包含哌乙酰嗪的抗肿瘤药物组合物及其应用

1.本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种包含哌乙酰嗪的抗肿瘤药物组合物及其应用。


背景技术：

2.肾癌（kidney cancer）是泌尿系统的三大恶性肿瘤之一。其中，肾细胞癌（renal cell carcinoma, rcc）是起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，占所有肾癌的90%，是最常见的肾脏恶性肿瘤类型。由于超声、ct等筛查手段的应用和人们健康体检意识的增强，肾癌的发病率有所增加，但早期的肾癌通过根治性手术治疗，预后较好。肾癌的总体5年生存率为49%，但其预后与疾病的临床分期以及病理分级都有很大关系，临床iii、iv期或病理3、4级的患者预后极差。
3.舒尼替尼（sunitinib，商品名为索坦（sutent））是一种口服的小分子多靶点受体酪氨酸激酶（rtk）抑制剂，其靶点包括血管内皮细胞生长因子受体1,2,3(vegf receptor, vegfr-1,2,3), 血小板生长因子受体α,β(pdgf receptor, pdgfr-α,β), c-kit等。根据已有的研究结果，舒尼替尼主要通过三种途径来发挥抗肿瘤效应：抑制肿瘤血管生成、破坏肿瘤血管以及直接杀伤肿瘤细胞。目前，舒尼替尼被批准用于治疗晚期转移性肾细胞癌和伊马替尼耐药的胃肠间质肿瘤(gastrointestinal stromal tumor, gist)，其是第一种被批准用于同时治疗两种类型癌症的药物。其它癌种如非小细胞肺癌、肠癌、骨肉瘤中也有相应的研究与临床试验正在进行。在肾癌领域，自2006年美国fda批准以来，舒尼替尼一直都是转移性肾癌的一线用药。
4.在靶向药出现以前，晚期肾癌的治疗主要以细胞因子为主。舒尼替尼问世后，它在体外及体内临床前研究中都表现出抗肿瘤效应。而且，经过长达十余年的观察，舒尼替尼的临床疗效已经得到证实。虽然舒尼替尼延缓了转移性肾癌的进展，改善了患者预后，但几乎所有的患者最终都会发生耐药，最终再次进展。据目前已有的研究报道，尽管各研究的评价标准略有差异，还是能看出，大约70%的患者一线治疗对舒尼替尼敏感，还有30%的患者对舒尼替尼表现出原发性的耐药。在敏感患者中，有效期通常只有6-15个月，此后就会发生获得性耐药，疾病进展。对于获得性耐药的机制，目前已有很多研究，总的可以分为以下几种：促血管生成信号激活、肿瘤微环境的改变、溶酶体的滞留、非编码rna的作用以及其它信号通路的激活。
5.同时，据舒尼替尼在西方国家患者中的临床试验（nct00083889）结果显示，98.13%的患者出现不良反应（adverse event，ae），其中治疗相关的严重不良反应（serious adverse event，sae）发生率为23.7%，发生率＞50%的的不良反应分别是腹泻（65.6%）、疲乏（62.4%）和恶心（57.6%）。在中国患者的临床试验（nct00706706）结果显示，ae发生率为97.14%，sae发生率为12.38%，发生率＞50%的不良反应分别是手足综合征（63.8%）、白细胞数减少（52.4%）、疲乏（51.4%）和血小板减少症（51.4%）。从以上研究结果中可以看出，舒尼替尼的不良反应较多且发生率高，这些不良反应严重影响了患者的生活质量，虽然他们大
多可以通过减少药物剂量和改变给药周期来缓解，但这又会伴随着抗肿瘤效果下降，从而使得舒尼替尼有较大的应用局限性。因此，如何逆转舒尼替尼的耐药性、提升低剂量下舒尼替尼的抗肿瘤效应、降低其毒副作用成为了亟待解决的技术难题。


技术实现要素：

