原儿茶酸在制备改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及原儿茶酸在制备改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭药物中的应用。


背景技术：

2.急性心肌梗死是冠状动脉疾病最严重的临床表现，其通常是由于易损、含脂的动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀，导致冠状动脉管腔内血栓形成，从而阻塞流向远端心肌的血液，使心肌细胞处于缺血、缺氧的状态，最终导致心肌细胞的死亡。在梗死区域的心肌层组织发生坏死，其心肌细胞发生坏死或凋亡，线粒体发生肿胀和破裂，细胞膜和微血管被破坏，并有出血和炎症。由于缺血而坏死的心肌层组织区域搏动能力减弱或者完全丧失，需要疤痕组织的沉积以防止心肌破裂并限制心肌功能的进一步恶化。随着经皮冠状动脉介入治疗的普及和及时的再灌注治疗，急性心肌梗死病人的早期生存率得到了极大的改善，但心肌梗死引发的心力衰竭仍具有很高的发病率和死亡率。心肌梗死后不良的心室重构是导致心力衰竭发生的重要病理过程，因此探索治疗和逆转有害心室重构的方法是防治心力衰竭的关键一步。
3.原儿茶酸(protocatechuic acid，pca)即3,4-二羟基苯甲酸(3,4-dihydroxybenzoic acid)，cas号为99-50-3，来源于肠道菌群代谢花青素、原花青素等复杂多酚产生，体外实验表明pca能够抑制化学致癌并在不同组织中发挥促凋亡和抑制增值的作用。也有研究表明pca可作用于不同的分子靶标而发挥多种生物学功能，具有抗氧化、抑制炎症、降低血糖和保护神经等作用。因此pca具有作为药物的潜在价值。
4.目前，并未有关于原儿茶酸改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭中的相关的研究和报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供原儿茶酸在制备改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭药物中的应用，改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭，增加原儿茶酸的医药用途。
6.本发明提供了原儿茶酸在制备改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭药物中的应用。
7.优选的，所述心肌梗死包括冠心病、糖尿病或高血压诱发的心肌梗死。
8.优选的，所述原儿茶酸促进胞内磷脂酰肌醇激酶的表达。
9.优选的，所述磷脂酰肌醇激酶由催化亚基p110和调节亚基p85构成。
10.优选的，所述药物还包括药学可接受的辅料。
11.优选的，所述药物的剂型包括散剂、片剂、溶液剂和胶囊剂。
12.优选的，所述药物中原儿茶酸的质量百分含量为48％～52％。
13.本发明提供了一种改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭的药物，按照质量
百分含量计，包括48％～52％原儿茶酸。
14.本发明提供了原儿茶酸在制备改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭药物中的应用。原儿茶酸通过促进pi3k(p110和p85)蛋白的表达，调控下游机制，改善心肌梗死后心室的病理性重构并部分恢复心脏功能。小鼠动物模型实验显示：原儿茶酸能够改善抗生素处理后的心肌梗死小鼠的鼠心功能，增强心脏收缩功能，降低心脏纤维化程度，抑制心肌细胞的病理性肥大。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
16.图1为原儿茶酸的分子结构式；
17.图2为心肌梗死小鼠心脏超声检测；
18.图3为心肌梗死小鼠心脏he染色结果；
19.图4为心肌梗死小鼠心脏wga染色结果；
20.图5为心肌梗死小鼠心脏马松染色结果；
21.图6为心肌梗死小鼠心脏中pi3k(p85α)和pi3k(p110α)蛋白表达检测结果。
具体实施方式
