柠檬烯在制备烟草种子萌发促进剂或抑制剂中的应用的制作方法

柠檬烯在制备烟草种子萌发促进剂或抑制剂中的应用
1.本技术是申请号为202010774068.0的发明专利的分案申请，原申请的申请日：2020-08-04；发明创造名称：万寿菊根茎活性成分及其在防治青枯菌中的应用。
技术领域
2.本发明属于生物技术领域，尤其涉及柠檬烯在制备烟草种子萌发促进剂或抑制剂中的应用。


背景技术：

3.烟草是我国主要的经济作物之一，由于烟田多年连作，化肥和农药大量施用，导致烟草病虫害，特别是土传病害严重，严重制约着烟草行业的健康发展。传统化学药剂的施用对烟草土传病害防效不佳，易发生抗药性，且容易造成药物残留等环境污染问题。
4.黑胫病(tobacco black shank)和青枯病(tobacco bacterial wilt)是烟草团棵、旺长期常见病害，其表现为烟株凋萎、叶片黄化、茎秆发黑。烟草青枯病常与烟草黑胫病、根结线虫病混合发生，严重时可导致全田烟草枯死，给烟农造成巨大的经济损失。开发并推广应用烟草土传病害生防菌剂，避免或减少化学药剂的施用，对降低烟草土传病害发生，保障烟农种植产量产值和烟农种植的积极性，以及降低环境污染，具有现实生产意义。植物源农药因具有无残留、低毒、不易产生抗药性，且易与其他药剂混配等优点，已成为近年来国内外研究的热点之一。
5.许多研究发现，万寿菊对多种病原微生物具有较好的抑制或毒杀作用。万寿菊在烟草土传病害防治，特别是青枯病，黑胫病等方面具有广泛的应用前景，深入研究万寿菊抗病机制尤为重要。已有研究主要集中在其不同部位粗提物对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响上，以及对粗提物处理的感病植株不同生长期与对照样品的一些生理生化指标差异性的测定上。而对于活性成分在植物体内的分布、具体理化性质、结构与活性的关系以及杀菌、抑菌作用机理等的研究基本上属于空白。并且万寿菊作为大面积种植的植物资源，采集部分大多为花部位，而占全株比重较大部分的非花部分一直没有得到较好的利用。
6.前人研究发现万寿菊的花对烟草根结线虫病具有较好的生物活性。实际生活中，万寿菊花一般用于提取叶黄素，且已得到了较好的应用。而叶茎根一般都会被同秸秆等一起焚烧，不仅污染环境，也造成了资源的极大浪费，因此在烟田烟草青枯病的生物防治中，充分研究利用万寿菊叶茎根的杀菌活性，阐明万寿菊提取物成份及成份中哪些物质具有抗菌效果，其结构组成是什么，如何能让其得到最大程度的利用等问题急需解决。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了柠檬烯在制备烟草种子萌发促进剂或抑制剂中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
8.本发明是这样实现的，一种青枯菌抑菌液的制备方法，包括将万寿菊根茎洗净烘
干，磨成粉末，使用石油醚或乙酸乙酯对粉末进行萃取，所述粉末与石油醚或乙酸乙酯的质量体积比为1:20，萃取时间为5h。
9.本发明还提供了一种青枯菌抑菌物的制备方法，包括将万寿菊根茎水提物过0.22μm滤膜，进行hplc法分离，配制乙腈 0.1％三氟乙酸(tfa)和水 0.1％三氟乙酸(tfa)作为流动相；色谱柱c18短柱；流速0.7ml/min；柱温25℃；紫外检测波长330nm；洗脱程序为：
[0010][0011]
收集39-46min的物质，得到青枯菌抑菌物。
[0012]
进一步地，所述青枯菌抑菌物包括柠檬烯、α-三联噻吩中的至少一种。
[0013]
