一种改进的药物制剂中溶血磷脂酰胆碱的检测方法与流程

1.本发明属于医药检验领域，具体涉及一种药物制剂中溶血磷脂酰胆碱的检测方法。


背景技术：

2.卵磷脂是一种重要的药用辅料,广泛应用于脂质体、纳米乳、固体脂质纳米粒、涂剂等现代药物制剂中，其主要包括磷脂酰胆碱(pho sphatidy lcholine,pc)、磷脂酰乙醇胺(pho sphatidylethano lamine,pe)、神经鞘磷脂(sphin_g omyelin,sm)等前二者在卵磷脂纯化、贮藏过程中易发生水解,失去一分子脂肪酸后生成溶血磷脂酰胆碱(lyso-pho sphatidy lcholine,lpc)、溶血磷脂酰乙醇胺(lyso-pho sphatidy let hanolamine,lpe)。其中，溶血磷脂酰胆碱可引起红细胞及其他细胞膜破裂引起溶血或细胞坏死的不良后果。
3.氟比洛芬酯是氟比洛芬的前体，是一种在临床上应用十分广泛的非甾体抗炎药物，具有解热、抗炎以及止痛的作用。氟比洛芬酯具有一定脂溶性，溶于大豆油，并能够结合血浆蛋白。氟比洛芬酯注射液是由氟比洛芬酯与大豆油、卵磷脂、甘油等辅料经过特定的工艺制备而成。由于在放置过程中作为乳化剂的卵磷脂可能会发生部分水解，生成溶血磷脂酰胆碱，该化合物具有溶血或改变细胞渗透性等作用，故需对其进行严格的质量控制，并对溶血磷脂酰胆碱进行检测。
4.陈华等(《药物分析杂志》，2014年第34卷第3期，442-446页)发表了hplc-elsd法同时测定丙泊酚注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量利用hplc-elsd法同时测定丙泊酚注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量，然而该方法虽然能够同时进行溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的检验，但是在该方法中，溶血磷脂酰胆碱呈现双峰且不能实现完全分离，不利于进行定量计算，且方法运行时间较长(40分钟左右)。
5.cn107085061b公开了一种基于hplc-ms/ms检测平台的溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法，该方法建立了hplc-ms/ms检测平台，以利血平为内标绘制lpc14:0-lpc18:0系列物质检测的标准曲线，并检测血清的基质效应，该hplc-ms/ms检测平台针对人血清中lpc物质的检测稳定性和准确性较高，满足临床需求，然而该方法使用了hplc-ms/ms平台，液质-质谱联用仪器成本过高，适合测量较低浓度的血药浓度，不适用于对药物成品进行检测。
6.cn107957467a公开了一种分离测定药物制剂中溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法通过高效液相色谱仪联用蒸发光检测器对待测药物制剂样品进行分离和检测，所述高效液相色谱仪对待测药物制剂样品进行分离测定时，采用的流动相为无水甲醇-无水乙醇-冰醋酸，三者的体积比为(300-800):(300-800):(15-25)。然而该方法所用流动相-色谱柱体系损耗较大，运行10小时左右就会出现明显的色谱柱性能下降，保留时间向前漂移，运行50小时以上就可能产生色谱柱填料损坏，不适用于对药物成品长期大批量进行检验。
7.因此，开发一种更简单、高效的测定药物制剂中溶血磷脂酰胆碱的方法是极其必
要的。


