地舒单抗在制备治疗膝关节骨性关节炎的药物中的应用

1.本发明属于制药领域，涉及已知药物的新用途，具体涉及地舒单抗在制备治疗膝关节骨性关节炎的药物中的应用。


背景技术：

2.膝关节骨性关节炎危害着全世界数亿人群的健康。据流行病学调查，我国60岁以上人均膝关节骨性关节炎患病率达50％。75岁以上老人中更是高达80％，其致残率达40％，是50岁以上女性丧失工作能力的主要原因。保守估计当前我国有1亿膝关节骨性关节炎患者。未来伴随着我国社会经济的高速发展，以及人口老龄化的严峻形式，我国膝关节骨性关节炎发病水平有可能还会持续上升，严重危害人民的健康，降低患者的生活质量。
3.膝关节骨性关节炎是以关节软骨损伤、软骨下骨重塑及滑膜炎症等为主要病理表现的慢性疾病，骨性关节炎(osteoarthritis，oa)是一种以软骨损伤为主要表现的全关节疾病，累及软骨、滑膜及软骨下骨等结构，并导致疾病的不断进展和疼痛的发生，最终的结局为关节破坏、畸形、关节功能的降低甚至丧失。这一全关节多结构、动态变化的病变特点，导致尚无有效逆转oa疾病进展的药物。
4.目前药物治疗目的主要为缓解疾病症状，现有的治疗方式主要有两种：1.西乐葆等非甾体类止痛药，能够缓解部分患者膝关节的疼痛，并不能从根本上有效治疗膝关节炎。而且，非甾体类止痛药存在着胃肠道等不良反应大的问题，长期治疗效果不佳，且不能用于患有哮喘等呼吸道及急性心血管疾病的患者。2.玻璃酸钠等关节腔注射药物，主要是起润滑作用，但需多次关节腔注射，大大增加关节腔感染风险。此外，目前治疗方案对部分患者效果不佳，可能是当前药物作用靶点单一，未能覆盖膝关节骨性关节炎的多重发病机制，因此找到各组织的核心发病机制是治疗膝关节骨性关节炎的关键。