进一步地，所述万寿菊根茎水提物的制备方法为，将万寿菊根茎粉末，放入蒸馏水中，30℃，230rpm摇床振荡2h后，放入超声波中振荡1h，随后放入50℃恒温水浴锅内水浴2h，最后放置过夜；滤膜过滤浸泡液，将过滤后的溶液放入低温浓缩仪中，得万寿菊根茎水提物。
[0014]
本发明还提供了柠檬烯在制备防治青枯菌的试剂中的应用。
[0015]
本发明还提供了α-三联噻吩在制备防治青枯菌的试剂中的应用。
[0016]
本发明还提供了柠檬烯在制备烟草种子萌发促进剂或抑制剂中的应用。
[0017]
本发明还提供了α-三联噻吩在制备烟草种子萌发抑制剂中的应用。
[0018]
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
[0019]
植物是生物活性化合物的天然宝库，其根、茎、叶和花中含有多种抑菌、杀菌的活性成分。目前已有从植物中提取抗真菌、细菌、病毒和线虫的有效成分，以及以分离纯化的单体物质为先导化合物加工而成的新型生物药剂。植物源抗菌剂因其来源于自然，具有易降解、低残留、与环境相容等特点，符合经济生态可持续发展的要求。因此，以植物为作用靶标，从中探寻新的活性先导化合物成为防治经济作物微生物疾病的重要途径，具有良好的发展契机和巨大的市场空间。
[0020]
万寿菊中存在多种抗菌、杀菌活性物质。已被报导的有光活化杀虫物质α-三联噻
吩和根提取物中的对西瓜枯萎病菌的抑菌物质等。本研究是提取万寿菊根茎的活性物质来抑制烟草的土传病害青枯病和黑胫病，旨在提高烟草产量，更好地研制植物抗菌剂。具有深远的意义。
[0021]
本发明研究了各种提取方法提取的万寿菊根茎中的活性物质对青枯菌的作用，确定万寿菊根茎中柠檬烯和α-三联噻吩为具有抑制青枯病的活性物质，并提供了相应的制备方法。由此奠定了植物源杀菌物质——万寿菊根茎提取物对烟草土传病害的防治基础。
附图说明
[0022]
图1是有机溶剂萃取万寿菊根茎后对hf-1-1的抑制作用；
[0023]
图2是万寿菊根茎叶gc-ms的离子峰图；
[0024]
图3是万寿菊根茎的乙醇和水提物对hf-1-1的平板抑菌实验；
[0025]
图4是万寿菊根茎水提取物tlc板分离结果；
[0026]
图5是经柱层析分离后tlc跑板验证；
[0027]
图6是万寿菊根茎水提物的hplc分离的离子峰图；
[0028]
图7是万寿菊水提物hplc分离产物对hf-1-1的抑制作用；
[0029]
图8是万寿菊根茎水提物的hplc分离的离子峰图；
[0030]
图9是物质1的红外谱图；
[0031]
图10是物质1的红外匹配图；
[0032]
图11是物质1的核磁氢谱图；
[0033]
图12是物质1的核磁碳谱图；
[0034]
图13是物质1的气相质谱总离子流图；
[0035]
图14是6.737min处峰的谱库匹配图；
[0036]
图15是物质1的元素分析结果；
[0037]
图16是扫描电镜图；
[0038]
图17是物质2的红外谱图；
[0039]
图18是物质2的红外匹配图；
[0040]
图19是物质2的核磁氢谱图；
[0041]
图20是物质2的核磁碳谱图；
[0042]
图21是物质2的气相质谱总离子流图；
[0043]
图22是18.201min处峰的谱库匹配图；
[0044]
图23是物质2的元素分析结果：
[0045]
图24是扫描电镜图；
[0046]
图25是柠檬烯对hf-1-1的平板抑菌实验；
[0047]
图26是α-三联噻吩和柠檬烯对hf-1-1的平板抑菌实验；
[0048]
图27是验证柠檬烯和α-三联噻吩对hf-1-1的抑菌作用；
[0049]
图28是不同柠檬烯用量对hf-1-1的抑制作用；
[0050]
图29是柠檬烯对hf-1-1生长的影响；