技术实现要素：

8.针对以上技术现状，本发明目的在于提供一种改进的药物制剂中溶血磷脂酰胆碱的检测方法。本发明所述方法采用高效液相色谱法中，以二羟基键合硅胶为填充剂，以甲醇-冰乙酸-三乙胺-异丙醇混合溶液为流动相。
9.本发明方法中，作为实施方案之一，所述填充剂为二羟基键合硅胶的规格为100mm-300mm
×
3.0-4.6mm，3-5μm；优选为：150mm-250mm
×
4.6mm，5μm；最佳为：250mm
×
4.6mm，5μm。
10.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括甲醇-冰乙酸-三乙胺-异丙醇混合溶液ph值为6.5-7.5，优选为6.8-7.3，更优选为6.9-7.2，最佳为7.0。
11.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括甲醇-冰乙酸-三乙胺-异丙醇混合溶液的按以下制备：先以甲醇-冰乙酸500:8-500:12(v/v)、优选500:10(v/v)为基础，用三乙胺调整ph值至7.0为流动相储备液，以流动相储备液-异丙醇体积比为8:2-6:4，优选7.5:2.5-6.5:3.5，最佳为7:3的混合液为流动相。
12.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括流动相的流速为0.5ml-1.0ml/min，优选为0.6-0.9ml/min，更优选为0.7-0.9ml/min，最佳为0.8ml/min。
13.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括高效液相色谱仪进行检测时的柱温为25-35℃，优选28-32℃，最佳为30℃。
14.本发明方法中，作为实施方案之一，所述药物制剂为含有磷脂的注射液，所述注射液包括但不于氟比洛芬酯注射液丙泊酚注射液、丁酸氯维地平注射液、前列地尔注射液、中长链脂肪乳注射液，优选为氟比洛芬酯注射液。
15.本发明方法中，作为实施方案之一，所述氟比洛芬酯注射液中溶血磷脂酰胆碱的检测方法包括以下步骤：
16.其中高效液相色谱条件为：填充剂为二羟基键合硅胶，流动相：先以甲醇：冰乙酸500:10为基础，用三乙胺调整ph值至7.0为流动相储备液，以流动相储备液-异丙醇(7:3)混合液为流动相；柱温为30℃，流速为0.8ml/min；蒸发光散射检测器，载气为氮气，漂移管温度为85℃，载气流量为1.6l/min。
17.本发明方法中，作为实施方案之一，所述氟比洛芬酯注射液中溶血磷脂酰胆碱的检测包括以下步骤：
18.1)待测样品和对照品的制备：
19.精密量取待检测样品，置于量瓶中，用异丙醇-正己烷(2：1)稀释，摇匀，作为供试品溶液；
20.精密量取溶血磷脂酰胆碱对照品置于量瓶中，使用三氯甲烷-甲醇(2：1)溶解，然后用用异丙醇-正己烷(2：1)稀释制成每1ml中分别含有9.6μg、24μg、38.4μg、48μg、57.6μg的溶液，作为对照品溶液；
21.2)精密量取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，根据供试品中磷脂酰胆碱的峰面积，选对照品溶液以浓度的对数和对应峰面积的对数计算线性回归方程，由回归方程计算供试品中溶血磷脂酰胆碱的含量。
22.氟比洛芬酯注射液中所述方法进一步包括待测样品的检测结果每1ml中含有溶血磷脂酰胆碱不得超过2.0mg。
23.相对于现有检测方法，本发明检测方法将检测时间缩短至15min以内，大幅节约了检测时间，节约了检测时间成本，提高了检测效率；色谱柱的耐用性显著提高，与现有方法相比，本发明方法中色谱柱在多次使用后，色谱峰依然保持良好的分离度，不会因为色谱柱老化使得峰的分离度不断下降，从而引起检测的不准确，同时，提高了色谱柱的使用寿命。
附图说明
24.图1为实施例1对照品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱；
25.图2为实施例1供试品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱；
26.图3为实施例2对照品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱；
27.图4为实施例2供试品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱；
28.图5为实施例3对照品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱；
29.图6为实施例3供试品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱；
30.图7为实施例4对照品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱；
31.图8为实施例4供试品溶血磷脂酰胆碱的检测图谱。
具体实施方式
32.以下实施例和试验例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
[0033][0034][0035]
实施例1氟比洛芬酯注射液的检测
[0036]
检测方法：
[0037]
1)待测样品和对照品的制备：
[0038]
精密量取待检测样品，置于量瓶中，用异丙醇-正己烷(2：1)稀释，摇匀，作为供试品溶液；
[0039]
精密量取溶血磷脂酰胆碱对照品置于量瓶中，使用三氯甲烷-甲醇(2：1)溶解，然后用异丙醇-正己烷(2：1)稀释制成每1ml中分别含有9.6μg、24μg、38.4μg、48μg、57.6μg的溶液，作为对照品溶液；
[0040]
2)精密量取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，根据供试品中磷脂酰胆碱的峰面积，选对照品溶液以浓度的对数和对应峰面积的对数计算线性回归方程，由回归方程计算供试品中溶血磷脂酰胆碱的含量。
[0041]
色谱条件：
[0042]
以二羟基键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为规格为250mm
×
4.6mm，5μm，先以甲醇-冰乙酸500:10为基础，用三乙胺调整ph值至7.0的流动相储备液，以流动相储备液-异丙醇7:3混合液为流动相。流动相的流速为0.8ml/min，柱温为30℃，检测器为蒸发光散射检测
器，其中载气为氮气，漂移管温度为85℃，载气流量为1.6l/min。
[0043]
样品检测图谱见附图1、2，溶血磷脂酰胆碱的含量0.946mg/ml。
[0044]
本次检测时间为10min。
[0045]
实施例2
[0046]
供试品及对照品配制、溶血磷脂酰胆碱含量计算方法同实施例1。
[0047]
色谱条件：
[0048]
以二羟基键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为规格为150mm
×
4.6mm，5μm，先以甲醇-冰乙酸500:10为基础，用三乙胺调整ph值至7.2的流动相储备液，以流动相储备液-异丙醇7:3混合液为流动相。流动相的流速为0.8ml/min，柱温为30℃，检测器为蒸发光散射检测器，其中载气为氮气，漂移管温度为85℃，载气流量为1.6l/min。
[0049]
样品检测图谱见附图3、4，溶血磷脂酰胆碱的含量0.941mg/ml。
[0050]
本次检测时间为10min。
[0051]
实施例3
[0052]
供试品及对照品配制、溶血磷脂酰胆碱含量计算方法同实施例1。
[0053]
色谱条件：
[0054]
以二羟基键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为规格为250mm
×
4.6mm，5μm，先以甲醇-冰乙酸500:10为基础，用三乙胺调整ph值至7.0的流动相储备液，以流动相储备液-异丙醇7:3混合液为流动相。流动相的流速为0.9ml/min，柱温为28℃，检测器为蒸发光散射检测器，其中载气为氮气，漂移管温度为85℃，载气流量为1.6l/min。
[0055]
样品检测图谱见附图5、6，溶血磷脂酰胆碱的含量0.961mg/ml。
[0056]
本次检测时间为10min。
[0057]
实施例4
[0058]
供试品及对照品配制、溶血磷脂酰胆碱含量计算方法同实施例1。
[0059]
色谱条件：
[0060]
以二羟基键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为规格为250mm
×
4.6mm，5μm，先以甲醇-冰乙酸500:10为基础，用三乙胺调整ph值至7.0的流动相储备液，以流动相储备液-异丙醇7:3混合液为流动相。流动相的流速为0.8ml/min，柱温为30℃，检测器为蒸发光散射检测器，其中载气为氮气，漂移管温度为90℃，载气流量为1.5l/min。
[0061]
样品检测图谱见附图7、8，溶血磷脂酰胆碱的含量0.961mg/ml。
[0062]
本次检测时间为10min。