技术实现要素：

5.针对现有治疗膝关节骨性关节炎的药物存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供地舒单抗在制备治疗膝关节骨性关节炎的药物中的应用。
6.本发明通过研究发现：地舒单抗可显著提高oa大鼠的膝关节疼痛阈值，缓解关节炎疼痛，能有效缓解软骨损伤从而延缓关节炎进展。地舒单抗能显著降低软骨细胞代谢相关基因(col-2、col-x)的表达及炎症相关基因(mmp-13)的表达，能显著降低滑膜细胞炎症相关基因(tnf-a、mmp-13)的表达。地舒单抗能提高膝关节骨性关节炎患者的膝关节功能及患者生活治疗。这些发现表明地舒单抗可有效治疗膝关节骨性关节炎。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.地舒单抗在制备预防和/或治疗膝关节骨性关节炎的药物中的应用。
9.含地舒单抗的组合物在制备预防和/或治疗膝关节骨性关节炎的药物中的应用。所述的含地舒单抗的组合物包含地舒单抗以及其药学上可接受的载体或辅料。
10.一种预防和/或治疗膝关节骨性关节炎的药物，包含地舒单抗，还包含地舒单抗药
学上可接受的载体或辅料。
11.本发明的优点和有益效果：地舒单抗是已知的药物，其安全性有保障。本发明为治疗膝关节骨性关节炎提供了新的方向。
附图说明
12.图1是mia造模术后2、3周测定的大鼠机械疼痛阈值统计结果图。
13.图2是大鼠膝关节番红固绿、he染色图，图中oa 地舒单抗为1倍剂量。
14.图3是实时定量pcr检测软骨细胞代谢相关基因(col-2、col-x)的表达及炎症相关基因(mmp-13)的表达结果图。
15.图4是实时定量pcr检测滑膜细胞炎症相关基因(mmp13、tnf-α)的表达结果图。
具体实施方式
16.下述实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段
17.实施例1：大鼠骨关节炎(oa)造模及地舒单抗的治疗效果
18.实验方案：sprague-dawley大鼠(160-200g)随机分为四组：对照组(n＝3)、oa 生理盐水组(n＝3)、oa 地舒单抗组(1倍剂量(10mg/kg))(n＝3)和oa 地舒单抗组(5倍剂量(50mg/kg))(n＝3)。将1mg碘乙酸钠(mia)溶解在50μl生理盐水中并通过髌下韧带注射到右膝关节中，建立oa大鼠模型。对照组注射等体积生理盐水。注射mia一周后，oa 地舒单抗组(1倍剂量)及oa 地舒单抗组(5倍剂量)每隔一周皮下注射10mg/kg、50mg/kg的地舒单抗注射液，oa 生理盐水组则皮下注射等体积的生理盐水。同时，每隔一周用von frey检测大鼠疼痛阈值。注射地舒单抗4周后处死大鼠，每组分别采集膝关节标本，进行扫描、番红固绿染色、苏木精-伊红(he)染色。
19.von frey检测大鼠疼痛阈值的方法：(1)在标准室温的安静环境中，使用vonfrey纤维丝来评定实验动物的机械痛阈值pmwt。(2)进行实验时，先将实验动物置于底为网格的特制有机玻璃笼内适应20min，然后静待实验动物的探究活动、暴躁动作基本消失后(安静下来)，再根据dixon介绍的up and down法，用一系列标准化的vonfrey纤维丝(0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0g)从2.0g力度开始参照up and down方法刺激实验动物足部(分别测量手术组和假手术组)，并观察实验动物的缩足或舔足反应。3、无反应记为阴性，用“o”表示；有反应(缩足或舔足反应)记为阳性，用“x”表示。如果第一根纤维丝刺激没有反应，则给予大一级力度的纤维丝刺激；如果有反应，则改用小一级力度的纤维丝刺激，反复类推，从有反应的那一次开始测5次，得到一串以“o”或“x”组合的序列，将该序列和最后一根纤维丝的力度(f)输入公式：50％缩足反应阈值(g)＝(10[xf kδ])/10 000。其中xf＝log(f*10000)或者为纤维丝的硬度值；δ为各个毛力度取log后的均差，在此约等于0.224；k为根据测量所得“x”、“o”序列查表后得到的值。计算出机械疼痛阈值作为该实验动物的pmwt。
[0020]
实验结果：术后2周、3周分别测定大鼠机械疼痛阈值，结果表明地舒单抗可显著提高膝关节疼痛阈值，缓解关节炎疼痛，5倍剂量效果更明显(图1)。
[0021]
翻红固绿染色结果(图2)表明，mia诱导关节软骨侵蚀至潮线，全软骨层和未钙化软骨均显著减少，与对照组(sham)相比，反复注射地舒单抗显示了明显的软骨保存效果，表
面轻微破坏，有效地保存关节软骨结构，延缓mia诱导的大鼠膝关节oa进展；而从he染色结果(图2)可以看出，mia诱导的oa有明显的炎症细胞浸润和增生，但注射地舒单抗后，则明显减轻了滑膜的炎症。这些结果表明地舒单抗能有效缓解软骨损伤从而延缓关节炎进展。
[0022]
实施例2：地舒单抗对软骨及滑膜细胞代谢影响
[0023]
实验方案：
[0024]
(1)将大鼠软骨细胞、滑膜细胞种于6孔板中培养，将其各分为四组：对照组、il-1β组、地舒单抗组及地舒单抗 bay 11-7082组。对照组不给予任何处理，待细胞密度至80％后，其余三组均用5ng/ml的il-1β诱导软骨细胞、滑膜细胞24h。(il-1β组仅用5ng/ml的il-1β处理)。
[0025]
(2)随后，将地舒单抗 bay 11-7082组il-1β诱导后的细胞与1μm bay 11-7082(nf-κb抑制剂，selleck，s2913)预孵育2小时，然后地舒单抗组及地舒单抗 bay 11-7082组分别用0.3μg/ml浓度的地舒单抗处理24小时。
[0026]
(3)使用trizol(invitrogen)提取细胞总rna，逆转录合成cdna后再进行实时定量pcr检测col-2、col-x、mmp-13、tnf-α的表达。
[0027]
各基因引物序列如下：
[0028]
col-2上游引物：5
′‑
agaactggtggagcagcaaga-3
′
，
[0029]
col-2下游引物：5
′‑
atctggacgttagcggtgttg-3
′
；
[0030]
col-x上游引物：5
′‑
ccatggttcacacaacccctt-3
′
，
[0031]
col-x下游引物：5
′‑
tggctgtggtaaagcaccttg-3
′
；
[0032]
mmp-13上游引物：5
′‑
caaccctgtttacctacccacttat-3
′
，
[0033]
mmp-13下游引物：5
′‑
ctatgtctgccttagctcctgtc-3
′
；
[0034]
tnf-α上游引物：5
′‑
ctcaagccctggtatgagcc-3
′
，
[0035]
tnf-α下游引物：5
′‑
ggctgggtagagaacggatg-3
′
。
[0036]
实验结果：地舒单抗能显著降低软骨细胞代谢相关基因(col-2、col-x)的表达及炎症相关基因(mmp-13)的表达，而加入nf-κb的抑制剂后，其效应则被阻断(图3)。地舒单抗能显著降低滑膜细胞炎症相关基因(tnf-α、mmp-13)的表达，加入nf-κb的抑制剂后，其相关效应则被阻断(图4)。综上结果表明，地舒单抗能显著抑制骨关节炎中软骨细胞的代谢，抑制了软骨细胞和滑膜细胞的炎症，从而延缓了骨关节炎的进展，更加表明地舒单抗可有效治疗膝关节骨性关节炎。
[0037]
实施例3：地舒单抗治疗膝关节骨性关节炎的人体临床研究
[0038]
研究方案：本研究为一项前瞻性随机对照研究，在获得华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会的批准后开展。所有患者均签署知情同意书。将符合纳排标准的膝关节骨性关节炎患者随机分为地舒单抗组和空白对照组。地舒单抗组给予地舒单抗注射液60mg(1ml)皮下注射，空白对照组给予等量的生理盐水(1ml)皮下注射，两组患者均注射治疗一次，随访周期为6个月。评价指标为膝关节疼痛评分(nrs)、膝关节功能评分(ohs)、患者生活质量评分(womac)。
[0039]
研究结果：6个月随访后，地舒单抗组有效例数为24例，空白对照组有效例数为22例。和对照组相比，地舒单抗组治疗后6个月疼痛缓解明显，膝关节功能及患者生活治疗均提高(表1)。研究表明地舒单抗可有效治疗膝关节骨性关节炎。
[0040]
表1：地舒单抗缓解膝关节疼痛、改善关节功能、提高生活治疗
[0041]