免疫层析法的制作方法

本发明涉及一种免疫层析法。
背景技术：
由于免疫层析法的操作简便且能够在短时间内进行测定，因此近来被频繁利用。例如，在用免疫层析法检测流感病毒等抗原的情况下，进行如下操作。首先，准备用抗体修饰的标记(标记抗体)，并与含有抗原的试样混合。标记抗体与抗原结合，形成复合体。在该状态下，当在具有涂布有与抗原特异性反应的抗体的检测线的不溶性载体上展开时，复合体在检测线(测试线)上与抗体反应而被捕捉，通过肉眼等确认检测。作为这种免疫层析法，例如可举出专利文献1中公开的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第5728453号公报技术实现要素：发明要解决的技术课题近来，在期待更高灵敏度的免疫诊断法的情况下，对于免疫层析法也要求比以往的方法(例如，专利文献1中公开的方法)更高灵敏度的方法。因此，鉴于上述情况，本发明的目的在于提供检测灵敏度高的免疫层析法。用于解决技术课题的手段本发明人等对上述课题进行深入研究，结果发现，通过进行使用磁性的规定的预处理，并且改变在各工序中使用的单克隆抗体的种类，能够解决上述课题，从而完成了本发明。即，本发明人等发现通过以下结构能够解决上述课题。(1)一种免疫层析法，其包括：混合工序，通过混合可含有抗原的试样和用与上述抗原具有特异性亲和性的单克隆抗体X修饰的磁性粒子即修饰磁性粒子，获得含有作为上述抗原和上述修饰磁性粒子的复合体的磁性粒子复合体的混合物；捕集工序，使用磁性捕集含有上述磁性粒子复合体的混合物中的磁性粒子；离解工序，通过混合在上述捕集工序中捕集到的磁性粒子和作为酸性或碱性液体的离解液，使上述修饰磁性粒子从上述磁性粒子复合体离解，获得含抗原的液体；中和工序，通过使用中和液中和上述含抗原的液体，获得含中和抗原的液体；展开工序，在形成作为上述含中和抗原的液体中的抗原和用能够与上述抗原结合的单克隆抗体Y修饰的金粒子即修饰金粒子的复合体的金粒子复合体的状态下，在具有固定有能够与上述抗原结合的单克隆抗体Z的反应部位的不溶性载体上展开；捕捉工序，在上述不溶性载体的反应部位捕捉上述金粒子复合体；及银扩增工序，对在上述捕捉工序中捕捉到的金粒子复合体进行银扩增，上述单克隆抗体X与上述单克隆抗体Y彼此不同，上述单克隆抗体X与上述单克隆抗体Z彼此不同。(2)根据上述(1)所述的免疫层析法，其中，上述单克隆抗体X、上述单克隆抗体Y及上述单克隆抗体Z均不同。(3)根据上述(1)或(2)所述的免疫层析法，其中，上述离解液是比上述可含有抗原的试样少量的作为酸性或碱性液体的离解液。(4)根据上述(3)所述的免疫层析法，其中，上述离解液相对于上述可含有抗原的试样的比例以质量比计为1/5以下。(5)根据上述(1)至(4)中任一项所述的免疫层析法，其中，上述离解液含有NaOH或HCl。(6)根据上述(1)至(5)中任一项所述的免疫层析法，其中，上述中和液含有HCl和选自由三(羟甲基)甲基甘氨酸、TRIS、HEPES、乙酰胺甘氨酸、甘氨酰胺及N,N-二羟乙基甘氨酸组成的组中的至少一种或含有NaOH和选自由三(羟甲基)甲基甘氨酸、TRIS、HEPES、乙酰胺甘氨酸、甘氨酰胺及N,N-二羟乙基甘氨酸组成的组中的至少一种。(7)根据上述(1)至(6)中任一项所述的免疫层析法，其中，修饰前的上述磁性粒子的粒径为0.05μm～10μm。发明效果如下所述，根据本发明，能够提供检测灵敏度高的免疫层析法。附图说明图1是本发明的方法中使用的不溶性载体的一个方式的示意图。具体实施方式以下，对本发明的免疫层析法进行说明。另外，在本说明书中，使用“～”表示的数值范围是指将记载于“～”的前后的数值作为下限值及上限值而包含的范围。并且，在本说明书中，各成分可以单独使用一种，也可以同时使用两种以上。