22.本发明提供了一种原儿茶酸在制备改善心肌梗死后的心室病理性重构和/或心力衰竭的药物中的应用。
23.在本发明中，所述心肌梗死优选包括冠心病、糖尿病或高血压诱发的心肌梗死。
24.在本发明中，所述药物中原儿茶酸的质量百分含量优选为48％～52％，进一步优选为49％～50％。
25.本发明原儿茶酸(protocatechuic acid)，又可被称为3,4-二羟基苯甲酸(3,4-dihydroxybenzoic acid)，化学式为c7h6o4，分子量为154.12，外观为白色至微棕色针状结晶，水溶性为20g/l，熔点为198～202℃，化学结构式如图1所示。本发明原儿茶酸能够增加由调节亚基p85和催化亚基p110构成的pi3kα(phosphoinositide 3-kinases-alpha)的表达，进而调控下游机制，提高心肌梗死后心脏收缩功能，降低心肌梗死后心脏纤维化，改善心肌梗死后心肌细胞大小。
26.本发明对所述原儿茶酸的来源没有特殊限制，化学合成或者微生物代谢获得均可。
27.在本发明中，所述药物的剂型优选包括散剂、片剂、溶液剂和胶囊剂。
28.在本发明中，所述药物还包括药学可接受的辅料。本发明对所述药学可接受的辅料的具体种类没有严格要求，只要保证药物中原儿茶酸的质量浓度为48％～52％，根据药物的剂型常规选择药剂即可。
29.本发明还提供了一种改善心肌梗死后的心室重构和/或心力衰竭的药物，按照质量百分含量计，包括48％～52％原儿茶酸。
30.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
31.实施例1
32.1、小鼠心肌梗死模型建立
33.通过结扎小鼠心脏冠状动脉左前降支，对购自北京维通利华实验动物技术有限公司的10只c57bl/6小鼠(8-10周龄，20-25g)进行处理，构建小鼠心肌梗死模型。具体的，首先采用质量浓度为4％的水合氯醛以10μl/g通过腹腔注射麻醉小鼠。用脱毛膏去除其胸部毛发。用显微剪剪开颈正中皮肤，暴露气管，通过留置针将呼吸机导管插入气管中并设置呼吸频率120次/min。于体视镜(购于麦克奥迪医疗诊断系统有限公司)下使用显微剪和显微镊将小鼠的左胸部皮肤及肌肉依次横向剪开小口，在第四肋间用显微镊钝性分离肌肉后暴露出心脏，剥去心包膜，再用7-0带线缝合针结扎冠状动脉左前降支。最后用5-0缝合线及缝合针依次缝合肋骨、肌肉和皮肤，并用碘酒对手术部位进行消毒，将术后处于麻醉状态的小鼠置于37℃恒温电热毯上，待其恢复行动能力后于原环境中继续饲养。
34.2.心肌梗死小鼠的抗生素(abx)处理：
35.首先配制abx，配方如下表1：
36.表1 abx配方
[0037][0038]
按照表1的配方量，避光条件下称取4种抗生素，在超净工作台中用灭菌双蒸水溶解4种抗生素粉末，配制成abx溶液，将abx溶液装入灭菌后的小鼠专用饮水瓶中并用铝箔纸包裹进行避光处理，每2天更换一次abx溶液防止水体变质。用abx溶液代替小鼠的日常饮水，共处理7天，剔除步骤1恢复行动能力的心肌梗死小鼠肠道内微生物，排除小鼠自身代谢的影响，7天后小鼠饮用正常的灭菌水。
[0039]
3.原儿茶酸的制备与治疗
[0040]
在小鼠心梗手术且进行abx处理后，将小鼠平均分为生理盐水组(对照组)，和原儿茶酸组(实验组)，分别记为记为mi abx control和mi abx pca，于abx处理后的第1天开始，采用一次性1ml无菌注射器和8号弯头灌胃针通过灌胃的方式对小鼠进行处理，具体方法如下：
[0041]
生理盐水组：按照200ul/只小鼠，用无菌生理盐水进行灌胃，1天1次，持续8周；
[0042]
原儿茶酸组：购买原儿茶酸粉末(sigma-aldrich，货号：37580)，用生理盐水配置为0.5mg/ml原儿茶酸，按10μl/g的剂量对小鼠进行灌胃处理，1天1次，持续8周。
[0043]
测试例1
[0044]
小鼠心脏超声检测
[0045]
实施例1各组小鼠灌胃结束后，对小鼠胸部进行脱毛并擦拭干净后，用体积浓度为1.5％～2％的异氟烷麻醉小鼠，其心率稳定在450～500次/分钟。使用小动物心脏超声检测系统(visual sonics，vevo 2100)检测小鼠心脏收缩功能，采集小鼠左心室b-mode长轴图像并在左心室直径最大处采集m-mode图像。最后用lvtrace工具计算左心室射血分数(ef)、
