双四氢异喹啉类化合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于抗病毒药技术领域，涉及双四氢异喹啉类化合物的医药用途，尤其是在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒(coronavirus)是自然界广泛存在的一大类病毒，也是目前已知rna病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，例如哺乳纲中的灵长类、啮齿类、食肉目和偶蹄目，以及鸟纲中的鸡形目。sars-cov-2是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov和mers-cov，其中：前四种的致病性较低，一般引起呼吸道症状，类似普通感冒；sars-cov可引发重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，sars，又称“非典型肺炎”或“非典”)，mers-cov可引发中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome，mers)，并分别在2002年和2012年爆发(zaki a.m.,van boheemen s.,bestebroer t.m.,et al.,isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in saudi arabia[j],n.engl.j.med.,2012,367(19):1814-1820；cui j.,li f.,shi z.l.,origin and evolution of pathogenic coronaviruses[j],nat.rev.microbiol.,2019,17(3):181-192)。
[0003]
新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，covid-19)，简称“新冠肺炎”，是由sars-cov-2(新型冠状病毒)引起的，以发烧、干咳、乏力和具有一定致死率为主要特征的接触性传染病。自2019年12月新冠肺炎爆发以来，确诊感染病例已经超过非典，并且仍在不断增加，造成了严重的社会危害和经济损失，世界卫生组织宣布新冠肺炎这一疫情已经构成“国际关注的突发公共卫生事件”。自疫情爆发以来，相关研究主要集中在流行性病学调查、临床分离毒株的序列比对与分析、病毒的检测方法等方面，而关于新型冠状病毒的入侵、复制、免疫调控机制的研究还处于初级探索阶段，并且没有疫苗能够提供充分的保护，因此研究和开发针对冠状病毒(尤其是sars-cov-2)的抗病毒药具有重要的社会意义和经济价值。
[0004]
生物碱(alkaloids)是广泛存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，大多数具有复杂的环状结构，并且氮原子通常存在于环中，具有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。按照生物碱的基本母核结构，可以将其分为有机胺类、吡咯烷类、吡啶类、异喹啉类等60类左右。其中，异喹啉类是生物碱中最大的一类，以异喹啉或四氢异喹啉为母核，生源上来自苯丙氨酸或酪氨酸，大致可分为简单异喹啉类(如鹿尾草碱)、苄基异喹啉类(如罂粟碱)、双苄基异喹啉类(如汉防己甲素)、阿朴啡类(如木兰碱)、原小檗碱类(如小檗碱)、前托品类(如东莨菪碱)、吗啡类(如吗啡碱)等。
[0005]
中国发明专利申请cn109419804a公开了源自三尖杉属植物的生物碱成分可高效抑制7科9种病毒(包括冠状病毒)感染宿主细胞及动物，显著减轻甚至清除感染动物体内病毒，其中生物碱成分包括高三尖杉酯碱(hht)、三尖杉碱、三尖杉酯，其母核结构为苯并氮杂
比四氢异喹啉多一个亚甲基。中国发明专利申请cn110960532a公开了博落回苄基异喹啉类生物碱与反式白藜芦醇组合物具有显著的抗冠状病毒效果，特别涉及到对covid-19冠状病毒的抑制作用，其中原阿片碱和别隐品碱的母核结构为源自四氢异喹啉的、包含酮羰基的开环结构。中国发明专利申请cn111481546a公开了娃儿藤生物碱或其盐具有优良的冠状病毒抑制效果，特别是在新型冠状病毒2019-ncov抑制测试结果中显示出高抑制活性，其中娃儿藤生物碱的母核结构为六氢吡咯并异喹啉，比四氢异喹啉多一个吡咯烷。
[0006]
李振等人发现苦参碱对sars-cov-2可能具有直接灭活和抑制其在机体体内的复制、增殖的作用效应，而槐果碱可能通过抑制sars-cov-2对宿主细胞的附着和穿透，起到抗病毒的作用，其中苦参碱和槐果碱的母核结构均为包含四氢异喹啉的四并环结构(李振,俞科贤,苦参多路径抗冠状病毒的机制研究[j],中草药,2020,51(4):888-894)。曾丙麟等人的综述披露了石蒜碱在抗病毒方面表现出较大潜力，特别是sars-cov-2研究，其中石蒜碱的母核结构为包含四氢异喹啉的五并环结构(曾丙麟等,石蒜碱药理活性及构效关系研究进展[j],天然产物研究与开发,2020)。
[0007]
综上，关于双四氢异喹啉类生物碱在抗冠状病毒感染方面的研究，目前尚罕有报道。


技术实现要素：

[0008]
发明要解决的问题
[0009]
为了解决至今没有能够对抗冠状病毒感染的双四氢异喹啉类化合物，本发明提供了相应的双四氢异喹啉类化合物在对抗冠状病毒(特别是sars-cov-2)感染方面的应用。
[0010]
用于解决问题的方案
[0011]
第一方面，本发明提供了式i化合物或其药学上可接受的形式在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用，其中
[0012][0013]
每一个r1各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、3-6元杂环烷基、c
6-10
芳基、5-10元杂芳基和下列基团之一：
[0014]
[0015]
并且
[0016]
至少一个r1为下列基团之一：
[0017][0018]
每一个r2各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基和c
6-10