6.针对上述存在问题和不足，本发明提供一种包含哌乙酰嗪的抗肿瘤药物组合物及其应用，通过将舒尼替尼与哌乙酰嗪联合使用，以解决现有技术中使用常规剂量舒尼替尼所带来的严重耐药性的问题以及降低治疗剂量后明显减低的治疗效果的问题，从而获得更为显著的临床治疗作用和降低的舒尼替尼耐药性及毒副作用。
7.本发明是通过如下技术方案得以实现的：本发明第一方面提供了一种包含哌乙酰嗪的抗肿瘤药物组合物，包括舒尼替尼或其药用盐以及哌乙酰嗪或其药用盐。
8.作为优选的，所述肿瘤选自肾癌、肺癌、肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌、胰腺癌中的一种或多种。
9.作为优选地，所述肿瘤选自肾癌。
10.本发明第二方面提供了一种包含哌乙酰嗪的抗肿瘤药物制剂，包括舒尼替尼或其药用盐以及哌乙酰嗪或其药用盐。
11.作为优选地，所述制剂剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、气雾剂、喷雾剂、膜剂、栓剂中的一种或多种。
12.作为优选地，所述药学上可接受的药用辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、防腐剂、抗氧剂、着色剂中的一种或多种。
13.作为优选的，所述肿瘤选自肾癌、肺癌、肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌、胰腺癌中的一种或多种。
14.作为优选地，所述肿瘤选自肾癌。
15.本发明第三方面提供了一种包含舒尼替尼或其药用盐以及哌乙酰嗪或其药用盐的药物组合物在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
16.作为优选的，所述肿瘤选自肾癌、肺癌、肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌、胰腺癌中的一种或多种。
17.作为优选地，所述肿瘤选自肾癌。
18.本发明第四方面提供了哌乙酰嗪或其药用盐在制备降低舒尼替尼抗肿瘤耐药性和/或提高舒尼替尼抗肿瘤治疗效果的产品中的应用。
19.作为优选的，作为优选的，所述肿瘤选自肾癌、肺癌、肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌、胰腺癌中的一种或多种。
20.作为优选地，所述肿瘤选自肾癌。
21.尽管临床上广泛使用舒尼替尼进行癌症的治疗，并能取得相对显著的成效，尤其在肾癌等疾病的治疗中已经作为一线药物使用。然而，患者预后的改善以及癌症进展的延缓都不能阻止患者对舒尼替尼耐药的产生，并最终导致疾病再次发生进展；且长期大量使用舒尼替尼，往往会产生非常严重的毒副作用，使得患者的生活质量大大降低。迄今为止，并未有较好的治疗方案出现以改善舒尼替尼的严重耐药性、降低的治疗效果以及严重的毒
副作用，从而使得其临床使用以及对患者的治疗效果大打折扣。
22.对于此，发明人进行了大量的研究，利用陶素公司的化合物库进行筛选，以期望能够获得改善舒尼替尼临床耐药性并能够获得与之产生相加甚至协同的治疗作用的化合物。在筛选过程中发现，在原有舒尼替尼基础上，进一步加入哌乙酰嗪与之联合使用，能够产生非常显著的协同作用（ci＜1）。
23.哌乙酰嗪（piperacetazine，cas：3819-00-9）是一种吩噻嗪类衍生物，又名：哌西他嗪；乙酰哌丙嗪；乙酰哌普嗪等，其药理作用与氯丙嗪相似，属于多巴胺受体拮抗剂，临床上主要用于精神病、镇吐、麻醉等疾病或症状的治疗及改善。目前尚无证据证明其具有抗肿瘤相关活性。本发明通过研究发现，哌乙酰嗪可以显著提高舒尼替尼对肿瘤细胞的敏感性，大大降低了舒尼替尼的ic
50
值，二者联合使用能够产生非常明显的协同效果。
