一种补肾益气活血组合物及其在人牙周膜干细胞增殖分化中的应用的制作方法

1.本发明属于医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种补肾益气活血组合物及其在人牙周膜干细胞增殖分化中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.牙周炎是导致牙齿缺失的主要病因，其病程呈慢性发展趋势，随年龄增长或全身性疾病的发展而加重，研究发现牙周炎与糖尿病、冠心病、类风湿关节炎、阿尔茨海默病等全身性炎症反应有关联。
4.目前临床上多采用局部牙周基础治疗辅之以口服抗生素等药物治疗牙周炎，针对性强，消除急性炎症快捷有效，但并不能促进牙周支持组织的修复与再生，且局部炎症易于复发，使得牙周炎的远期治疗效果差强人意。研究表明，人牙周膜干细胞(human periodontal ligamentstem cells，hpdlscs)能在一定条件下分化成为较成熟的成牙骨质细胞和成纤维细胞，一定程度上可促进牙周组织的自我更新和修复。因此，扩充足够数量的hpdlscs并促进其骨向分化则成为牙周组织再生的关键。


技术实现要素：

5.本发明提供一种补肾益气活血组合物及其在人牙周膜干细胞增殖分化中的应用。本发明根据传统医学的辨证理论首次提出补肾益气活血方，经试验验证，其能够有效促进人牙周膜干细胞增殖和骨向分化，从而有望在(慢性)牙周炎的治疗中发挥更大作用。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.具体的，本发明涉及以下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供一种补肾益气活血组合物，所述补肾益气活血组合物由以下质量份数的原料药制成：
8.黄芪20-40份、当归5-20份、川芎1-10份、白术5-20份、茯苓20-40份、熟地10-30份、枸杞10-30份、补骨脂10-20份、肉桂1-10份、丹皮5-20份、菊花5-20份、黄芩5-20份、川牛膝5-20份。
9.本发明的第二个方面，提供上述补肾益气活血组合物的制备方法，所述制备方法包括：
10.s1、向上述原料药中加入水，浸泡煎煮后进行抽滤，所得滤液备用；滤渣再加入水进行煎煮，抽滤后，合并两次滤液；
11.s2、将步骤s1制得合并滤液中加入乙醇，静置离心后得上清液，蒸发浓缩后即得。
12.本发明的第三个方面，提供上述补肾益气活血组合物在如下任意一种或多种中的
应用：
13.a)促进人牙周膜干细胞增殖或制备促进人牙周膜干细胞增殖的产品；
14.b)促进人牙周膜干细胞成骨分化或制备促进人牙周膜干细胞成骨分化的产品；
15.c)治疗牙周炎或制备治疗牙周炎的产品。
16.其中，所述b)中，促进人牙周膜干细胞成骨分化具体表现为：
17.b1)促进成骨相关因子表达，所述成骨相关因子包括但不限于runx2、ocn、opn和alp；
18.b2)提高细胞成骨分化后期出现的矿化结节面积；
19.所述c)中，所述牙周炎包括慢性牙周炎。
20.所述产品可以为药物或者试验试剂，所述试验试剂可供实验室作基础研究使用。
21.当所述产品为药物时，所述药物还可以包含其他非药物活性成分，所述非药物活性成分包括药学上可接受的辅料和/或载体。
22.本发明的第四个方面，提供一种促进体外人牙周膜干细胞增殖和/或成骨分化的方法，所述方法包括：向人牙周膜干细胞中施加上述组合物。
23.以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
24.上述技术方案研究发现了补肾益气活血方能有效提升体外培养的hpdlscs增殖和成骨分化的能力，且效果较当归和补骨脂单味药更佳。这一结果从细胞生物学和牙周组织工程的角度为中医药相关组方药应用于慢性牙周炎的临床治疗提供了实验支撑，对补肾益气活血方剂用于临床上治疗慢性牙周炎具有指导意义，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
25.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
26.图1是本发明实施例中各组成骨相关基因比较；其中，a为runx2，b为opn，c为ocn，d为alp，tkp组为补肾益气活血方组，与对照组比较，ap《0.05；与阳性对照组相比，bp《0.05；与当归组相比，cp《0.05；与补骨脂组相比，dp《0.05；
27.图2是本发明实施例中茜素红染色结果(标尺：100μm)；其中，a为阳性对照组，b为补肾益气活血方组，c为当归组，d为补骨脂组。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所
述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