芳基；
[0019]
每一个r3各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、3-6元杂环烷基、c
6-10
芳基和5-10元杂芳基；
[0020]
所述药学上可接受的形式选自药学上可接受的盐、酯、光学异构体、几何异构体、溶剂化物、多晶型物、同位素标记物、前药和活性代谢物。
[0021]
第二方面，本发明提供了式ii化合物或其药学上可接受的形式在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用，其中
[0022][0023]
每一个r1各自独立地选自氢、并且两个r1不同时为氢；
[0024]
每一个r2各自独立地为c
1-4
烷基，优选甲基、乙基和异丙基，更优选甲基；
[0025]
每一个r3各自独立地选自氢和c
1-4
烷基，优选氢、甲基、乙基和异丙基，更优选氢和甲基；
[0026]
所述药学上可接受的形式选自药学上可接受的盐、酯、光学异构体、几何异构体、溶剂化物、多晶型物、同位素标记物、前药和活性代谢物。
[0027]
第三方面，本发明提供了下列化合物或其药学上可接受的形式在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用：
[0028][0029]
所述药学上可接受的形式选自药学上可接受的盐、酯、光学异构体、几何异构体、溶剂化物、多晶型物、同位素标记物、前药和活性代谢物。
[0030]
第四方面，本发明提供了包含式i或式ii化合物或其药学上可接受的形式的药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。
[0031]
第五方面，本发明提供了式i或式ii化合物或其药学上可接受的形式，或者包含式i或式ii化合物或其药学上可接受的形式的药物组合物，其用作抗冠状病毒药物。
[0032]
第六方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗由冠状病毒感染导致的疾病的方法，其包括将治疗有效量的式i或式ii化合物或其药学上可接受的形式，或者治疗有效量的上述药物组合物，施用于对其有需求的个体的步骤。
[0033]
发明的效果
[0034]
体外细胞试验结果表明，本发明的四氢异喹啉类化合物(特别是蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱、莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱)对冠状病毒易感人源细胞的毒性作用很小，但却能够显著抑制sars-cov-2和sars-cov假病毒易感人源细胞的感染，在细胞水平上对sars-cov-2和sars-cov假病毒感染具有显著的抑制作用，且具有剂量依赖性，因此可以用作冠状病毒抑制剂，特别是用作sars-cov-2抑制剂，以治疗人感染该病毒后导致的covid-19。
附图说明
[0035]
图1示出了蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对hek293t-ace2细胞的cc
50
测定结果。
[0036]
图2示出了蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱抑制sars-cov-2假病毒的ic
50
测定结果。
[0037]
图3示出了蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱抑制sars-cov假病毒的ic
50
测定结果。
[0038]
图4示出了莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱对hek293t-ace2细胞的cc
50
测定结果。
[0039]
图5示出了莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱抑制sars-cov-2假病毒的ic
50
测定结果。
[0040]
图6示出了莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱抑制sars-cov假病毒的ic
50
测定结果。
具体实施方式
[0041]
双四氢异喹啉类化合物
[0042]
本发明提供了式i化合物或其药学上可接受的形式在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用，其中
[0043][0044]
每一个r1各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、3-6元杂环烷基、c
6-10
芳基、5-10元杂芳基和下列基团之一：
[0045][0046]
并且
[0047]
至少一个r1为下列基团之一：
[0048][0049]
每一个r2各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基和c
6-10
芳基；
[0050]
每一个r3各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、3-6元杂环烷基、c
6-10
芳基和5-10元杂芳基；
[0051]
所述药学上可接受的形式选自药学上可接受的盐、酯、光学异构体、几何异构体、溶剂化物、多晶型物、同位素标记物、前药和活性代谢物。
[0052]
在本发明的一项实施方案中，上述式i化合物中，
[0053]
每一个r1各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、c
6-10
芳基和下列基团之一：
[0054][0055]
并且
[0056]
至少一个r1为下列基团之一：
[0057][0058]
在本发明的一项优选的实施方案中，上述式i化合物中，
[0059]
每一个r1各自独立地选自氢和下列基团之一：
[0060][0061]
并且
[0062]
两个r1不同时为氢。
[0063]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述式i化合物中，
[0064]
每一个r1各自独立地选自氢、并且两个r1不同时为氢。
[0065]