在此，在对各成分同时使用两种以上的情况下，只要没有特别说明，该成分的含量是指合计含量。并且，在本说明书中，将“检测灵敏度及S/N比(信号/噪声比)进一步提高”也称为“本发明的效果等更优异”。本发明的免疫层析法(以下，也称为“本发明的方法”)是一种免疫层析法，其包括：混合工序，通过混合可含有抗原的试样和用与上述抗原具有特异性亲和性的单克隆抗体X修饰的磁性粒子即修饰磁性粒子，获得含有作为上述抗原和上述修饰磁性粒子的复合体的磁性粒子复合体的混合物；捕集工序，使用磁性捕集含有上述磁性粒子复合体的混合物中的磁性粒子；离解工序，通过混合在上述捕集工序中捕集到的磁性粒子和作为酸性或碱性液体的离解液，使上述修饰磁性粒子从上述磁性粒子复合体离解，获得含抗原的液体；中和工序，通过使用中和液中和上述含抗原的液体，获得含中和抗原的液体；展开工序，在形成作为上述含中和抗原的液体中的抗原和用能够与上述抗原结合的单克隆抗体Y修饰的金粒子即修饰金粒子的复合体的金粒子复合体的状态下，在具有固定有能够与上述抗原结合的单克隆抗体Z的反应部位的不溶性载体上展开；捕捉工序，在上述不溶性载体的反应部位捕捉上述金粒子复合体；及银扩增工序，对在上述捕捉工序中捕捉到的金粒子复合体进行银扩增，上述单克隆抗体X与上述单克隆抗体Y彼此不同，上述单克隆抗体X与上述单克隆抗体Z彼此不同。如上所述，在本发明的方法中，进行使用磁性的规定的预处理(混合工序、捕集工序、离解工序、中和工序)，并且使在特定的工序中使用的单克隆抗体的种类不同。由于本发明的方法采用这种结构，因此推测能够获得上述效果。尤其，认为特征在于，上述预处理中使用的单克隆抗体X与在展开工序中使用的单克隆抗体Y和/或单克隆抗体Z不同。根据本发明人等的研究可知，在使用单克隆抗体修饰的磁性粒子(修饰磁性粒子)与抗原反应，在浓缩等操作后使修饰磁性粒子离解而获得含抗原的液体(尤其，抗原浓缩液)的情况下，液体中残留所离解的修饰磁性粒子，有时阻碍免疫层析法的抗原抗体反应。本发明的方法基于上述见解等。即，在本发明的方法中，在上述预处理中使用的单克隆抗体与在免疫层析法(展开工序)中使用的单克隆抗体不同。因此，推测即使所离解的修饰磁性粒子(用单克隆抗体修饰的磁性粒子)与抗原再次反应，也不会阻碍免疫层析法的抗原抗体反应，能够获得较高的检测灵敏度。以下，对本发明的方法所包括的各工序进行说明。另外，将从混合工序到中和工序总称为“磁性粒子工艺”。[混合工序]混合工序是通过混合可含有抗原的试样和用与上述抗原具有特异性亲和性的单克隆抗体X修饰的磁性粒子即修饰磁性粒子，获得含有作为上述抗原和上述修饰磁性粒子的复合体的磁性粒子复合体的混合物的工序。〔试样〕在混合工序中使用的试样只要是可含有抗原的试样，则没有特别限制。作为这种试样，例如能够举出生物学试样，尤其动物(尤其人)的体液(例如，血液、血清、血浆、脑脊液、泪液、汗、尿、脓、鼻涕或痰液)或排泄物(例如，粪便)、器官、组织、粘膜或皮肤、认为含有它们的刮擦被检体(拭子)、漱口液、或动植物本身或它们的干燥体。＜抗原＞作为抗原，例如可举出菌、细菌(例如，结核菌、结核菌所含有的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM))、细菌、病毒(例如，流感病毒)或它们的核蛋白质等。另外，LAM是结核中的主要抗原，是细胞膜及细胞壁的主要构成成分即糖脂。从本发明的效果等更优异的理由考虑，抗原优选为病毒或LAM，更优选为病毒，进一步优选为流感病毒。＜试样的预处理＞上述试样能够直接使用试样，或以使用适当的提取用溶剂提取抗原而获得的提取液的形式，进而以将提取液用适当的稀释剂稀释而获得的稀释液的形式、或以将提取液用适当的方法浓缩的形式使用。作为上述提取用溶剂，也能够使用通常的免疫学分析法中使用的溶剂(例如，水、生理食盐水或缓冲液等)，或者通过利用该溶剂稀释而能够直接实施抗原抗体反应的水混和性有机溶剂。