[0051]
图30是α-三联噻吩对hf-1-1生长的影响；
[0052]
图31是不同活性物质处理后烟草青枯病发病率和病情指数统计；di为发病率，di
为病情指数。
具体实施方式
[0053]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0054]
本发明披露柠檬烯在制备烟草种子萌发促进剂或抑制剂中的应用。本发明中使用的万寿菊为温室内种植的4-6个月大的万寿菊。本发明的具体内容如下各实施例所示。
[0055]
实施例1万寿菊根茎活性物质分析
[0056]
1、有机溶剂分析万寿菊根茎活性物质
[0057]
将万寿菊根茎洗净，烘干，磨成粉末。选取石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4种溶剂分别进行索氏提取。取4g根茎粉末和80ml溶剂用索氏提取器进行萃取，分别萃取5h。然后浓缩萃取液，在加有ttc的na固体培养基中加入1％的烟草青枯病病原菌hf-1-1发酵液，在平板上打出直径为5mm的孔，加入100μl溶剂萃取剂，将平板放置于37℃培养箱中12h，以各萃取液作为空白对照。观察平板生长状况。
[0058]
结果如图1所示，其中a为乙酸乙酯萃取液，b为石油醚萃取液，c为氯仿萃取液，d为石油醚萃取液，f为氯仿萃取液，g为乙酸乙酯萃取液。可知，石油醚，石油醚萃取液均对hf-1-1没有抑制作用；氯仿和氯仿萃取液对hf-1-1有一定的抑制作用，结合第一次的实验，推测氯仿或氯仿萃取液中的物质对hf-1-1起到作用；乙酸乙酯及其萃取液对hf-1-1没有明显的抑制作用。结合不同溶剂萃取液对青枯菌的抑制效果分析，石油醚萃取液对青枯菌的抑制率最高达到89.16％，乙酸乙酯萃取液对青枯菌的抑制率最高达89.59％。
[0059]
2、gc-ms法分析万寿菊不同部位活性物质
[0060]
将万寿菊连根拔起，洗净后，将根、茎、叶等不同部位放入无菌水中浸泡48h后，用乙酸乙酯萃取；萃取液真空浓缩成浸膏后，加入80μl 20mg/ml甲氧胺盐酸吡啶，超声波振荡5min后，放入37℃培养箱中肟化120min后加入10μl内标溶液和100μl mstfa溶液，放入60℃烘箱中衍生化3h，注射器过滤入衬管中，衬管放入气相瓶中，上样跑气质。gc条件：流速为1ml/min氦气，进口温度为235℃，离子源温度为250℃，接口温度为260℃，升温程序为50℃保持2min，以5℃/min的速度升到180℃，再以15℃/min的速度升到280℃，4.5min的溶剂切割时间消除溶剂峰。每个处理三个平行。
[0061]
结果如图2所示，其中a，b和c分别为万寿菊根，茎和叶的gc-ms离子峰图。万寿菊的根茎叶的离子峰分布存在较大差别。gc-ms分析结果表明万寿菊根、茎、叶和根系分泌物中含有许多植物天然成分，其中万寿菊根中主要包括：胺类、酯类、醛类、烷类、酮类、酸类、烯类、醇类、咪唑类、三嗪类、噻吩类和呋喃类，所占比例分别为3.144％，56.152％，0.136％，0.503％，1.054％，0.066％，0.003％，8.33％，0.005％，0.033％、30.21％和0.364％；万寿菊茎中中主要包括：胺类、酯类、醛类、烷类、酮类、酸类、烯类、醇类、咪唑类、三嗪类、噻吩类和呋喃类，所占比例分别为1.766％，43.339％，0.314％，11.908％，1.166％，0.19％，0.012％，11.869％，0.267％，0.055％，28.349％和0.765％；万寿菊叶中主要包括：胺类、酯类、醛类、烷类、酮类、酸类、烯类、醇类、咪唑类、三嗪类、噻吩类和呋喃类，所占比例分别为3.403％，42.948％，0.789％，15.321％，0.932％，0.837％，0.135％，18.045％，0.763％，
