雄性特异性蛋白sox9和雌性特异性蛋白foxl2的表达情况，在正常的 zz雄性胚胎性腺中，sox9蛋白主要高表达在sertoli前体细胞的细胞核中，在正常的zw雌性性腺中未见到sox9蛋白表达。而foxl2蛋白主要高表达于zw雌性性腺中颗粒细胞的细胞核，在正常的zz雄性性腺中未见表达。经过了本实施例诱导剂处理后的zz性腺中，检测到了大量foxl2蛋白的表达，未检测到sox9蛋白表达，这一结果与正常zw性腺吻合，进一步说明了通过该方法能够诱导zz雄性转变为生理性雌鳖。
30.s4、对中华鳖的zz或zw基因型进行鉴定，采用pcr法鉴定基因型，所用上游引物的序列为5
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gatcgaattacatcctgcct-3’，下游引物的序列为5
’‑
taaattaggactggaagacacc-3’，统计结果并分析zz伪雌鳖的数量及比例。统计结果如图3所示，经统计，正常zz全部发育为雄性(
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288只)，正常zw全部发育为雌性(234只)，注射诱导剂后的zz胚胎全部发育为雌性性腺(160只)。该数据表明，该发明的方法诱导zz中华鳖雌性化的效果十分显著。
31.本实施例所提供的诱导方法在中华鳖的胚胎发育过程中性别决定的关键时间段内，仅需要通过一次低剂量诱导剂注射，即能够实现雌性化诱导，同时保证了中华鳖正常的性腺发育及低药物残留。上述方法操作简单，效果显著，对环境的污染小，属于绿色的人工诱导方法。由本方法产生的zz 伪雌鳖发育成熟后，可以和正常的zz雄鳖进行交配，为培育zz全雄中华鳖提供新的途径。
32.实施例二
33.本实施例为利用非激素类化合物制备zz基因型中华鳖伪雌个体的方法，由特异性激动剂1,3,5-三(4-羟基苯基)-4-丙基-1h-吡唑诱导zz中华鳖雌性化，具体步骤包括：
34.s1、将特异性激动剂溶于二甲基亚砜溶剂中，混合均匀得到特异性激动剂浓度为2μg/μl的诱导剂，特异性激动剂为1,3,5-三(4-羟基苯基)-4
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丙基-1h-吡唑，化学式为c
24h22
n2o3。以配置1ml浓度为2μg/μl的诱导剂为例，取20μl体积的浓度为100mg/ml的dmso诱导剂母液加到400 μl的peg300中，混合均匀；向上述体系中加入50μl tween-80，混合均匀；然后继续加入530μl生理盐水定容至1ml，此方法得到的诱导剂中d mso的含量为2％。收集中华鳖胚胎，挑选良好的受精的胚胎，将挑选的胚胎放置在经过消毒的黄沙中，孵化条件为温度25-33℃，空气相对湿度7 0％-90％。孵化至第15.5期时，通过手电筒照射确定胚胎气室的位置，使气室朝上，用医用酒精消毒后，在气室上方的卵壳上用不锈钢注射器针头刺破卵壳，用微量注射器向胚胎的气室中注射诱导剂，之后用组织胶水粘合注射位置，并使气室的位置朝上，摆放于黄沙中继续孵化。诱导剂注射量由蛋的重量m决定，具体地，挑选出m＜900mg的蛋，不再孵化；1000m g≤m≤1200mg，注射3μl诱导剂；1200mg＜m≤1450mg，注射3.5μl诱导剂； 1450mg＜m≤1650mg，注射4μl诱导剂；1650mg＜m，注射5μl诱导剂。根据鳖蛋的重量注射不同质量的诱导剂，保证了中华鳖正常的性腺发育及低药物残留。
35.s2、注射诱导剂后，按照与步骤s1相同的孵化条件进行孵化，至稚鳖出壳。
36.s3、在胚胎发育至27期时，收集性腺，进行组织学分析，采用组织学切片h&e染色法、雌性相关基因foxl2、雄性相关基因sox9的免疫荧光染色法进行生理性鉴定，鉴定中华鳖为生理性雌性或雄性，统计性别比例。
37.s4、对中华鳖的zz或zw基因型进行鉴定，采用pcr法鉴定基因型，分析zz伪雌鳖的数量及比例结果如表1所示。
38.表1
39.受精卵数孵化数孵化率zz数zw数生理性雌鳖数雌性化率60058898％312276588100％
40.从表1中可知，本实施例根据鳖蛋的重量注射不同重量的诱导剂，胚胎注射诱导剂后，zz伪雌鳖的比例仍能达到100％。
41.虽然本发明公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。