〔修饰磁性粒子〕上述修饰磁性粒子是用与上述抗原具有特异性亲和性的单克隆抗体X修饰的磁性粒子。＜磁性粒子＞上述磁性粒子的材料只要是具有磁性的材料，则没有特别限制，作为具体例，可举出铁、钴、镍、它们的氧化物、铁氧体及它们的合金等。其中，从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选为氧化铁。磁性粒子可以是将具有磁性的材料单独成型为粒子状的粒子，也可以是以具有磁性的材料为芯，用高分子(例如，聚苯乙烯、硅胶等)等包覆其表面的粒子或使用具有磁性的材料，以高分子等为芯包覆其表面的粒子。(粒径)磁性粒子的粒径没有特别限制，但从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选为0.05μm～10μm，更优选为0.1μm～5μm。另外，粒径能够用市售的粒度分布计等进行测量。作为粒度分布的测定法，已知有光学显微镜法、共焦激光显微镜法、电子显微镜法、原子间力显微镜法、静态光散射法、激光衍射法、动态光散射法、离心沉降法、电脉冲测量法、层析法、超声波衰减法等，与各个原理对应的装置已有市售。作为粒径的测定方法，从粒径范围及测定的容易度考虑，能够优选使用动态光散射法。作为使用了动态光散射的市售的测定装置，可举出NANOTRACUPA(NikkisoCo.,Ltd.)、动态光散射式粒径分布测定装置LB-550(HORIBA,Ltd.)、浓厚系粒径分析仪FPAR-1000(OTSUKAELECTRONICSCo.,LTD)等，在本发明中，作为在25℃的测定温度下测定的中值粒径(d＝50)的值求出。＜单克隆抗体X＞单克隆抗体X是与上述抗原具有特异性亲和性的单克隆抗体，是与后述的单克隆抗体Y及单克隆抗体Z不同的单克隆抗体。单克隆抗体例如能够使用通过使用被抗原免疫的动物的脾脏细胞的细胞融合而获得的单克隆抗体、或者它们的片段[例如，F(ab’)2、Fab、Fab’、或Fv]。这些抗体的制备能够通过常规方法进行。＜修饰磁性粒子的制造方法＞制造上述修饰磁性粒子的方法没有特别限制，能够使用公知的方法。例如，可举出用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)使磁性粒子活性化，使单克隆抗体X担载在磁性粒子上的方法等。〔混合〕在上述混合工序中，将上述试样和上述修饰磁性粒子进行混合。由此，在上述试样含有抗原的情况下，试样中的抗原与上述修饰磁性粒子的与上述抗原具有特异性亲和性的单克隆抗体X反应，在上述试样中形成抗原和上述修饰磁性粒子的复合体。另一方面，在上述试样不含有抗原的情况下，不形成复合体。[捕集工序]捕集工序是使用磁性捕集含有上述混合工序后的磁性粒子复合体的混合物中的磁性粒子的工序。其中，“捕集混合物中的磁性粒子”是指“捕集混合物中的磁性粒子复合体以及残留在混合物中的磁性粒子(未被修饰的磁性粒子)及修饰磁性粒子”。使用磁性捕集上述混合工序后的混合物中的磁性粒子方法没有特别限制，例如可举出向设置于磁性支架上的锥形(円錐形)管中加入上述混合工序后的混合物，用磁性收集上述磁性粒子复合体，然后提取剩余的试样的方法等。[离解工序]离解工序是通过混合在上述捕集工序中捕集到的磁性粒子和作为碱性或酸性液体的离解液，使上述修饰磁性粒子从上述磁性粒子复合体离解，获得含抗原的液体的工序。在离解工序中，修饰磁性粒子通过离解液从磁性粒子复合体(抗原和修饰磁性粒子的复合体)离解，分离成抗原和修饰磁性粒子。作为结果，获得作为含有抗原的离解液的含抗原的液体。〔离解液〕离解液只要是碱性或酸性液体，则没有特别限制。上述碱性液体没有特别限制，作为具体例，可举出NaOH水溶液、KOH水溶液等。