30.结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
31.本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种补肾益气活血组合物，所述补肾益气活血组合物由以下质量份数的原料药制成：
32.黄芪20-40份、当归5-20份、川芎1-10份、白术5-20份、茯苓20-40份、熟地10-30份、枸杞10-30份、补骨脂10-20份、肉桂1-10份、丹皮5-20份、菊花5-20份、黄芩5-20份、川牛膝5-20份。
33.更具体的，所述补肾益气活血组合物由以下质量份数的原料药制成：
34.黄芪30份，当归12份，川芎6份，白术12份，茯苓30份，熟地15份，枸杞15份，补骨脂12份，肉桂6份，丹皮10份，菊花10份，黄芩10份，川牛膝10份。
35.本发明的又一具体实施方式中，提供上述补肾益气活血组合物的制备方法，所述制备方法包括：
36.s1、向上述原料药中加入水，浸泡煎煮后进行抽滤，所得滤液备用；滤渣再加入水进行煎煮，抽滤后，合并两次滤液；
37.s2、将步骤s1制得合并滤液中加入乙醇，静置离心后得上清液，蒸发浓缩后即得。
38.其中，
39.所述步骤s1中，原料药与水的料液比为1：2～10(g/ml)，优选为1：5，在室温下浸泡10-120min，优选为60min，煎煮时间控制为10-60min，优选为45min；
40.所述滤渣与水的料液比为1：2～10(g/ml)，优选为1：5，煎煮时间控制为10-40min，优选为30min；
41.所述步骤s2中，所述合并滤液与乙醇的体积比为1：1～5(v/v)，优选为1：4，所述乙醇可以为90％乙醇；
42.所述离心具体可以在1000～5000r/min(优选为3000r/min)离心1～10min(优选为5min)。
43.本发明的又一具体实施方式中，提供上述补肾益气活血组合物在如下任意一种或多种中的应用：
44.a)促进人牙周膜干细胞增殖或制备促进人牙周膜干细胞增殖的产品；
45.b)促进人牙周膜干细胞成骨分化或制备促进人牙周膜干细胞成骨分化的产品；
46.c)治疗牙周炎或制备治疗牙周炎的产品。
47.其中，所述b)中，促进人牙周膜干细胞成骨分化具体表现为：
48.b1)促进成骨相关因子表达，所述成骨相关因子包括但不限于runx2、ocn、opn和alp；
49.b2)提高细胞成骨分化后期出现的矿化结节面积；
50.所述c)中，所述牙周炎包括慢性牙周炎。
51.所述产品可以为药物或者试验试剂，所述试验试剂可供实验室作基础研究使用。
52.当所述产品为药物时，所述药物还可以包含其他非药物活性成分，所述非药物活
性成分包括药学上可接受的辅料和/或载体。
53.所述药物给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂等。
54.本发明的药物中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮等。载体在药物组合物中的含量可以是1％重量-98％重量，通常大约是占到80％重量。
55.口服片剂和胶囊可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，阿拉伯胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙，山梨醇，氨基乙酸，润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土，崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。
56.口服液可以制成水和油的悬浮液、溶液、乳浊液、糖浆等，也可以制成干品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂，如悬浮剂，山梨醇，纤维素甲醚，葡萄糖糖浆，凝胶，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用油脂，乳化剂，如卵磷脂，山梨聚糖单油酸盐，阿拉伯树胶；或非水载体，包括杏仁油，油脂如甘油，乙二醇，或乙醇；防腐剂，包括对羟基苯甲酸甲酯、丙酯或山梨酸。
57.本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进体外人牙周膜干细胞增殖和/或成骨分化的方法，所述方法包括：向人牙周膜干细胞中施加上述组合物。
58.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
59.实施例
60.1材料与方法
61.1.1补肾益气活血方补肾益气活血方由本技术人根据传统医学的辨证理论首次提出，该方由黄芪30g，当归12g，川芎6g，白术12g，茯苓30g，熟地15g，枸杞15g，补骨脂12g，肉桂6g，丹皮10g，菊花10g，黄芩10g，川牛膝10g的药物组成，单味药选定为当归和补骨脂。所有药材均购自济南宏济堂，由山东省第一医科大学第一附属医院中医科鉴定为正品。
