一种小分子复合寡肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于功能性食品或保健品领域，具体涉及一种小分子复合肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着社会经济的快速发展，生活节奏的不断加快，来自社会、生活、工作诸多方面的压力越来越大，随之出现的亚健康状态人群越来越多，这样给个人、家庭和社会带来很多不稳定、不和谐的潜在因素，严重影响了社会生产力和人们的生活质量。其中失眠及由其引发的相关症状在诸多亚健康状态中较为常见和突出，越来越受到大家的关注。
3.失眠是以经常不能获得正常睡眠为特征的一类病证，主要表现为睡眠时间短，深度睡眠不足，轻者入睡困难、寐而不酣、时睡时醒或醒后无法继续入眠，重者彻夜不眠。目前失眠已经成为继头痛后的神经科门诊的第二大疾病。
4.目前用于治疗失眠的药物主要为西药和部分中药，而这些药物常有作用不确切、须长期服药、停药即发病、易产生依赖性、毒副作用较大等问题。长期服用对病人的身体健康势必有害，甚至会引起其他医源性疾病。所以开发安全、有效的新型助眠药物、保健品或功能型食品必然会成为该领域的发展趋势，近年来采用食疗的方法来缓解或根除包括失眠在内的某些疾病引起了大家的关注，但在市面上迄今还未出现令人满意的食疗方案或产品。
5.因此，开发一种助眠效果显著且副作用小的助眠产品具有重要的研究意义和推广价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中助眠效果显著的食疗方案或产品的缺乏，提供一种小分子复合寡肽。本发明提供的小分子复合寡肽以多种小分子肽配伍作为主料，并辅以γ-氨基丁酸、n-乙酰神经胺酸、甜菊糖等神经营养因子，不仅原料绿色天然，口感细腻醇香，而且具有显著的助眠效果，在很大程度上克服了现有助眠产品功效不明显、副作用大的缺陷；且为固体制剂的形式，避免了相关液体制剂不易储存与携带等问题。
7.本发明的另一目的在于提供上述小分子复合寡肽的制备方法。
8.本发明的另一目的在于提供上述小分子复合寡肽在制备助眠、营养修复、提升机体免疫力或美容药品、保健品或功能型食品或制剂中的应用。
9.为弥补现有技术的不足，本发明提供一种营养丰富、增强免疫力的小分子复合寡肽及其制备方法和应用。
10.为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种小分子复合寡肽，包括如下重量份数的主料和辅料：主料：核桃低聚肽25-32%、花生低聚肽16-20%、鱼皮低聚肽10-13%、牛骨低聚肽17-22%、燕麦低聚肽9-11%、玉米低聚肽4-6%；辅料：γ-氨基丁酸2-3%、n-乙酰神经胺酸1.5-2%、甜菊糖0.2-0.5%；所述核桃低聚肽、花生低聚肽、鱼皮低聚肽、牛骨低聚肽、
燕麦低聚肽、玉米低聚肽均采用酶解法获得。
11.一种小分子复合寡肽的制备方法，包括以下步骤：（1）分别将核桃粕、花生粕、鱼皮、牛骨、燕麦粕、玉米粕经过预处理后进行酶解分离纯化分别得到核桃低聚肽、花生低聚肽、鱼皮低聚肽、牛骨低聚肽、燕麦低聚肽、玉米低聚肽；（2）将制得的核桃低聚肽、花生低聚肽、鱼皮低聚肽、牛骨低聚肽、燕麦低聚肽、玉米低聚肽与柠檬酸、苹果酸、甜菊糖机械混合均匀后喷雾干燥得粉末，粉末过50-100目筛后进行分包包装。
12.进一步的，所述燕麦低聚肽、玉米低聚肽均采用以下方法制得：将燕麦粕、玉米粕与水按照重量比1：（6-10）混合，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解，酶解温度为45-65℃，酶解液ph值为7-9，保温2-3.5h后过滤除去酶解液中的杂质，滤液再进行二次酶解，酶解条件与第一次相同，向二次酶解液中加酸调节ph值至4-6，离心分离，得上清液；将上清液按照2-3ml/min的速度通过大孔树脂进行脱色除味，喷雾干燥，即可得到燕麦低聚肽、玉米低聚肽的粉末。