0.064％，3.045％和13.72％；万寿菊根系分泌物中主要包括：胺类、酯类、醛类、烷类、酮类、酸类、烯类、醇类、噻吩类、呋喃类和糖类，所占比例分别为5.149％，14.503％，0.502％，9.858％，0.307％，56.054％，0.127％，8.349％，2.668％，0.198％和2.286％。可知万寿菊的各个部位物质含量差异较大。
[0062]
3、万寿菊根茎水溶性提取物抑菌效果分析
[0063]
将万寿菊连根拔起洗净后，用磨碎机打碎，过60目筛。称取5g万寿菊根茎粉末，放入100ml蒸馏水中，30℃，230rpm摇床振荡2h后，放入超声波中振荡1h，随后放入50℃恒温水浴锅内水浴2h，最后放置过夜。滤膜过滤浸泡液，将过滤后的溶液放入低温浓缩仪中，所得20ml浓缩液为万寿菊根茎水提物。
[0064]
由万寿菊根茎的乙醇提取物和水提取物抑制烟草青枯菌hf-1-1的平板实验可知，万寿菊根茎的乙醇提取物对hf-1-1无抑制作用，而其水提物对hf-1-1有明显的抑制作用，其抑制圈φ＝15.324
±
0.311mm(如图3，其中a1和a2为对照乙醇，a3和a4为万寿菊根茎的乙醇提取物对hf-1-1的平板抑制实验；b1和b2为对照水，b3和b4为万寿菊根茎的水提取物对hf-1-1的平板抑制实验)。可推测万寿菊根茎提取物的活性抑菌成分极易溶于水。
[0065]
4、万寿菊根茎水提物的tlc薄层层析分析
[0066]
将硅胶层析板切成长5cm，宽2cm的长方形板子；用直径1mm的毛细点样管吸取少量万寿菊根茎水提物于硅胶板底端，重复三次；配制不同的展层剂倒入展缸中，将点好样的硅胶板放进层剂中，待展层剂到达顶端时，取出吹干后，置于波长为365nm的紫外灯下观察硅胶板上的条带。
[0067]
万寿菊根茎水提取物；内径为0.5mm的玻璃毛细管；硅胶板；丙酮；无水乙醇；盐酸；正丁醇；氯仿；二氯甲烷；乙酸；甲酸；乙酸乙酯；甲醇；正己烷。经查阅文献，找出极性大的物质tlc点板展层剂的方法进行调整，得到最佳展开剂配比。在365nm紫外下观察硅胶板的条带。如图4，其中(a)为丙酮：无水乙醇：盐酸＝5：3：0.5；(b)正丁醇：乙酸：乙醇：水＝4:1:1:2；(c)氯仿：甲醇：水：甲酸：冰乙酸＝15：5：0.5：1：1；(d)二氯甲烷：乙酸：乙醇：水＝5：1：1：0.5；(e)丙酮：甲醇：乙酸＝5：3：1；(f)正丁醇：乙酸：乙醇：水＝5：1：2：1；(g)二氯甲烷：甲醇＝3：1；(h)二氯甲烷：甲醇：甲酸＝2：1：1；(i)正丁醇：乙酸：乙醇：水＝4：1:1:1；(j)二氯甲烷：乙酸：乙醇：水＝4：1：1；(k)正丁醇：乙酸：乙醇：水＝5：1：1：1.5；(l)乙酸乙酯：乙酸：乙醇：水＝4：1：1：1.5；(m)氯仿：甲醇：水＝5：3：1；(n)正丁醇：乙酸：乙醇：水＝5：1：1：1.2；(o)正丁醇：乙酸：乙醇：水＝6：1：1：1.5；(p)正丁醇：乙酸：乙醇：水＝8：1：1：2；(q)甲醇：水＝8：2；(r)正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝5：3：1；(y)正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝7：2：1。方法r的分离效果最好，分离出5类化合物。最终得出最佳展开剂的配方为正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝5：3：1。
[0068]