在本发明的一项实施方案中，上述式i化合物中的每一个r2各自独立地选自氢、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基。
[0066]
在本发明的一项优选的实施方案中，上述式i化合物中的每一个r2各自独立地选自氢和c
1-6
烷基。
[0067]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述式i化合物中的每一个r2各自独立地为c
1-6
烷基。
[0068]
在本发明的一项实施方案中，上述式i化合物中的每一个r3各自独立地选自氢、c1-6
烷基、c
3-6
环烷基和c
6-10
芳基。
[0069]
在本发明的一项优选的实施方案中，上述式i化合物中的每一个r3各自独立地选自氢、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基。
[0070]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述式i化合物中的每一个r3各自独立地选自氢和c
1-6
烷基。
[0071]
在本发明的一项实施方案中，上述式i化合物中，
[0072]
每一个r1各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、c
6-10
芳基和下列基团之一：
[0073][0074]
并且
[0075]
至少一个r1为下列基团之一：
[0076][0077]
每一个r2各自独立地选自氢、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基；
[0078]
每一个r3各自独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基和c
6-10
芳基。
[0079]
在本发明的一项优选的实施方案中，上述式i化合物中，
[0080]
每一个r1各自独立地选自氢和下列基团之一：
[0081][0082]
并且
[0083]
两个r1不同时为氢；
[0084]
每一个r2各自独立地选自氢和c
1-6
烷基；
[0085]
每一个r3各自独立地选自氢、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基。
[0086]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述式i化合物中，
[0087]
每一个r1各自独立地选自氢、并且两个r1不同时为氢；
[0088]
每一个r2各自独立地为c
1-6
烷基，优选c
1-4
烷基，更优选甲基、乙基和异丙基，最优选甲基；
[0089]
每一个r3各自独立地选自氢和c
1-6
烷基，优选氢和c
1-4
烷基，更优选氢、甲基、乙基和异丙基，最优选氢和甲基。
[0090]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述式i化合物为式ii化合物，其中
[0091][0092]
每一个r1各自独立地选自氢、并且两个r1不同时为氢；
[0093]
每一个r2各自独立地为c
1-4
烷基，优选甲基、乙基和异丙基，更优选甲基；
[0094]
每一个r3各自独立地选自氢和c
1-4
烷基，优选氢、甲基、乙基和异丙基，更优选氢和甲基。
[0095]
具体地，上述式i或式ii化合物包括下列具体的双四氢异喹啉类化合物。
[0096]
[0097][0098]
药学上可接受的形式
[0099]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“药学上可接受的形式”是指基于药物活性成分(api)的原始形态(通常为游离态)衍生的，能够施用于对其有需求的个体的药用形式，包括盐(例如，游离态化合物与酸或碱形成的加成盐)、酯(例如，化合物中的羟基与酸形成的酯)、光学异构体(例如，对映异构体)、几何异构体(例如，顺反异构体)、溶剂化物(例如，水合物)、多晶型物、同位素标记物(例如，氘代化合物)、前药和活性代谢物。
[0100]
药物组合物
[0101]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“药物组合物”是指可以用作药物的组合物，其包含药物活性成分(api)以及可选的一种或多种药学上可接受载体。
[0102]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“药学上可接受的载体”是指与药物活性成分相容并且对个体无害的药用辅料，包括(但不限于)稀释剂(或称填充剂)、粘合剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、增稠剂、助流剂、矫味剂、矫嗅剂、防腐剂、抗氧化剂、ph调节剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂等。
[0103]
本发明提供了包含上述式i或式ii化合物(或其具体化合物)或其药学上可接受的形式的药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。
[0104]
在本发明的一项实施方案中，上述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。
[0105]
预防和/或治疗
[0106]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“预防”是指向有需求的健康个体预防性地施用活性成分(例如，本发明的式i或式ii化合物(或其具体化合物)或其药学上可接受的形式)或药物组合物(例如，本发明的药物组合物)，以防止疾病发生。
[0107]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“治疗”是指向有需求的患病个体治疗性地施用(例如，本发明的式i或式ii化合物(或其具体化合物)或其药学上可接受的形式)或药物组合物(例如，本发明的药物组合物)，以减缓、中断或终止疾病发展，但并非完全消除所有症状。
[0108]
冠状病毒感染