左心室短轴缩短率(fs)，结果如图2所示。
[0046]
图2中a表示对照组心肌梗死小鼠灌胃生理盐水后超声心动图结果；b表示实验组心肌梗死小鼠灌胃pca后超声心动图结果；c为对照组灌胃生理盐水和实验组灌胃pca后心肌梗死小鼠左心室射血分数的统计结果，从左到右分别为mi abx control和mi abx pca处理组，各组射血分数依次为30.70和41.24；d为对照组灌胃生理盐水和实验组灌胃pca后心肌梗死小鼠左心室缩短分数的统计结果，从左到右分别为mi abx control和mi abx pca处理组，各组缩短分数依次为14.94和20.21。
[0047]
根据图2可以看出，灌胃pca后能够提高心肌梗死小鼠左心室射血分数和缩短分数，提高了心肌梗死小鼠心脏收缩功能。**表示p＜0.01。
[0048]
测试例2
[0049]
小鼠心肌组织he染色
[0050]
实施例1各组小鼠灌胃结束后，安乐死小鼠并解剖，取心脏，经脱水、石蜡包埋后，制成石蜡切片。将石蜡切片在二甲苯(购自国药集团，cas：1330-20-7，国药编码为10023418)中浸泡10分钟，重复浸泡3次，然后取出石蜡切片，依次在无水乙醇，95％乙醇，70％乙醇中浸泡5分钟，进行脱蜡及水化。
[0051]
流动自来水冲洗15分钟后，采用he染色试剂盒(凯基cat:kga224)对切片进行染色。首先滴加苏木素染色5分钟，自来水冲洗后伊红染色15秒，再用自来水冲洗5秒。切片晾干后，用中性树胶及盖玻片封片。将载玻片置于正置显微镜(nikon eclipse 80i)下观察，心肌组织细胞质和红细胞呈红色，细胞核呈蓝色，其他成分为红色且深浅不一。通过nis-elements br软件采集图像并用imagej进行测量心肌细胞横截面积，结果如图3所示。
[0052]
图3中a表示对照组心肌梗死小鼠灌胃生理盐水后he染色结果；b表示实验组心肌梗死小鼠灌胃pca后he染色结果；c表示对照组灌胃生理盐水和实验组灌胃pca后心肌梗死小鼠心肌纤维横截面积的统计结果，从左到右分别为mi abx control和mi abx pca处理组，各组心肌纤维横截面积依次为510.7和411.0。根据图3可以看出，实验组灌胃pca后能够减小心肌梗死小鼠心肌肌纤维横截面积，减轻心肌梗死小鼠的心肌病理性肥厚，*表示p＜0.05。
[0053]
测试例3
[0054]
小鼠心肌组织wga染色
[0055]
实施例1各组小鼠灌胃结束后，安乐死小鼠并解剖，取心脏，置于oct复合物中并于-80℃冷冻定型，通过冰冻切片机制备小鼠心脏组织的冰冻切片，放置室温复温约20分钟后开始使用wga(购于美国英杰生命技术有限公司)对冰冻切片进行染色，具体的：用1x pbs缓冲液洗涤5分钟，重复洗涤3次，用4％多聚甲醛溶液固定15分钟，然后使用wga-fitc(sigma#l4895)染液避光孵育30分钟，再使用hoechst(keygen#kga212-1)染液避光孵育30分钟，每次染色后均需用1x pbs缓冲液洗涤3次，每次5分钟方可进行下一步。染色完成后，在避光条件下用50％甘油封片后，于荧光显微镜(carl zeiss microscopy gmbh)下观察(hoechst激发波长为375nm，对应的发射波长425nm，以蓝光表示；wga-fitc激发波长485nm，发射波长525nm，以绿光表示)，通过zen软件采集图像并用imagej测量心肌细胞横截面积，结果如图4。
[0056]
图4中a表示对照组心肌梗死小鼠灌胃生理盐水后wga染色结果；b表示实验组心肌
梗死小鼠灌胃pca后wga染色结果图；c表示对照组灌胃生理盐水和实验组灌胃pca后心肌梗死小鼠心肌纤维横截面积的统计结果，从左到右分别为mi abx control和mi abx pca处理组，各组心肌纤维横截面积依次为607.2和521.7。图5表明灌胃pca能够减小心肌梗死小鼠心肌肌纤维横截面积，减轻心肌梗死小鼠的心肌病理性肥厚，**表示p＜0.01。
[0057]
测试例4
[0058]
小鼠心肌组织马松染色
[0059]