5、万寿菊根茎水提物硅胶柱层析分析
[0069]
将样品干燥后称重；用有机溶剂(3-5ml)溶解样品；用与样品等重量的硅胶粉，在水浴锅上拌样(水温不宜过高)，使溶剂挥发，样品充分均匀地吸附在硅胶粉上；在硅胶柱里加与样品10倍量的硅胶粉，用真空泵抽20min，使其中的硅胶粉紧密，硅胶粉最下端塞一小团棉花以防止硅胶粉溢出；把拌匀后的样品粉末加入硅胶柱中，使其铺展均匀，再加1-2cm厚的硅胶粉，最后塞一团棉花；用极性最小的溶剂正己烷加入一个柱体积的量，使柱内的硅胶粉润湿，填充柱填料；梯度洗脱程序：正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝50：3：1(单柱体积)
[0070]
正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝30：3：1(2个柱体积)
[0071]
正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝20：3：1(2个柱体积)
[0072]
正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝10：3：1(2个柱体积)
[0073]
正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝5：3：1(3个柱体积)
[0074]
正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝1：1：1(2个柱体积)
[0075]
用试管接分层的样品。
[0076]
如图5所示，其中a为编号1-14的试管样品条带；b为15-22的试管样品条带；c为验证23-24的试管样品条带；d为25-30的试管样品条带。柱层析后，tlc板验证发现，有明显分离出不同的条带，说明分离出不同类别的物质。
[0077]
6、万寿菊根茎水提物hplc分离法
[0078]
取2ml万寿菊根茎水提物过0.22μm滤膜；配制乙腈 0.1％三氟乙酸(tfa)和水 0.1％三氟乙酸(tfa)作为流动相；色谱柱c18短柱；流速0.7ml/min；柱温25℃；紫外检测波长330nm。洗脱程序如下：
[0079][0080]
[0081]
如图6，经hplc分离后，万寿菊根茎的水提物分离出多种成分，将分离出的物质分段收集：32-37.01min，39-46min，51.04-56.05min和58.03-62.05min。最后将收集的物质做青枯菌hf-1-1的平板抑菌实验。
[0082]
如图7，其中a为32-37.01min的物质；b为39-46min的物质；c为51.04-56.05min的物质；d为58.03-62.05min的物质。32-37.01min的物质抑制圈直径为15.1
±
0.057mm；39-46min的物质抑制圈直径为21.3
±
0.22mm；51.04-56.05min的物质抑制圈直径为10.4
±
0.08mm；58.03-62.05min的物质抑制圈直径为12.32
±
0.062mm。可知39-46min的物质对hf-1-1的抑制效果最好(t-test，p＜0.05)。
[0083]
7、gc-ms法分析万寿菊根茎水提物的39-46min的有效抑菌成分
[0084]
将39-46min抑菌物质旋干后，加入80μl 20mg/ml甲氧胺盐酸吡啶，超声波振荡5min后，放入37℃培养箱中肟化120min后加入10μl内标溶液和100μl mstfa溶液，放入60℃烘箱中衍生化3h，注射器过滤入衬管中，置于气相瓶中，待检测。gc条件：流速为1ml/min氦气，进口温度为235℃，离子源温度为250℃，接口温度为260℃，升温程序为50℃保持2min，以5℃/min的速度升到180℃，再以15℃/min的速度升到280℃，4.5min的溶剂切割时间消除溶剂峰。