24.本发明与现有技术相比，有如下有益效果：（1）本发明对现有的临床癌症治疗方案进行了改进，从大量化合物中进行筛选，从而获得了能够与舒尼替尼联合用药以显著降低其耐药性的化合物。
25.（2）本发明在原有舒尼替尼的基础上，进一步加入哌乙酰嗪，能够与之产生非常显著的协同增效作用，从而联合促进癌细胞的凋亡，同时能够明显抑制癌细胞的增殖，对癌细胞具有极为显著的杀伤效应。
26.（3）本发明所提供的药物组合物能够明显改善现有技术中单纯采用舒尼替尼所带来的严重耐药性问题以及在降低舒尼替尼常规使用量时明显减低的治疗效果的问题；有助于大大降低舒尼替尼的临床使用剂量而能够始终保持其良好的治疗效果、防止由于长期使用舒尼替尼而产生的耐药性；同时也可避免由于长期大剂量使用舒尼替尼而导致的严重不良反应，提高用药安全性和病人的生活质量，对于肿瘤疾病的临床治疗提供了新的方案，具有十分广阔的市场前景以及极其重大的社会意义。
附图说明
27.图1为体外肾癌786-o细胞联合用药指数实验结果示意图。
28.图2为体外肾癌caki-2细胞联合用药指数实验结果示意图。
29.图3为体外肾癌os-rc-2细胞联合用药指数实验结果示意图。
30.图4为体内原位肾癌小鼠模型构建及实验流程示意图。
31.图5为体内联合用药对小鼠肿瘤生长体积的影响结果示意图。
32.图6为体内联合用药对小鼠肾脏与肿瘤质量的影响结果示意图。
33.图7为体内联合用药对小鼠肾脏肿瘤负荷改善程度影响结果示意图。
34.图8为体内联合用药对小鼠体重影响结果示意图。
具体实施方式
35.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
36.在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括786-o、caki-2、os-rc-2、renca等细胞系从american type culture collection（atcc、manassas、va、usa）购入并根
据atcc指南进行培养。所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）的短串联重复分析鉴定，并使用pcr检测试剂盒（上海biothrive sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。
37.生物学重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean
±
sd和mean
±
sem展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验重复两次。数据采用graphpad prism 5.0或spss 20.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
38.实施例1 体外抗肿瘤协同实验（1）取对数生长期的786-o细胞按一定密度（1500-2000/孔）种于96孔板中；（2）24小时后弃旧培养基，将细胞分为1-5共5个小组进行使用，加入含有不同药物浓度的培养基，每组设3个复孔，其中组1加入舒尼替尼，组2加入哌乙酰嗪，组3加入舒尼替尼以及哌乙酰嗪，组4加入dmso，组5作为空白组；组1舒尼替尼初始浓度为100μm，此后每孔依次进行等比稀释；组2哌乙酰嗪初始浓度为100μm，此后每孔依次进行等比稀释；组3舒尼替尼及哌乙酰嗪初始浓度均为100μm，此后每孔依次进行等比稀释。
39.（3）培养48小时后弃药液，加入含5% cck-8的培养基，置于37℃中孵育3小时，然后用酶标仪检测450nm的od值。
40.以dmso组为基准，细胞存活率=（加药组od值-空白组od值）/（dmso组od值-空白组od值）