其中，从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选为NaOH水溶液。上述酸性液体没有特别限制，作为具体例，可举出HCl水溶液、H2SO4水溶液、HNO3水溶液等。其中，从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选为HCl水溶液。从本发明的效果等更优异的理由考虑，离解液优选为碱性液体。从本发明的效果等更优异的理由考虑，离解液优选含有NaOH或HCl，更优选含有NaOH，进一步优选为NaOH水溶液。＜量＞离解液的量没有特别限制，但从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选离解液的量少于在上述混合工序中使用的“可含有抗原的试样”的量。在离解液的量少于在上述混合工序中使用的“可含有抗原的试样”的量的情况下，离解液中的抗原的浓度高于在上述混合工序中使用的“可含有抗原的试样”中的抗原的浓度。即，通过离解工序获得的含抗原的液体成为抗原的浓度被浓缩的液体(抗原浓缩液)。从本发明的效果等更优异的理由考虑，离解液相对于在上述混合工序中使用的“可含有抗原的试样”的比例以质量比计优选为1/5以下，更优选为1/10以下，进一步优选为1/20以下。[中和工序]中和工序是通过使用中和液中和在上述离解工序中获得的含抗原的液体，获得含中和抗原的液体的工序。在上述离解工序中，由于用作为碱性或酸性液体的离解液来离解，因此在离解工序中获得的含抗原的液体通常为碱性或酸性。另一方面，在将碱性或酸性液体用于后述的展开工序的情况下，后述的单克隆抗体Y或单克隆抗体Z改性，有时导致检测灵敏度下降。因此，在中和工序中，使用中和液中和含抗原的液体。〔中和液〕中和液没有特别限制，例如能够使用公知的缓冲液。从本发明的效果等更优异的理由考虑，在上述离解工序中使用的离解液为碱性液体的情况下，中和液优选含有HCl(尤其，1MHCl)和选自由三(羟甲基)甲基甘氨酸、TRIS、HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid)、乙酰胺甘氨酸、甘氨酰胺及N,N-二羟乙基甘氨酸组成的组中的至少一种，在上述离解工序中使用的离解液为酸性液体的情况下，优选含有NaOH(尤其，1MNaOH)和选自由三(羟甲基)甲基甘氨酸、TRIS、HEPES、乙酰胺甘氨酸、甘氨酰胺及N,N-二羟乙基甘氨酸组成的组中的至少一种。[展开工序]展开工序是在形成作为在上述中和工序中获得的含中和抗原的液体中的抗原和用能够与上述抗原结合的单克隆抗体Y修饰的金粒子即修饰金粒子的复合体的金粒子复合体的状态下，在具有固定有能够与上述抗原结合的单克隆抗体Z的反应部位的不溶性载体上展开的工序。〔金粒子复合体〕如上所述，在展开工序中，首先，形成作为在上述中和工序中获得的含中和抗原的液体中的抗原和用能够与上述抗原结合的单克隆抗体Y修饰的金粒子即修饰金粒子的复合体的金粒子复合体。＜修饰金粒子＞修饰金粒子是用能够与上述抗原结合的单克隆抗体Y修饰的金粒子。(金粒子)金粒子没有特别限制。金粒子在后述的银扩增工序中作为还原银离子的催化剂发挥作用。从本发明的效果等更优异的理由考虑，上述金粒子的粒径优选为100nm以下，更优选为50nm以下，进一步优选为30nm以下，尤其优选为15nm以下。上述金粒子的粒径的下限没有特别限制，但从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选为1nm以上，更优选为2nm以上，进一步优选为5nm以上。另外，金粒子的粒径能够用与上述磁性粒子相同的方法求出。(单克隆抗体Y)单克隆抗体Y是能够与上述抗原结合的单克隆抗体，只要是与上述单克隆抗体X不同的单克隆抗体，则没有特别限制。