[0085]
gc-ms检测出的物质粉为胺类，烷类，酸类，烯类，三嗪类，酮类，酯类，醇类，呋喃类。其中酯类物质最多，占总物质的77.438％；胺类，烷类，酸类，烯类，三嗪类，酮类，醇类，呋喃类的占比依次为0.525％，0.35％，5.502％，0.564％，0.019％，0.689％，14.837和0.075％。
[0086]
进一步用hplc分离万寿菊根茎水提物的39-46min的物质，将有抑菌效果的部分gc-ms检测，检测出的物质如下表所示。得到胺类物质2种，烷类物质2种，酸类物质4种，烯类物质1种，三嗪类物质1种，噻吩类物质2种，酮类物质3种，酯类物质8种，醇类物质2种，呋喃类物质2种。
[0087]
表1 gc-ms法分析万寿菊根茎水提物的有效抑菌成分分类
[0088][0089]
多次将有抑菌效果的部分用hplc进行分离，并进行大量收集，直至得到较纯的峰，液相色谱峰图如图8，将出峰时间1.852min、2.654min的物质进行平板抑菌验证，发现均有很好的抑菌效果。
[0090]
8、活性成分结构分析
[0091]
将图8中1.852min(物质1)、2.654min(物质2)出峰的物质及其处理过的烟草青枯菌送到上海复达检测技术集团有限公司进行核磁、红外、质谱、元素分析、扫描电镜等分析。
[0092]
物质1：
[0093]
如图9为物质1的红外谱图，将检测结果在数据库进行匹配，得到的匹配结果为柠檬烯，匹配结果为99.44％(图10)。
[0094]
随后检测物质1的核磁氢谱图(图11)、核磁碳谱图(图12)、气相质谱总离子流图(图13)和6.737min处峰的谱库匹配图(图14)，进一步验证了物质1为柠檬烯。物质1的元素分析结果如图15，与柠檬烯的元素组成相匹配，再一次验证了物质1为柠檬烯。
[0095]
图16a为未经处理的青枯菌菌液的扫描电镜图，可以看出细胞分布均匀，呈长椭圆形；而经物质1处理的青枯菌菌液的扫描电镜图中，细胞形状杂乱，分布不均，多为小椭圆形(图16b)。综上可知，物质1对青枯病原菌的生长有较大的影响。
[0096]
物质2：
[0097]
如图17为物质2的红外谱图，将检测结果在数据库进行匹配，得到的匹配结果为α-三联噻吩，匹配结果为99.44％(图18)。
[0098]
随后检测物质2的核磁氢谱图(图19)、核磁碳谱图(图20)、气相质谱总离子流图(图21)和18.201min处峰的谱库匹配图(图22)，进一步验证了物质2为α-三联噻吩。
[0099]
物质2的元素分析结果如图23，与α-三联噻吩的元素组成相匹配，再一次验证了物
质2为α-三联噻吩。
[0100]
图24a为未经处理的青枯菌菌液的扫描电镜图，可以看出细胞分布均匀，呈长椭圆形；而经物质2处理的青枯菌菌液的扫描电镜图中，细胞形状杂乱，分布不均，多为小椭圆形(图24b)。综上可知，物质2对青枯病原菌的细胞形成有较大的影响。
[0101]
综合上述物质1和物质2的核磁、红外、质谱、元素分析、扫描电镜等分析并结合上述gc-ms检测结果可知，万寿菊根茎提取物中的柠檬烯和α-三联噻吩具有杀菌活性，故选择这两种化合物进一步验证其对烟草青枯病和黑胫病的抑菌作用。
[0102]
实施例2万寿菊根茎活性成分抑菌效果分析
[0103]