[0109]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“冠状病毒”是指在系统分类上属于套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)的病毒。
[0110]
在本发明的一项实施方案中，冠状病毒选自hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov和sars-cov-2。
[0111]
在本发明的一项优选的实施方案中，冠状病毒选自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2。
[0112]
在本发明的一项更优选的实施方案中，冠状病毒选自sars-cov和sars-cov-2。
[0113]
由冠状病毒感染导致的疾病
[0114]
本发明提供了一种用于预防和/或治疗由冠状病毒感染导致的疾病的方法，其包括将治疗有效量的上述式i或式ii化合物(或其具体化合物)或其药学上可接受的形式，或者治疗有效量的上述药物组合物，施用于对其有需求的个体的步骤。
[0115]
在本发明的一项实施方案中，由冠状病毒感染导致的疾病包括呼吸系统疾病、消化系统疾病、心血管系统疾病、神经系统疾病和免疫系统疾病等。
[0116]
在本发明的一项优选的实施方案中，上述由冠状病毒感染导致的疾病为呼吸系统疾病。
[0117]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述呼吸系统疾病为肺部疾病。
[0118]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述肺部疾病选自重症急性呼吸综合征(sars)、中东呼吸综合征(mers)和新型冠状病毒肺炎(covid-19)。
[0119]
在本发明的一项更优选的实施方案中，上述肺部疾病选自重症急性呼吸综合征(sars)和新型冠状病毒肺炎(covid-19)。
[0120]
重症急性呼吸综合征(sars)
[0121]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“重症急性呼吸综合征”是指由sars-cov引起的急性呼吸道传染病，世界卫生组织(who)将其命名为重症急性呼吸综合征。
[0122]
中东呼吸综合征(mers)
[0123]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“中东呼吸综合征”是指由mers-cov引起的急性呼吸道传染病，世界卫生组织(who)将其命名为中东呼吸综合征。
[0124]
新型冠状病毒肺炎(covid-19)
[0125]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“新型冠状病毒肺炎”是指由sars-cov-2引起的急性呼吸道传染病，世界卫生组织(who)将其命名为中东呼吸综合征。
[0126]
治疗有效量
[0127]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“治疗有效量”是指当意在预防和/或治疗某种疾病或其至少一种临床症状而为个体给药时，足以影响该疾病或症状的药物(活性成分或其组合或者包含活性成分或其组合的药物组合物)的用量。本领域技术人员
可以理解，“治疗有效量”可以根据活性成分的性质、疾病和/或症状的程度、个体的情况等因素而变化。
[0128]
施用
[0129]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“施用”是指全身性和/或局部施用。术语“全身性施用”是指非局部地施用，从而使所施用的物质可能影响个体的若干器官或组织，或者从而使所施用的物质可能穿越个体的若干器官或组织而到达作用靶点。本领域技术人员可以理解，“全身性施用”涵盖各种形式的施用，包括(但不限于)肠胃外施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经皮施用、口服施用等。术语“局部施用”是指在特异性位点处或其周围施用。本领域技术人员可以理解，“局部施用”涵盖各种形式的施用，例如直接注射到特定位点处或注射到其周围(例如肿瘤内施用)。
[0130]
个体
[0131]
除非另有说明，本说明书的上下文中所提及的术语“个体”包括(但不限于)人类(任何年龄组的男性或女性，例如儿科个体中的婴儿、幼儿或青少年，以及成人个体中的青壮年、中年或老年)和非人类的动物(例如哺乳动物中的猴、牛、猪、马、羊、鼠、兔、猫或狗)。
[0132]
在本发明的一项实施方案中，该方法中的个体是人类。
[0133]
以下将结合具体的实施例来进一步解释或说明本发明中的技术方案。除非另有说明，下列实施例中所使用的仪器、材料或试剂等均可通过常规商业手段获得。
[0134]
试验材料
[0135]
过表达ace2的人胚肾细胞(hek293t-ace2)以及sars-cov-2和sars-cov基于逆转录病毒(mlv)的假病毒为苏州系统医学研究所实验室制备并保存；细胞生长液为含10％fbs的dmem。
[0136]
实施例1：蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对细胞的毒性试验。
[0137]
1、试验方法：
[0138]
1)取生长状态良好的hek293t-ace2细胞进行消化传代，用细胞生长液将细胞密度调整为1
×
104/ml，接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱中培养16h；
[0139]
2)16h后，弃去孔中培养基，然后加入细胞维持液，同时加入蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱，使终浓度为128μm、64μm、32μm、16μm、8μm、4μm、2μm、1μm、0.5μm、0.25μm和0.125μm，同时设置细胞对照组，放置于37℃、5％co2培养箱中培养；
[0140]
3)48h后，用试剂进行细胞活力检测。
[0141]
2、试验结果：
[0142]
测定细胞存活率，能够反映蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对hek293t-ace2细胞的毒性作用，其结果见图1。从图1中可以看出，hek293t-ace2的半数细胞毒性浓度(cc