62.1.2试剂与仪器memα培养基(武汉，普诺赛)，胎牛血清(北京，索莱宝)，pbs(上海，双螺旋)，胰酶(上海，gibico)，β-甘油磷酸酯(北京，索莱宝)，地塞米松(北京，索莱宝)，抗坏血酸(北京，索莱宝)，细胞增殖及细胞毒性检测试剂(沈阳，万类生物)，茜素红染色液(北京，索莱宝)，tripure(北京，bioteke)，2
×
powertaqpcr mastermix(北京，bioteke)，sybrgreen(北京，bioteke)，酶标仪(美国，biotek)，荧光定量pcr仪(韩国，bioneer)。
63.1.3药剂制备称取药材，以料液比1：5加入纯净水，室温浸泡60min后煎煮45min，趁热抽滤，得滤液，滤渣再以料液比1：5加入纯净水，煎煮30min，趁热抽滤，合并2次滤液。称量滤液体积后加入4倍量90％乙醇(缓慢加入，搅拌均匀)，静置过夜，离心，去除沉淀得上清液。将上清液至于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩液离心5min(3000r/min)，取上清液用纯净水定容至1g/ml。用含有10％fbs的α-mem培养基将其稀释成1
×
10-7
g/ml、1
×
10-5
g/ml、1
×
10-3
g/ml浓度的条件培养基。
64.1.4 4hpdlscs的分离培养经患者知情同意后，取12-24岁之间因正畸或阻生而拔除的无病变牙齿，用含双抗pbs反复冲洗，刮取根中三分之一的牙周膜，修剪为1mm3大小，以探针将组织块移至培养瓶中平铺，加适量含10％fbs、1％的青霉素和链霉素的完全培养基，放入37℃、5％co2培养箱中培养，约4h后谨慎轻缓将培养瓶翻面，放入37℃、5％co2培养箱，每3d换液，细胞长至孔底80％左右时，分离纯化。
65.以免疫磁珠法筛选纯化hpdlscs，取出细胞，向培养瓶中加入stro-1单抗，放入4℃冰箱1h。pbs清洗三次，90g离心3min，去上清，重悬细胞，4℃下与加入清洗后的免疫磁珠共育30min。准备磁力架，将ep管放置于其上，保持约3min。用移液器谨慎吸出上清以及没有同磁珠贴合的细胞。pbs清洗两次，上清弃除，加入5ml完全培养基加入沉淀中使细胞重新悬浮，再次调整细胞浓度为1
×
104/ml，放入培养箱中继续培养。利用免疫荧光法鉴定细胞中stro-1蛋白表达确定hpdlscs成功培养。
66.1.5细胞增殖试剂盒(cck-8)法检测药剂对hpdlscs增殖的影响取生长良好的第三代hpdlscs，将细胞消化离心，进行细胞计数。将细胞接种于96孔培养板中，每孔的细胞个数为3
×
103个，每组设计5个复孔。接种后置于37℃，5％co2培养箱中培养代细胞贴壁。细胞贴壁后，将培养基更换成0g/ml、1
×
10-7
g/ml、1
×
10-5
g/ml、1
×
10-3
g/ml不同浓度的组方中药、当归单味药和补骨脂单味药培养基。培养板置于37℃、5％co2的培养箱内培养1天、3天、5天。弃去上清，每孔分别加入100μl的完全培养基。每孔加入10μl cck-8，37℃，5％co2的培养箱内培养1h。在酶标仪上测定其在450nm处od值，筛选最佳药物浓度和最佳作用时间以便后续实验使用。
67.1.6定量聚合酶链式反应(qpcr)检测成骨相关基因实验分组按空白组、阳性对照组、最佳浓度补肾益气活血方处理组、最佳浓度单味药当归处理组、最佳浓度单味药补骨脂处理组，用含有10％fbs、10mmβ-甘油磷酸酯、10nm地塞米松和50μg/ml抗坏血酸的α-mem培养基作为成骨诱导液，空白组仅加入培养基，阳性对照组加入上述成骨诱导液，实验组分别以1
×
10-5
g/ml浓度相应药物的含药成骨诱导液处理。
68.成骨诱导7天后，收集上述六孔板细胞，提取总rna，测定各样本中rna的浓度，按试剂盒说明反转录为cdna，检测runt相关转录因子2(runt-related transcription factor-2，runx2)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，alp)骨桥蛋白(osteopontin，opn)、骨钙蛋白(osteocalcin，ocn)基因的表达量，以β-actin为内参对照。
69.1.7茜素红染色检测矿化结节成骨诱导14天后，收集上述六孔板细胞，去除各孔培养基，用pbs洗2次。使用4％多聚甲醛室温固定15min。弃去固定液，用蒸馏水洗3次，加入茜素红染色液染色30min。去除染液，用蒸馏水洗3次，拍照。
70.1.8统计学方法采用spss23.0统计软件。计量资料以x
±
s表示，组间比较采用单因素方差分析 lsd-t检验，p《0.05即为差异有统计学意义。
