一种复合因素致疲劳小鼠模型的建立方法及抗疲劳组合物

1.本发明属于动物模型构建和功能食品筛选技术领域，具体涉及一种复合因素致疲劳小鼠模型的建立方法及抗疲劳组合物。


背景技术：

2.疲劳是现代生活的公共健康问题，全球有超过30％的人群有体力疲劳的状况。疲劳持续时间长，容易引发注意力不集中，睡眠障碍，肌痛，恶心，甚至抑郁等神经精神系统症状，进而影响正常工作、学习和生活甚至引发各种疾病。因此，应尽早采取措施减轻或改善疲劳状态，这对于健康的维持、工作效率提高均具有重要的现实意义和科学意义。
3.实验动物模型是研究疾病发生、发展以及药物作用的最有利的工具。研究表明引起疲劳的机制不同，其中包括但不限于能量摄入不足、氧化损伤、能量衰竭和内环境紊乱等。到目前为止，已报道的疲劳动物模型包括生理性和病理性疲劳模型，具体造模方法又分为物理、化学、免疫和炎症、放射线、手术、基因工程和癌因等。
4.目前常用物理法(强迫运动、睡眠干扰和束缚等)模拟生理性疲劳动物模型，但常采用单因素造模，最具有代表性的疲劳模型主要有两类，一是跑台，这种动物模型常需要多次跑台致使其能量耗竭而产生疲劳感，另外一种动物模型就是短期或长期游泳使其能量耗竭而产生疲劳感。这两种动物模型的不足是很明显的，一是需要长期训练，使动物产生疲劳；其二是重复性不佳，因经常跑台或游泳可使动物发生适应性改变，在检测时难以诱导出疲劳相关体征；第三影响因素单一，与现实生活中导致的致疲劳因素迥异。在现实生活中，有相当数量的人群由于食物摄入不能满足工作、生活所需的能量需求导致疲劳感，如食物匮乏，或肿瘤患者化疗或放疗期间，或严重的节食患者，抑郁患者，他们或者因为严重的胃肠道反应、或者精神上拒绝摄食，出现体重降低，疲劳状态明显。部分患者因此出现厌倦生活、甚至出现轻生的想法或行为。因此，采用节食复制疲劳动物模型，对于准确评价抗疲劳药物的功效具有积极意义。
5.另一方面，中药存在多种药食两用的药材，如肉苁蓉、鹿血、枸杞等，尽管目前市场已经有单独使用上述药材作为保健食品用于改善疲劳状态的报道，但其有效性为许多患者所质疑，其主要原因是药物单一、作用有限，当然与其评价所用的动物系单因素与现实情况存在差异不为使用者认同密切相关。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种复合因素致疲劳小鼠模型的建立方法及抗疲劳组合物，所构建的小鼠疲劳模型更接近于现实生活中导致的疲劳；同时从该疲劳模型出发筛选获得了具有特定功能的抗疲劳组合物。
7.本发明首先提供一种复合因素致疲劳小鼠模型的建立方法，是通过限制饮食和游泳来获得小鼠疲劳模型；
8.所述的限制饮食，作为实施例的具体记载，是将小鼠限制饮食不少于两周时间；
9.更进一步的，所述的限制饮食，其投喂量不超过小鼠体重的12％；
10.本发明还提供一种筛选具有抗疲劳效果的组合物的方法，是通过上述的方法构建的小鼠疲劳模型来进行筛选；
11.所述的组合物，其中包含有苁蓉粗多糖、苁蓉总多酚、枸杞粗多糖、鹿血粉；
12.作为实施例的一种具体记载，所述的组合物中苁蓉粗多糖、苁蓉总多酚、枸杞粗多糖、鹿血粉的质量份数比为0.32-0.52：0.055-0.155：0.05-0.15：0.23-0.43或0.32-0.52：0.055-0.155：0.3-0.5：0.23-0.43；
13.更进一步的，所述的组合物中的鹿血粉全部或部分替换为鹿血多肽；
14.所述的组合物中，苁蓉粗多糖、苁蓉总多酚、枸杞粗多糖、鹿血多肽的质量份数比为0.32-0.52：0.055-0.155：0.3-0.5：0.07-0.27；
15.本发明所提供的组合物用于制备抗疲劳的制品。
16.本发明通过限制饮食和游泳来获得小鼠疲劳模型，为筛选作用更加确切的缓解体力疲劳制剂的处方提供了研究基础。通过建立的小鼠疲劳模型，从枸杞、肉苁蓉及鹿血此三大特色中药的化学活性成分枸杞多糖、苁蓉多糖、苁蓉多酚、鹿血粉及鹿血多肽进行抗疲劳配方及功效研究，为其后期开发奠定坚实基础。
附图说明
17.图1：中药候选配方对食物限制小鼠体重的影响图；