50
)分别为23.6μm和20.8μm，表明蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对hek293t-ace2细胞的毒性作用较小。
[0143]
实施例2：蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的抗sars-cov-2和sars-cov假病毒活性试验。
[0144]
1、试验方法：
[0145]
1)取生长状态良好的hek293t-ace2细胞进行消化传代，用细胞生长液将细胞密度调整为1
×
104/ml，接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱中培养16h；
[0146]
2)16h后，用细胞维持液稀释蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱，使浓度分别为16μm、8μm、4μm、2μm、1μm、0.5μm和0.25μm；
[0147]
3)在96孔板盖子上做好标记，弃去孔中培养基，按标记顺序，每孔对应加入100μl稀释好的蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱，每孔加入100μl sars-cov-2或sars-cov假病毒，使蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的终浓度为8μm、4μm、2μm、1μm、0.5μm、0.25μm和0.125μm，设置病毒对照组，放置于37℃、5％co2培养箱中培养；
[0148]
4)48h后，用荧光素酶底物试剂进行假病毒感染检测。
[0149]
2、试验结果：
[0150]
从图2和图3中可以看出，蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对sars-cov-2以及sars-cov假病毒的抑制效果呈剂量依赖性。其中，蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对sars-cov-2假病毒的半数最大抑制剂量浓度(ic
50
)分别为0.22μm和0.23μm，对sars-cov假病毒的半数最大抑制剂量浓度(ic
50
)分别为0.16μm和0.13μm。
[0151]
实施例3：莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱对细胞的毒性试验。
[0152]
1、试验方法：
[0153]
1)取生长状态良好的hek293t-ace2细胞进行消化传代，用细胞生长液将细胞密度调整为1
×
104/ml，接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱中培养16h；
[0154]
2)16h后，弃去孔中培养基，然后加入细胞维持液，同时加入莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，使终浓度为128μm、64μm、32μm、16μm、8μm、4μm、2μm、1μm、0.5μm、0.25μm和0.125μm，同时设置细胞对照组，放置于37℃、5％co2培养箱中培养；
[0155]
3)48h后，用试剂进行细胞活力检测。
[0156]
2、试验结果：
[0157]
测定细胞存活率，能够反映莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱对hek293t-ace2细胞的毒性作用，其结果见图4。从图4中可以看出，hek293t-ace2的半数细胞毒性浓度(cc
50
)分别为29.8μm、23.5μm和39.9μm，表明莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱对hek293t-ace2细胞的毒性作用较小。
[0158]
实施例4：莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的抗sars-cov-2和sars-cov假病毒活性试验。
[0159]
1、试验方法：
[0160]
1)取生长状态良好的hek293t-ace2细胞进行消化传代，用细胞生长液将细胞密度调整为1
×
104/ml，接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5％co2培养箱中培养16h；
[0161]
2)16h后，用细胞维持液稀释莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，使浓度分别为16μm、8μm、4μm、2μm、1μm、0.5μm和0.25μm；
[0162]
3)在96孔板盖子上做好标记，弃去孔中培养基，按标记顺序，每孔对应加入100μl稀释好的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，每孔加入100μl sars-cov-2或sars-cov假病毒，使莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的终浓度为8μm、4μm、2μm、1μm、0.5μm、0.25μm和0.125μm，设置病毒对照组，放置于37℃、5％co2培养箱中培养；
[0163]
4)48h后，用荧光素酶底物试剂进行假病毒感染检测。
[0164]
2、试验结果：
[0165]
从图5和图6中可以看出，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱对sars-cov-2以及sars-cov假病毒的抑制效果呈剂量依赖性。其中，莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱对sars-cov-2假病毒的半数最大抑制剂量浓度(ic
50
)分别为0.28μm、0.27μm和0.29μm，对sars-cov假病毒
的半数最大抑制剂量浓度(ic
50
)分别为0.13μm、0.14μm和0.15μm。