×
100%，比较各组细胞的存活情况，结果显示，在单独使用舒尼替尼的组1中，其ic
50
约为4.82μm，而在加入哌乙酰嗪后，舒尼替尼的ic
50
值得到显著的降低，为1.48μm，产生肿瘤细胞半数抑制时舒尼替尼使用量相较于单独使用时减少了约69.3%。
41.随后使用caki-2以及os-rc-2细胞重复上述实验。结果显示，对于caki-2细胞，其产生肿瘤细胞半数抑制时舒尼替尼使用量相较于单独使用时减少了约65.7%；对于os-rc-2细胞，其产生肿瘤细胞半数抑制时舒尼替尼使用量相较于单独使用时减少了约59.6%；由此可见，哌乙酰嗪的加入能够明显提升舒尼替尼对癌细胞的敏感性，从而大大降低舒尼替尼使用量。
42.进一步地，在上述细胞体外增殖抑制实验基础上，通过测定在786-o细胞在达到10%、30%、50%、70%以及90%抑制率时，单独用药（舒尼替尼或哌乙酰嗪）以及联合用药（舒尼替尼 哌乙酰嗪）时所需要的药物浓度，从而采用公式计算联合指数（combination index，ci），做出fa-ci曲线：其中ci计算公式如下：ci=d
1x
/d1 d
2x
/d2 （d
1x
·d2x
）/（d1·
d2）。
43.d
1x
：联合组达到某细胞抑制率时第1种药物的浓度；d
2x
：联合组达到某细胞抑制率时第2种药物的浓度；d1：单药组达到某细胞抑制率时第1种药物的浓度；d2：单药组达到某细胞抑制率时第2种药物的浓度。
44.当ci＜1说明两药联合表现出协同作用；当ci=1说明两药联合表现出相加作用；当ci＞1说明两药联合表现为拮抗作用。
45.结果如图1所示。结果表明，在786-o细胞中，哌乙酰嗪在各抑制率下均与舒尼替尼表现为协同效应，协同作用稳定。
46.随后，在原有786-o细胞基础上，选择caki-2以及os-rc-2细胞重复上述抗肿瘤协
同实验，实验结果如图2-3所示。结果表明，在对于caki-2细胞中，哌乙酰嗪几乎在各抑制率下都表现出了与舒尼替尼的协同抑制效果；对于os-rc-2细胞，哌乙酰嗪则在10%-70%抑制程度均与舒尼替尼表现为协同效应。
47.由此可见，哌乙酰嗪与舒尼替尼的协同作用稳定，功能明确，均能够与舒尼替尼实现非常显著的肿瘤细胞协同抑制作用。
48.实施例2 体外抗肿瘤协同配伍方式实验（1）取对数生长期的786-o、caki-2以及os-rc-2细胞按一定密度（1500-2000/孔）种于96孔板中；（2）24小时后弃旧培养基，加入含有不同配伍形式的药物继续培养，每组设置3个复孔；（3）培养48小时候，弃细胞培养液，加入含5% cck-8的培养基，置于37℃中孵育3小时，然后用酶标仪检测450nm的od值。
49.以dmso组为基准，对抑制率进行相应的协同效果评价，采用金氏公式对联合用药效应进行分析（q值）：q=e
(a b)
/(ea e
b-ea×
eb)，即，e
(a b)
：联合用药的抑制率，ea：a药单用的抑制率，eb：b药单用的抑制率。当q＞1.15时，表示两药为协同作用；0.85≤q≤1.15时，表示两药为相加作用；q＜0.85时，表示两药为拮抗作用。
50.表1 联合用药对肿瘤细胞增殖抑制的影响与联合指数评价由表1可以看到，对于三种肾癌细胞，单独使用舒尼替尼仅具有有限的活性抑制作用，单独使用哌乙酰嗪则无明显抑制活性；然而在舒尼替尼的基础上进一步联合使用哌乙酰嗪时，则能够显著提高舒尼替尼对肾癌细胞的抑制活性。
51.由此可以证明，哌乙酰嗪确实能够与舒尼替尼产生明显的抗肿瘤协同增效作用，从而有助于大大降低舒尼替尼的临床使用剂量而能够始终保持其高效的治疗效果、防止由于长期使用舒尼替尼尔产生的耐药性，同时也可避免由于长期大剂量使用舒尼替尼而导致的严重不良反应，提高用药安全性和病人的生活质量。此处应理解的是，在临床实际应该过