实施例1各组小鼠灌胃结束后，安乐死小鼠并解剖，取心脏，经脱水、石蜡包埋后，制成石蜡切片。采用测试例2石蜡切片脱蜡及水化过程对石蜡切片进行处理。
[0060]
用流动自来水冲洗15分钟后，采用马松三色法染色试剂盒(servicebio,cat:g1006)对切片进行染色。首先用重铬酸钾(massona液)浸泡过夜，流水冲洗15分钟后分别用苏木素(masson b液:masson c液的体积比＝1:1)染色7分钟，流水冲洗5秒，丽春红酸性复红染液(masson d液)染色3分钟，磷流水冲洗5秒，钼酸水溶液(masson e液)分化2分钟，苯胺蓝(masson f液)染色1分钟，最后用流水冲洗5秒。将切片自然晾干后，用中性树胶及盖玻片封片。将载玻片置于正置显微镜(nikon eclipse 80i)下观察，胶原纤维、心肌组织细胞质及细胞核分别呈蓝色、红色和蓝黑色。通过nis-elements br软件采集图像并用imagej进行计算胶原纤维面积及心肌组织面积，最后计算得到胶原纤维面积百分比，结果如图5。
[0061]
图5中a表示对照组灌胃生理盐水后马松染色结果；b表示实验组灌胃pca后马松染色结果；c为对照组灌胃生理盐水和实验组灌胃pca后心肌梗死小鼠心脏纤维化的统计结果，从左到右分别为mi abx control和mi abx pca处理组，各组心脏纤维化程度依次为43.64和20.72。图4表明实验组灌胃pca能够减轻心肌梗死小鼠心脏纤维化，**表示p＜0.01。
[0062]
测试例5
[0063]
小鼠心肌组织pi3k(p85α)和pi3k(p110α)蛋白表达量测定
[0064]
实施例1各组小鼠灌胃结束后，安乐死小鼠并解剖，取心脏，利用蛋白质免疫印迹检测各处理组心肌梗死小鼠心脏中pi3k(p85α)和pi3k(p110α)蛋白表达量，具体的：制备10％的15孔聚丙烯酰胺凝胶，加入电泳液，每孔上样量为30-40mg，加入maker(公司：赛默飞世尔科技公司)作为分子量指示剂，电泳仪中恒压80v电泳30min后转换恒压120v电泳60min。用电泳仪将电泳完毕的凝胶转至甲醇激活后的pvdf膜上，加入转膜液，冰水浴中恒流300ma转膜50min。转膜完毕后用5％脱脂牛奶常温封闭2h，脱脂牛奶用pbst配置。封闭后pbst在常温下洗3次，每次5min。按分子量大小裁剪后4℃摇床孵育一抗过夜，一抗以1:1000用含5％的bsa的pbst溶液配置(抗体公司及货号：pi3k-p85α，abclonal货号a4992；pi3k-p110α，cell signaling technology货号c73f8)。一抗孵育后pbst在常温下洗3次，每次5min，孵育二抗。二抗以1:10000用含5％的脱脂牛奶的pbst溶液配置，二抗于常温下孵育2h。孵育后pbst在常温下洗3次，每次5min，加入显影液(公司：上海天能科技有限公司)后在显影仪(公司：上海天能科技有限公司)下显影。蛋白质免疫印迹检测结果如图6。
[0065]
图6中a表示对照组灌胃生理盐水后蛋白质免疫印迹结果；b为对照组灌胃生理盐水和实验组灌胃pca后心肌梗死小鼠心脏中pi3k(p85α)蛋白质水平的统计结果，从左到右分别为mi abx control和mi abx pca处理组，各组pi3k(p85α)蛋白质表达量：将对照组mi abx control蛋白质表达量定为1时，mi abx pca蛋白质表达量为1.739；c为对照组灌胃生
理盐水和实验组灌胃pca后心肌梗死小鼠心脏中pi3k(p110α)蛋白质水平的统计结果，从左到右分别为mi abx control和mi abx pca处理组，各组pi3k(p110α)蛋白质表达量：将对照组mi abx control蛋白质表达量定为1时，mi abx pca蛋白质表达量为1.306。根据图6可以看出灌胃pca能够增加心肌梗死小鼠心脏pi3k(p85α)蛋白和pi3k(p110α)蛋白的表达。
[0066]
本发明提供的原儿茶酸能够促进pi3k(p110α和p85α)蛋白的表达，改善心肌梗死后心室的病理性重构并部分恢复心脏功能，降低心脏纤维化程度，抑制心肌细胞的病理性肥大。
[0067]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。