本实施例涉及的试剂药品及菌种：烟草青枯病病原菌(ralstonia solanacearum)、黑胫病病原菌(烟草疫霉phytophthora parasitica var)(实验室保藏菌种)；柠檬烯和α-三联噻吩购自于上海迈瑞尔化学技术有限公司。烟草品种：供试烟草品种为云烟86。
[0104]
1、万寿菊根茎活性成分抑菌活性测定
[0105]
将灭菌的150ml营养琼脂固体培养基加热溶化完全。冷却至55℃左右，倒入培养皿内，每皿15ml，凝固后备用。采用打孔法，在直径为90mm的na培养基上打出直径为5mm的孔，每皿打4个孔。在孔内滴加30μl柠檬烯，无菌水作为对照。待培养基充分吸收药剂后，将平板转移至通风橱，将浓度为1.0x10
8 cfu/ml的烟草青枯病菌菌悬液均匀喷洒在药剂平板表面，使雾化菌悬液自然散落于药剂平板上。待平板充分吸收菌悬液后封口，将平板倒置于37℃恒温培养箱内培养，24h后检查抑菌效果，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。记录抑菌圈大小，重复3次。
[0106]
根据gc-ms和文献调研结果，初步推测万寿菊根茎水提取物中柠檬烯，α-三联噻吩抑菌有效成分，向混有ttc的na固体培养基中加入1％的hf-1-1发酵液，混匀后打出直径为5mm的孔，在孔中加入柠檬烯和α-三联噻吩，将平板放入37℃培养箱中恒温培养24h，观察抑菌圈大小。柠檬烯对青枯菌(hf-1-1)具有抑制作用(图25，其中a1和a2是20μl柠檬烯,a3是50μl柠檬烯；b1和b3是50μlα-三联噻吩，b2是20μlα-三联噻吩)，不同浓度柠檬烯对对青枯菌(hf-1-1)抑制效果存在明显差异，50μl柠檬烯原液对hf-1-1有较强的抑制作用，抑制圈φ＝19.31
±
0.214mm；20μl柠檬烯对hf-1-1抑制圈φ＝13.31
±
0.159mm。
[0107]
如图26，a为50μlα-三联噻吩，b为40μl柠檬烯抑制hf-1-1的平板实验。a和b的青枯菌菌落数分别为2.15x107cfu/ml和1.08x107cfu/ml。可知柠檬烯抑制hf-1-1的效果强于α-三联噻吩抑制hf-1-1的效果。
[0108]
考虑到用hf-1-1稀释涂平板可能不均匀，尝试把hf-1-1直接倒入培养基中生长，再打孔加入萃取液，观察抑菌圈。以同样的方法再次检测柠檬烯对hf-1-1的抑制作用。由图27，其中a1为20μl柠檬烯，a2为10μl柠檬烯，a3为对照乙醇；b1为10μlα-三联噻吩，b2为20μlα-三联噻吩，b3为对照乙醇。乙醇对hf-1-1的生长没有抑制效果，柠檬烯和α-三联噻吩均对hf-1-1有抑制作用。
[0109]
为进一步证实柠檬烯对青枯病病原菌的抑制效果，再次进行了平板实验和摇瓶发酵实验。分别在混有青枯菌hf-1-1的平板中加入10μl，20μl，30μl和40μl柠檬烯。经37℃恒温培养箱中培养12h后，青枯菌菌落数分别为543.67
±
64.45，378.67
±
48.95，164.67
±
53.51和108
±
38.35(105cfu/ml)(图28a,b，c，d),可知随着柠檬烯的用量增加，对hf-1-1的
抑菌作用增强。而且不同万寿菊提取物用量间青枯菌菌落数存在显著差异(t-test，p《0.05，图28)。
[0110]
由图29可知，柠檬烯对hf-1-1有较强的抑制作用，并随着用量的增加，抑制作用增强。值得注意的是，当柠檬烯的含量达到50μl时，hf-1-1几乎不生长，说明50μl柠檬烯足以抑制hf-1-1的生长。这是首次发现万寿菊根茎提取物中柠檬烯抑制青枯病病原菌效果显著。
[0111]