单克隆抗体Y的具体例及优选的方式与上述单克隆抗体X相同。(修饰金粒子的制造方法)制造上述修饰金粒子的方法没有特别限制，能够使用公知的方法。例如，可举出通过利用金与SH基化学键合，将SH基导入到单克隆抗体Y后，用在与金粒子接近时，SH键断裂而在Au表面上生成的Au-S键进行固定等的化学键合方法。〔不溶性载体〕上述不溶性载体是具有反应部位(测试线)的不溶性载体，该反应部位(测试线)上固定有能够与上述抗原结合的单克隆抗体Z。不溶性载体可以根据抗原的种类具有多个测试线(例如，流感A型病毒用测试线和流感B型用测试线)。并且，为了确认上述金粒子复合体的展开，不溶性载体可以在比测试线更靠下游侧具有控制线。并且，在后述的银扩增工序中使用还原剂液的情况下，为了检测还原剂液，可以在比测试线更靠下游侧具有显色试剂固定化线。作为上述不溶性载体的具体的方式，例如，如图1所示，可举出从上游侧起具有金胶体保持垫10、测试线20、控制线30、显色试剂固定化线40的硝基纤维素膜100。其中，金胶体保持垫10是保持用单克隆抗体Y修饰的金粒子(修饰金粒子)的垫片，测试线20是固定有单克隆抗体Z的线，控制线30是用于确认展开的线，显色试剂固定化线40是用于检测后述的还原剂液的线。在此，上游侧、下游侧是指在金粒子复合体展开时，表示从上游侧向下游侧展开的记载。作为上述不溶性载体(或具有该不溶性载体的免疫层析试剂盒)的具体的方式，例如可举出日本专利第5728453号公报中记载的不溶性载体及免疫层析试剂盒。并且，关于不溶性载体及免疫层析试剂盒的日本专利第5728453号公报中记载的内容全部作为本说明书的公开的一部分引用于本说明书中。＜不溶性载体＞不溶性载体优选为多孔性载体。尤其，从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选为硝基纤维素膜(硝基纤维素膜)、纤维素膜、乙酰纤维素膜、聚砜膜、聚醚砜膜、尼龙膜、玻璃纤维、无纺布、布、或丝等，更优选为硝基纤维素膜。＜单克隆抗体Z＞单克隆抗体Z是能够与上述抗原结合的单克隆抗体，只要是与上述单克隆抗体X不同的单克隆抗体，则没有特别限制。单克隆抗体Z的具体例及优选的方式与上述单克隆抗体X相同。〔展开〕在形成金粒子复合体的状态下在具有测试线的不溶性载体上展开的方法没有特别限制，例如可举出准备如上述图1所示的硝基纤维素膜100(或具有该硝基纤维素膜100的免疫层析试剂盒)，将在上述中和工序中获得的含中和抗原的液体滴加到金胶体保持垫上，如图1所示利用毛细管现象使其从上游侧向下游侧移动的方法等。[捕捉工序]捕捉工序是在上述不溶性载体的反应部位捕捉上述金粒子复合体的工序。如上所述，由于在不溶性载体的反应部位固定有能够与抗原结合的单克隆抗体Z，因此在上述展开工序中在不溶性载体上展开的金粒子复合体(抗原和修饰金粒子的复合体)在不溶性载体的反应部位(测试线)被捕捉。另外，在试样不含有抗原的情况下，不形成上述金粒子复合体，因此金粒子复合体在不溶性载体的反应部位不会被捕捉。[银扩增工序]银扩增工序是对在上述捕捉工序中捕捉到的金粒子复合体进行银扩增的工序。银扩增工序是通过对上述捕捉工序后的不溶性载体赋予银离子，在不溶性载体的反应部位捕捉到的金粒子复合体中形成大的银粒子的工序。更详细而言，是将上述金粒子复合体的金粒子作为催化剂还原银离子，形成银粒子(例如，直径10μm以上)的工序。由此，所捕捉到的金粒子复合体的检测灵敏度显著提高。〔优选的方式〕对上述捕捉工序后的不溶性载体赋予银离子的方法没有特别限制，但从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选使用下述还原剂液及下述银扩增液的方法。