程中，基于对本发明基本原理和思路的了解，本领域技术人员根据肿瘤类型、病人年龄、并发症情况、其他基础疾病等因素，有能力对其中各药物的剂量、给药方式、给药频率等进行常规选择和调整，且对于各药物的剂量、给药方式、给药频率等因素不应作为对本发明的限制。
52.实施例3 体内抗肿瘤实验选择5-6周左右balb/c小鼠进行体内原位肿瘤生长抑制实验，具体实验方法如下：（1）体外培养鼠源肾癌renca细胞，收集对数期细胞离心、悬浮；（2）将细胞悬液注射至3只balb/c小鼠皮下，待其成瘤后，将瘤体取出，均分成5mm3左右大小的小瘤块；（3）将获得的小瘤块重新移植到若干新的balb/c小鼠肾包膜下；（4）待成瘤后，将24只裸鼠随机分为4组，编号为1-4，每组6只,进行灌胃给药；其中组1给药舒尼替尼-10mg/kg
·
d，组2给药哌乙酰嗪-10mg/kg
·
d，组3给药舒尼替尼-5mg/kg
·
d 哌乙酰嗪-5mg/kg
·
d，组4给予等量溶剂，连续给药5天，停药2天，以此作为一个给药周期，总共给药4个周期，每周测量一次肿瘤体积，治疗结束后称量小鼠重量，处死小鼠后取出肾脏，测量小鼠肿瘤体积及肾脏质量。
53.实验步骤流程参见图4，实验结果参见图5-8。
54.结果显示，单独使用舒尼替尼的组1小鼠肿瘤平均体积为662.7cm3，抑瘤率为31.52%（p＜0.01，vs 组4）；单独使用哌乙酰嗪的组2小鼠肿瘤平均体积为1030.0cm3，无明显抑瘤活性（n.s，vs 组4）；而对于舒尼替尼和哌乙酰嗪联合使用的组3，其组内小鼠肿瘤平均体积为252.4cm3，抑瘤率为73.9%（p＜0.0001，vs 组4）（参见图5）。
55.对肾脏和肿瘤的总质量分析发现，单独使用舒尼替尼的组1小鼠肾脏 肿瘤平均质量为0.742g，抑瘤率为37.17%（p＜0.05，vs 组4）；单独使用哌乙酰嗪的组2小鼠肾脏 肿瘤平均质量为1.181g，无明显抑瘤活性（n.s，vs 组4）；而对于舒尼替尼和哌乙酰嗪联合使用的组3，其组内小鼠肾脏 肿瘤平均质量为0.307g，抑瘤率为74.01%（p＜0.0001，vs 组4）（参见图6），该结果趋势与肿瘤体积基本一致。
56.随后对肾脏与小鼠体重比值进行分析发现，单独使用舒尼替尼的组1小鼠肾脏与体重比为0.0491，肾脏肿瘤负荷减轻程度为38.08%（p＜0.05，vs 组4）；单独使用哌乙酰嗪的组2小鼠肾脏与体重比为0.0491，无明显的肿瘤负荷减轻趋势（n.s，vs 组4）；而对于舒尼替尼和哌乙酰嗪联合使用的组3，其组内小鼠肾脏与体重比为0.0120，肾脏肿瘤负荷减轻程度为75.56%（p＜0.0001，vs 组4）（参见图7），该结果趋势与上述结果基本一致。
57.通过进一步对小鼠体重的分析发现（参见图8），各组小鼠均未出现明显降低，显示各组未产生明显的毒副作用。
58.根据上述结果可以明确，通过在舒尼替尼基础上进一步联合哌乙酰嗪，能够显著提高舒尼替尼的抗肿瘤活性，增加其抑瘤率，明显降低肾脏原位肿瘤的负荷程度，且舒尼替尼的使用量仅为组1的一半。
59.本发明在原有舒尼替尼的基础上，进一步加入哌乙酰嗪，能够与之产生非常显著的协同增效作用，从而明显抑制癌细胞的增殖，对癌细胞具有极为显著的杀伤效率。本发明所提供的药物组合物能够明显改善现有技术中单纯采用舒尼替尼所带来的严重耐药性问题以及在降低舒尼替尼常规使用量时明显减低的治疗效果的问题，大大提高了临床治疗效
率，降低患者的治疗毒副作用，对于临床治疗提供了新的方案，具有十分广阔的市场前景以及极其重大的社会意义。
60.以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。