由图30可知，α-三联噻吩对hf-1-1有一定的抑制作用，100mg/l和400mg/l的α-三联噻吩对hf-1-1的抑制作用没有800mg/l的α-三联噻吩强；而800mg/l的α-三联噻吩抑制hf-1-1的效果明显低于柠檬烯。
[0112]
2、万寿菊根茎活性成分化合物毒理实验
[0113]
将活性物质成分按100％、75％、50％、25％和0％5个浓度梯度进行种子发芽测试，每个处理设3个重复，以芽长为指标，以0％浓度为对照，通过公式来计算各个浓度对作物种子发芽的促进率或抑制率。
[0114]
促进率(抑制率)％＝(处理组发芽数平均值-对照发芽数平均值)/对照组发芽数平均值
×
100％
[0115]
表2α-三联噻吩对烟草种子萌发影响
[0116][0117]
50％及以下浓度条件下α-三联噻吩对烟草种子萌发没有明显的抑制或者促进作用，但是高浓度α-三联噻吩对烟草种子萌发抑制作用很显著，*负号表示抑制。
[0118]
表3柠檬烯对烟草种子萌发影响
[0119][0120]
50％及以下浓度条件下柠檬烯促进烟草种子萌发，75％及以上浓度的柠檬烯抑对烟草种子萌发具有显著的抑制作用；*负号表示抑制。
[0121]
3、万寿菊根茎活性成分室内盆栽验证
[0122]
在烟苗盆栽时分别添加青枯菌病原菌为对照(ck)，柠檬烯(50μl/l)，α-三联噻吩添加量为500mg/l。移栽1，3，5，7，9周开始统计青枯病发病率和病情指数。室内盆栽实验分别进行了5次验证，每次设3个重复，每个重复烟草10株。
[0123]
供试烟草品种为烤烟云烟86和k236，烟草在花盆中进行播种、种植，并置于养虫笼
内防止害虫取食为害，管理时不使用任何农药，仅在需要时进行人工浇水。将不同品种的烟草播种至育苗盆内，覆膜保湿，待出苗后，移栽至无菌营养钵内，30℃生化培养箱内培养，待烟草长出3～4片真叶时，挑选长势一致的烟草备用。采用注射法，将注射器针头刺入烟根茎交界处维管束内，稍微提出针头，每株注射接种0.1ml浓度为1.0x10
10
cfu/ml烟草青枯病菌菌悬液，以无菌水为对照。
[0124]
另一组实验中，除了伤根接种病原菌外，每株浇灌50ml等量不同稀释倍数的单一药剂和复配组份。每处理10株烟苗，3次重复。按行业标准“烟草病害分级及调查方法”(yc/t39-1996)调查、记录烟株的病级、病情，计算发病率和病情指数。
[0125]
参照邓正平等方法(邓正平,2003#16)。选择历年烟草青枯病发生、危害较为严重的烟田。不同浓度有效组份提取物分别于烟苗移栽后施用。病害盛发期进行病情调查，并根据公式1和公式2分别计算其发病率和防治效果。
[0126]
发病率(％)＝发病株数/总株数
×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0127]
防治效果(％)＝(对照区发病率－处理区发病率)/对照区发病率
×
100
ꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0128]
烟草接种青枯病病原菌1，3，5，7和9周后，青枯病发病率和病情指数统计结果表明：柠檬烯，α-三联噻吩处理后青枯病发病率和病情指数均显著性降低(图31)，特别是柠檬烯，对青枯病的防治效果最佳(表4)。
[0129]
表4万寿菊活性物质对青枯病的防效(％)
[0130] 13579α-三联噻吩(di)0.009.5633.0244.0028.63柠檬烯(di)0.0031.2949.6064.3562.27
[0131]
通过以上分析，基本确定万寿菊根茎中柠檬烯和α-三联噻吩为具有抑制青枯病的活性物质。
[0132]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。