并且，除了还原剂液及银扩增液以外，为了通过特异性的结合反应以外清洗残留在不溶性载体中的复合体，也可以使用清洗液。上述还原剂液也可以兼作清洗液。＜还原剂液＞上述还原剂液含有能够还原银离子的还原剂。能够还原银离子的还原剂只要能够将银离子还原为银，则能够使用无机·有机的任何材料或其混合物。作为无机还原剂，能够优选举出通过Fe2 、V2 及Ti3 等金属离子能够改变化合价的还原性金属盐、还原性金属络合物盐。在使用无机还原剂时，需要将被氧化的离子进行络合形成或进行还原而去除或使之无害。例如，在使用Fe2 作为还原剂的体系中，能够使用柠檬酸或乙二胺四乙酸(EDTA)形成作为氧化物的Fe3 的络合物，使其无害。在本发明中，优选使用这种无机还原剂，作为本发明的更优选的方式，优选使用Fe2 的金属盐作为还原剂。另外，在湿式卤化银照片感光材料中使用的显影主剂(例如没食子酸甲酯盐、氢醌、取代氢醌、3-吡唑烷酮类、对氨基苯酚类、对苯二胺类、受阻酚类、偕胺肟类、吖嗪类、儿茶酚类、连苯三酚类、抗坏血酸(或其衍生物)及无色染料类)及对于本领域的技术熟练者而言很明显的其他材料，例如在美国专利第6,020,117号中记载的材料与能够作为还原剂使用。作为还原剂，也优选为抗坏血酸还原剂。有用的抗坏血酸还原剂含有抗坏血酸及其类似物、异构体及其衍生物，能够优选举出例如D-或L-抗坏血酸及其糖衍生物(例如γ-乳糖酸抗坏血酸、葡糖酸抗坏血酸、藻酸抗坏血酸、葡庚糖酸抗坏血酸、麦芽糖酸抗坏血酸)、抗坏血酸的钠盐、抗坏血酸的钾盐、异抗坏血酸(或L-红霉素抗坏血酸)及其盐(例如碱金属盐、铵盐或该
技术领域：
中已知的盐)、烯二醇型抗坏血酸、烯胺醇型抗坏血酸、硫醇烯醇型抗坏血酸等，尤其优选D、L或D，L-抗坏血酸(及其碱金属盐)或异抗坏血酸(或其碱金属盐)，钠盐为优选的盐。根据需要，能够使用这些还原剂的混合物。从本发明的效果等更优异的理由考虑，还原剂液优选以展开工序中的展开方向与还原剂液的展开方向之间的角度成为0度～150度的方式流动，更优选以展开工序中的展开方向与还原剂液的展开方向之间的角度成为0度～135度的方式流动。另外，作为调节展开工序中的展开方向与还原剂液的展开方向之间的角度的方法，例如可举出日本特开2009-150869号公报的实施例中记载的方法等。＜银扩增液＞上述银扩增液是含有包含银离子的化合物的液体。作为含有银的化合物，例如能够使用有机银盐、无机银盐或银络合物。优选可举出作为在水等溶剂中溶解度高的含银离子的化合物的硝酸银、乙酸银、乳酸银、丁酸银及硫代硫酸银等。尤其优选为硝酸银。作为银络合物，优选在具有羟基和砜基等水溶性基团的配体上配位的银络合物，可举出羟基硫醚银等。有机银盐、无机银盐或银络合物作为银在银扩增液中以0.001mol/L～5mol/L的浓度含有，优选为以0.005mol/L～3mol/L的浓度含有，更优选为以0.01mol/L～1mol/L的浓度含有。作为银扩增液的助剂，可举出缓冲剂、防腐剂，例如抗氧化剂或有机稳定剂、速度调节剂等。作为缓冲剂，例如能够使用乙酸、柠檬酸、氢氧化钠或这些盐中的一种、或使用三(羟甲基)氨基甲烷的缓冲剂、其他通常的化学实验中使用的缓冲剂。适当使用这些缓冲剂，能够将其调节至最适合其扩增溶液的pH。并且，作为防雾剂，能够使用烷基胺作为助剂，尤其优选为十二烷基胺。并且，为了提高这些助剂的溶解性，能够使用表面活性剂，尤其优选为C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50H。从本发明的效果等更优异的理由考虑，银扩增液优选从与上述展开工序相反的方向流动，更优选以展开工序中的展开方向与还原剂液的展开方向之间的角度成为45度～180度的方式流动。另外，作为调节展开工序中的展开方向与银扩增液的展开方向之间的角度的方法，例如可举出日本特开2009-150869号公报的实施例中记载的方法等。