18.图2：中药候选配方对食物限制小鼠体重的影响图。
具体实施方式
19.本发明中使用的样品a(苁蓉粗多糖)、样品b(苁蓉总多酚)、样品c(枸杞粗多糖)、样品d(鹿血粉)、样品e(鹿血多肽)，西洋参提取物可以选用任一市售产品；临用前用0.5％羧甲基纤维素钠cmc配成所需浓度的混悬液备用。
20.红景天胶囊使用四川省佳汇泰生物科技开发有限公司生产的产品，临用前用0.5％羧甲基纤维素钠cmc配成所需浓度的混悬液备用。
21.本发明所使用的检测试剂盒的信息如下：
22.葡萄糖测定试剂盒，批号0820071；乳酸(ld)测试盒，批号20210515；肝糖原试剂盒，批号20210513南京建成生物工程研究所。
23.本发明使用的动物选用km小鼠，雄性，spf级，体重18～22g，动物生产许可证为scxk(川)2018-19。
24.使用的主要仪器信息如下：
25.ja1003a电子天平，上海精天电子仪器有限公司；全波长酶标仪，varioskan flash，thermo，scientific；全自动生化分析仪，日立7020型，日本株式会日立高新技术出品。
26.本发明实施例中的实验环境选用spf屏障系统，室内温度20～22℃，相对湿度40％～70％，12小时明暗交替照明。使用许可证号为syxk(川)2018-100。自由饮水。标准饲料由实验动物中心提供。
27.本发明实施例中所有数据用均数
±
标准差(x
±
s)表示，统计用spss11.0软件进行
单因素方差分析，组间差异用student t检验。
28.下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
29.实施例1：筛选具有抗疲劳作用的组方
30.在本实施例中，小鼠疲劳模型是按照如下的方法建立获得的：
31.连续两周，每天定时按小鼠体重12％的比例投喂饲料，在限制饮食第14天，将小鼠置于恒温游泳箱中，水深大于30cm，水温25.0℃
±
1℃，游泳60min，获得疲劳小鼠模型。
32.从组分样品a(苁蓉粗多糖)、样品b(苁蓉总多酚)、样品c(枸杞粗多糖)、样品d(鹿血粉)、样品e(鹿血多肽)中筛选具有特定抗疲劳作用的组方。样品a—e小鼠用量如下表1所示意。
33.表1：受试样品剂量设置表
[0034][0035]
组方a1b2c2d1可显著延长小鼠游泳时间；组方a1b1c1d1可显著升高小鼠血糖水平，与模型组比较具有统计学意义。
[0036]
由于样品d鹿血粉与样品e鹿血多肽来源相似，正交设计组方先考察a、b、c、d四个样品的高低剂量，在此基础上将样本d替换为样品e用于后续试验。采用spss17.0对样本a—d进行四因素两水平正交设计(表2、表3)。
[0037]
表2：正交设计因素水平表
[0038][0039]
表3：四因素两水平(l
28
)正交试验表头设计表
[0040]
aba
×
bca
×
cda
×
d1234567
[0041]
将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性组及8个组方药物组；空白组小鼠正常给予饲料，两周结束时游泳，造成运动疲劳。其它10个组都只给体重12.5％的饲料，模型组不给药，阳性组和8个组方组每天按照给药体积0.2ml/10g灌胃相应药物。其中模型组及空白组灌胃0.5％cmc-na溶液；阳性组灌胃红景天药物，8个组方药物组是按照表2中的正交设计，按a2b1c2d2、a1b2c2d1、a2b1c2d1、a2b2c1d1、a1b2c2d2、a1b1c1d1、a2b2c1d2、a1b1c1d2配制的组方药物。各组每天灌胃相应药一次，连续灌胃给药两周。两周结束后，和正常组同时游泳，造成饥饿加运动疲劳(正常组只是运动疲劳)。
[0042]
在最后一次灌胃30min后，将每组的小鼠置于恒温游泳箱中，水深大于30cm，水温
25.0℃
±
1℃游泳，直至小鼠头部浸入水中6-8s不能游回水面，立即捞出水面，记录小鼠游泳时间，擦干采血。离心取血清测定血糖。对各指标进行极差分析，并以力竭游泳时间为变量，对实验结果进行方差分析。