71.2.结果
72.2.1补肾益气活血方及其单味药对hpdlscs增殖的影响经免疫荧光检测cck-8检测本实验成功分离培养了hpdlscs。结果显示，0g/ml时hpdlscs的od值随时间增加逐渐升高，细胞生长状态良好。组方和单味药与细胞共育一天后细胞活力未明显下降，说明三种药对细胞无明显毒性。与0g/ml相比，补肾益气活血方组方各浓度在第一天和第三天时均能显著促进细胞增殖(p《0.05)，且浓度为1
×
10-5
g/ml在第三天时效果最为显著(p《0.05)；当归同
样在浓度为1
×
10-5
g/ml、第三天时效果最为显著(p《0.05)；补骨脂则仅在第一天时能显著促进细胞增殖(p《0.05)。
73.本研究重点验证补肾益气活血方能否促进h pdlscs成骨分化及其与两种单味药的效果对比，故选定浓度为1
×
10-5
g/ml的组方和单味药用于细胞周期实验和成骨分化实验。以上结果说明补肾益气活血方及当归和补骨脂在特定时间和浓度上均能显著促进hpdlscs增殖，且补肾益气活血方效果更为明显。
74.表1：cck8法检测细胞增殖情况(n＝5，x
±
s)
[0075][0076]
注：与0gml比较，
*
p＜0.05
[0077][0078]
注：与0g/ml比较，
*
p＜0.05
[0079][0080]
注：与0g/ml比较，
*
p＜0.05
[0081]
2.2补肾益气活血方及其单味药对hpdlscs成骨分化能力的影响成骨诱导7天后进行qpcr检测。结果表明1
×
10-5
g/ml的补肾益气活血方、当归、补骨脂与空白对照组相比，均能显著提升成骨相关runx2、ocn、opn、alp的表达(p《0.05)，且补肾益气活血方的上调效果最为显著(见图1)。上述结果表明1
×
10-5
g/ml的补肾益气活血方及其单味药当归补骨脂水提醇沉液均能促进hpdlscs成骨分化，且组方效果更为明显。
[0082]
2.3茜素红染色检测矿化结节
[0083]
成骨诱导14天进行茜素红染色检测，结果显示补肾益气活血方组(图2b)较阳性对照组(图2a)矿化结节明显增多，颜色染色加深，钙化结节面积明显大于阳性对照组。当归组(图2c)和补骨脂组(图2d)较阳性对照组(图2a)矿化结节也有所增多，颜色加深，结节面积相比于阳性对照组有所增大，但明显少于补肾益气活血方组(图2b)。
[0084]
牙周炎是目前导致牙列缺失的主要原因，消除炎症、促进已缺失的牙周组织再生是治疗牙周炎的两大主要目的。临床局部基础治疗对于消除炎症快捷有效，而促进缺失组织再生尚无有效办法。hpdlscs具有多向分化的潜能，可形成类似于天然的牙周膜样结构，是牙周再生组织工程的首选种子细胞。然而牙周炎抑制了受损位置hpdlscs的增长，因此促进hpdlscs数量增加和活性增强就成为牙周组织恢复的关键。
[0085]
本研究中，利用组织块法成功分离了hpdlscs，cck-8检测结果显示补肾益气活血方能显著促进h pdlscs增殖，且效果较单味药当归、补骨脂更为明显，浓度1
×
10-5
g/ml时促进增殖的效果最佳，补肾益气活血方能提升hpdlscs的增殖能力，促进细胞数量增加。alp是细胞早期骨向分化的标记物，runx2是反映细胞成骨作用的关键因子，runx2、alp、ocn、opn是指示细胞成骨活性的指标。本研究发现，补肾益气活血方及当归、补骨脂单药均可显著上调runx2、alp、ocn、opn的表达水平，且补肾益气活血方上调最多。细胞成骨分化后期会出现钙沉积，产生矿化结节，茜素红染色检测结果显示补肾益气活血方治疗后矿化结节面积扩大，且比单味药效果更为明显。上述结果都显示，补肾益气活血方可促进hpdlscs的成骨分化，这些结果验证了中医补肾益气治则拟定的中草药组方在促进hpdlscs的增殖分化方面的有效性。
[0086]
另外，本研究发现组方具有更好的协同作用。本实验中自拟补肾益气活血方是本课题组依据中医辩证分型理论与现代医学观点，针对气血不足型和肾阴亏损型牙周炎进行组方。由于组方按照“君臣佐使”将十余种中药配伍而成，各味中药协同起效发挥作用，较之当归、补骨脂的“独自作战”效果更为显著，这也验证了中医辨证施治和整体理论的科学性。具体来说黄芪补气固表，当归补气和血，熟地补脾益肾，枸杞益精补血各味药合用以求补精益气、活血固齿功效，在人体内复杂的环境中，多角度、多位点、多靶向提升机体免疫能力，促进牙周组织修复和再生，细胞实验结果也说明组方较其他单味药具有更好的协同作用。
[0087]
综上所述，本研究发现了补肾益气活血方能有效提升体外培养的hpdlscs增殖和成骨分化的能力，且效果较当归和补骨脂单味药更佳。这一结果从细胞生物学和牙周组织工程的角度为中医药相关组方药应用于慢性牙周炎的临床治疗提供了实验支撑，对补肾益气活血方剂用于临床上治疗慢性牙周炎具有指导意义。
[0088]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。