[单克隆抗体]如上所述，单克隆抗体X与单克隆抗体Y彼此不同，单克隆抗体X与单克隆抗体Z彼此不同。单克隆抗体Y与单克隆抗体Z可以相同，也可以不同，但从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选不同。在该情况下，单克隆抗体X、单克隆抗体Y及单克隆抗体Z均为不同的单克隆抗体。从本发明的效果等更优异的理由考虑，单克隆抗体X的表位与单克隆抗体Y的表位优选彼此不同。从本发明的效果等更优异的理由考虑，单克隆抗体X的表位与单克隆抗体Z的表位优选彼此不同。单克隆抗体Y的表位与单克隆抗体Z的表位可以相同，也可以不同，但从本发明的效果等更优异的理由考虑，优选不同。在该情况下，单克隆抗体X的表位、单克隆抗体Y的表位以及单克隆抗体Z的表位均不同。另外，单克隆抗体的表位不同能够通过例如ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay：酶联免疫物质分析)来确认。实施例以下，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定于此。[被检体液的制备]使用QuickS-InfluA·B“生研”阴性/阳性对照液(产品编号；322968、DENKASEIKENCo.,Ltd.制造)制备出被检体液(可含有抗原的试样)。具体而言，将上述阳性对照液用含有1质量％BSA(BovineSerumAlbumin)的PBS(Phosphatebufferedsalts)缓冲液各稀释10倍，制成各稀释率的被检体液(可含有抗原的试样)。另外，市售的免疫检测试剂盒“CapilliaFluA B”(AlfresaPharmaCorporation制造)的检测极限(最小检测灵敏度)在A型B型中均为1/40。[实施例1]如下进行了实施例1的免疫层析法。〔混合工序〕用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)使ThermoFisherScientificInc.制造的磁性粒子(DynabeadsMyOne-COOH，粒径：1μm，ThermoFisherScientificInc.制造)活性化，使抗流感A型单克隆抗体(Funakoshi、#GTX629544)担载在磁性粒子上，获得了用抗流感A型单克隆抗体(单克隆抗体X)修饰的磁性粒子即修饰磁性粒子。向15mL的锥形管加入上述被检体液(6mL)，在其中加入1mg上述修饰磁性粒子，搅拌40分钟并且使其反应。如此，获得了含有作为流感A型病毒和上述修饰磁性粒子的复合体的磁性粒子复合体的混合物。〔捕集工序〕反应后，将锥形管设置在磁铁支架上，将磁性粒子(未被修饰的磁性粒子、修饰磁性粒子、磁性粒子复合体)集磁10分钟。通过用吸液管(Eppendorf公司制造)从锥形管提取剩余的被检体液，捕集上述磁性粒子(未被修饰的磁性粒子、修饰磁性粒子、磁性粒子复合体)。〔离解工序〕立即添加50mMNaOH水溶液(碱性液体)200μL。添加后，进行5分钟超声波处理，静置60分钟。如此，使修饰磁性粒子从磁性粒子复合体离解。静置后，再次将锥形管设置在磁铁支架上，将所离解的修饰磁性粒子集磁10分钟，回收上清液(含流感A型病毒的液体)(含抗原的液体)。〔中和工序〕使用10mMTRISHCl10μL作为中和液，中和上述含流感A型病毒的液体，获得了含中和流感A型病毒的液体(含中和抗原的液体)。〔展开工序〕如图1所示，准备从上游侧起具有金胶体保持垫10、测试线20、控制线30、显色试剂固定化线40的硝基纤维素膜100。