[0043]
表4：中药候选配方对食物限制小鼠体重的影响表
[0044][0045]
表4和图1的结果表明食物限制模型能显著降低动物体重，与对照组比较差异具有统计学意义。而各药物组对食物限制小鼠体重均无明显影响，与模型组比较差异具有统计学意义。
[0046]
表5：中药候选配方对限食小鼠游泳时间以及血糖水平的影响表
[0047][0048][0049]
由表5可见，正常动物在应急情况下，其血糖明显升高，显著高于常规情况下的血糖水平；而小鼠在食量不足的情况下，游泳时间明显缩短，血糖水平难以满足应急状态，升高不明显，与对照组比较差异具有统计学意义；组方a1b2c2d1可显著延长小鼠游泳时间；组方a1b1c1d1可显著升高小鼠血糖水平，与模型组比较具有统计学意义。
[0050]
表6：基于血糖水平均数的直观极差分析表
[0051][0052]
注：取kavg数值高者为最佳水平。
[0053]
从表6可见，根据直观分析结果，kavg值大者代表的水平最佳，因此，升高血糖水平最佳的配方为a1b2c1d1。
[0054]
表7：基于游泳时间均数的直观极差分析表
[0055][0056][0057]
游泳时间是表现抗疲劳作用的最佳指标，从表7可见，根据直观分析结果，kavg值大者代表的水平最佳，因此，延长游泳时间的最佳配方为a1b2c2d1。
[0058]
从表8方差分析结果可知，苁蓉多糖和鹿血粉对饥饿小鼠游泳时间有显著延长作用(p《0.05)，枸杞多糖延长饥饿小鼠的游泳时间的作用稍弱，苁蓉多酚则无明显作用。苁蓉
多糖与苁蓉多酚、枸杞多糖及鹿血粉不存在明显的交互作用(p》0.05)。
[0059]
直观极差分析法表明，当两个水平kavg差值较小时，说明水平1与水平2对因变量影响差异很小。故综合考虑实验结果及成本，选定组方a1b2c1d1为最佳抗疲劳组方进行下一步实验。
[0060]
表8：以苁蓉多糖为核心方差分析各组份在游泳时间上的交互作用表
[0061][0062][0063]
实施例2：中药候选配方抗疲劳作用研究
[0064]
1、剂量设计
[0065]
实验设空白组、模型组、阳性组及各受试药物组，其中空白组、模型组与实施例1的相同，阳性组选用西洋参；受试药物为a1b2c1d1高剂量组(用量为1.26g/kg)、低剂量组(用量为0.42g/kg)；a1b2c1e1高剂量组(用量为1.01g/kg)、低剂量组(用量为0.34g/kg)，即高剂量组的使用量为低剂量组的3倍；阳性药选用西洋参0.45g/kg。
[0066]
2、实验步骤
[0067]
将小鼠随机分为正常组、模型组、阳性组及a1b2c1d1高、低剂量组及a1b2c1e1高、低剂量组。每天按照给药体积0.2ml/10g灌胃相应药物，模型组及正常组灌胃0.5％cmc-na溶液。每天一次，给药两周，每天除正常组按足量给与饲料外，其余各组定时定量投入饲料10g/5只。末次灌胃30min后，将小鼠置于恒温游泳箱中，水深大于30cm，水温25.0℃
±
1℃，游泳60min，捞出擦干采血，离心取血清测定血糖、乳酸(ld)及肝糖原水平。
[0068]
3、实验结果
[0069]
表9：中药候选配方对食物限制小鼠体重的影响表
[0070]
[0071][0072]
由表9和图2可知，小鼠在限制食物摄入后，其小鼠体重增长显著减慢，与对照组比较差异具有统计学意义；中药候选配方对食物限制小鼠体重无明显影响，与模型组比较差异无统计学意义。
[0073]
表10：中药候选配方对食物限制小鼠生化指标的影响表(n＝10,)
[0074][0075]
由表10可见，小鼠在处于半饥饿的情况下，其血糖水平、血清乳酸水平以及肝糖原水平均显著降低，与对照组比较差异具有统计学意义。组方a1b2c1e1高剂量组可显著升高小鼠血糖水平；组方a1b2c1d1高剂量组、a1b2c1e1高剂量组及低剂量组均可显著提高小鼠血清乳酸含量；与模型组比较差异具有统计学意义。
[0076]
本发明通过限制饮食和游泳来获得小鼠疲劳模型，为筛选作用更加确切的缓解体力疲劳制剂的处方提供了研究基础。