另外，金胶体保持垫10是保持用抗流感A型单克隆抗体(Anti-InfluenzaASPTN-57307，MedixBiochemica公司)(单克隆抗体Y)修饰的金胶体(修饰金粒子)的垫片，测试线20是固定有抗流感A型单克隆抗体(Anti-InfluenzaASPTN-57307，MedixBiochemica公司)(单克隆抗体Z)的线，控制线30是用于确认展开的线，显色试剂固定化线40是用于检测后述的还原液的线。将上述含中和流感A型病毒的液体滴加到金胶体保持垫上。由此，形成了作为液体中的流感A型病毒和金胶体保持垫中的用抗流感A型单克隆抗体(单克隆抗体Y)修饰的金胶体粒子(修饰金粒子)的复合体的金粒子复合体。在该状态下，向上述硝基纤维素膜的下游侧展开。〔捕捉工序〕在展开工序中展开的金粒子复合体在测试线上被捕捉。〔银扩增工序〕如下实施了银扩增工序。＜还原剂液的制备＞在290g水中溶解了通过将硝酸铁(III)九水合物(FUJIFILMWakoPureChemicalCorporation制造)溶解于水中而制作的1mol/L硝酸铁水溶液23.6mL及柠檬酸(FUJIFILMWakoPureChemicalCorporation制造)13.1g。全部溶解后，一边用搅拌器搅拌，一边加入硝酸(10质量％)36mL，并且加入硫酸铵铁(II)六水合物(FUJIFILMWakoPureChemicalCorporation制造)60.8g，将其作为还原剂液。＜银扩增液的制备＞在水66g中添加了硝酸银溶液8mL(含有10g硝酸银)和1mol/L硝酸铁水溶液24mL。此外，将该溶液与预先在47.6g水中溶解硝酸(10质量％)5.9mL、十二烷基胺(FUJIFILMWakoPureChemicalCorporation制造)0.1g、表面活性剂C12H25-C6H4-O-(CH2CH2O)50H0.1g而成的溶液进行混合，将其作为银扩增液。＜还原剂液的展开＞在硝基纤维素膜中，使如上所述制备的还原剂液从与上述展开工序相同的方向(从更上游侧)流动。＜银扩增液的展开＞在显色试剂固定化线变色后，使如上所述制备的银扩增液从与展开工序中的展开方向相反的方向(从下游侧)流动。如此，对在测试线上捕捉到的金粒子复合体进行了银扩增。〔评价〕通过肉眼确认测试线的着色，并调查了确认到着色的最小的稀释率(最小检测灵敏度)。将结果示于表1。最小检测灵敏度越小，表示即使是抗原的浓度淡的试样也能够检测抗原，并且表示检测灵敏度越高。[比较例1]不进行从混合工序到中和工序，在展开工序中使用上述被检体液本身来代替含中和流感A型病毒的液体，除此以外，按照与实施例1相同的步骤实施免疫层析法，进行了评价。将结果示于表1。[比较例1]作为单克隆抗体X使用抗流感A型单克隆抗体(Anti-InfluenzaASPTN-57307，MedixBiochemica公司)来代替抗流感A型单克隆抗体(Funakoshi，#GTX629544)，除此以外，按照与实施例1相同的步骤实施免疫层析法，进行了评价。将结果示于表1。在比较例2中，单克隆抗体X与单克隆抗体Y彼此相同，单克隆抗体X与单克隆抗体Z彼此相同。[表1]比较例1比较例2实施例1最小检测灵敏度1/201/16001/4800由表1可知，与未进行磁性粒子工艺的比较例1以及进行了磁性粒子工艺，但单克隆抗体X与单克隆抗体Y相同，且单克隆抗体X与单克隆抗体Z相同的比较例2相比，进行磁性粒子工艺且单克隆抗体X与单克隆抗体Y彼此不同，单克隆抗体X与单克隆抗体Z彼此不同的实施例1显示出较高的检测灵敏度。另外，作为单克隆抗体(单克隆抗体X、单克隆抗体Y、单克隆抗体Z)使用抗流感B型单克隆抗体来代替抗流感A型单克隆抗体，除此以外，以与上述实施例1及比较例1～2相同的方式实施免疫层析法，结果观察到与表1相同的倾向。符号说明10金胶体保持垫20测试线30控制线40显色试剂固定化线100硝基纤维素膜当前第1页12