13.进一步的，所述鱼皮低聚肽采用以下方法获得：将海洋鱼皮清洗干燥后，浸泡在0.05mol/l的氢氧化钠溶液中，常温浸泡2-4h后分离出海洋鱼皮，用蒸馏水清洗干净；将处理过的海洋鱼皮放入重其8-10倍的蒸馏水中，加入1-1.5%的中性蛋白酶酶解4-8h得胶原蛋白溶液，酶解温度为25-45℃，酶解压力为0.01-0.03mpa；向酶解得到的胶原蛋白溶液中加入重其1.5-2.5%的活性炭吸附，在常温下，压力控制在0.03-0.05mpa，30-50min后分离纯化出胶原蛋白溶液，向胶原蛋白溶液中加入β-环糊精进行包覆，然后在40-70℃喷雾干燥得鱼皮低聚肽。
14.进一步的，所述核桃低聚肽、花生低聚肽采用以下方法获得：将核桃粕、花生粕真空烘干后粉碎，加水，调节ph值5-6，升温至50-60℃，加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶和风味蛋白酶质量比1：1，酶解3h，酶解过程中每半个小时调节一次ph，使ph值维持在5-6，酶解结束后灭酶，过滤得澄清液，滤液浓缩后喷雾干燥，即可得到核桃低聚肽、花生低聚肽。
15.进一步的，所述牛骨低聚肽采用以下方法获得：将除杂后的牛骨粉碎至2～3cm的骨块洗净放入蒸煮罐中加水蒸煮，将蒸煮液进行油水分离，并将所得水相降温至50～55℃，得到粗胶原蛋白溶液，加入用量为原料重量0.05～0.15％的高效率复配酶制剂，混合均匀后在不调节ph值、不控制温度的自然条件下酶解0.5～2h，得到胶原蛋白肽溶液；采用截留分子量为800da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，将所得高纯度胶原蛋白肽溶液进行高温高压处理，得到处理液；所述高温高压处理的条件包括温度为110～130℃，压力为0.1～0.3mpa，时间为5～20min；将所述处理液进行减压加热浓缩，浓缩液喷雾干燥，得牛骨低聚肽。
16.进一步的，所述高效率复配酶制剂由30～40wt％复合蛋白酶、25～30wt％风味蛋白酶，25～30wt％碱性蛋白酶、7～8wt％动物蛋白水解酶和2～3wt％酶激活剂组成，所述酶激活剂含有还原剂和二价金属离子；所述还原剂为二硫苏糖醇和/或β-巯基乙醇；所述酶激活剂中还原剂和二价金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)；所述二价金属离子为mg2 、zn2 和ca2 的混合物。
17.所述小分子复合寡肽在制备助眠、营养修复、提升机体免疫力或美容药品、保健品
或功能型食品或制剂中的应用。
18.引发睡眠障碍的原因有多种，例如睡眠情绪、身心疲劳感、睡眠因子的合成和分泌不足等。从这几个角度综合考虑，得到一种多角度助眠的产品将具有更加的助眠效果和应用范围。
19.燕麦低聚肽、玉米低聚肽一方面能够促进骨骼肌损伤细胞的修复，维持骨骼肌细胞的完整性以及减少心肌线粒体氧自由基的生成，维持心肌线粒体的正常结构和功能，保护心脏，提高耐氧能力；另一方面富含高谷酰胺的燕麦低聚肽、玉米低聚肽，能有效调节神经。从而通过降低身心疲劳感来促进睡眠。
20.核桃低聚肽、花生低聚肽中的色氨酸可促进血清素和褪黑素的分泌，谷氨酸可促进脑内五羟色胺、γ-氨基丁酸等抑制性神经递质的合成，从而发挥改善睡眠的积极作用。
21.鱼皮低聚肽和牛骨低聚肽中丰富的色氨酸是大脑合成5-羟色胺的主要原料，它能改善睡前情绪和抑制神经活动，缩短睡眠潜伏期。
22.本发明通过反复研究发现，特定的植物小分子肽：核桃低聚肽、花生低聚肽和燕麦低聚肽、玉米低聚肽，和特定的动物小分子肽：鱼皮低聚肽、牛骨低聚肽进行复配，可较好地滋养神经细胞，参与修复和改善脑细胞代谢；γ-氨基丁酸具有镇静助眠、抗焦虑的作用；n-乙酰神经胺酸具有参与维持大脑神经结构和功能的完整，促进神经细胞的分化、发育、再生以及突触传递等作用。
23.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）本发明以特定的小分子复合寡肽肽组合为主料，可从改善睡眠情绪、降低身心疲劳感、增加睡眠因子的合成和分泌等角度，协同发挥较为全面的助眠效果，减少因成分单一引起的助眠效果不佳现象；同时以功能性神经营养因子为辅料，通过主料和辅料的的复配，得到的小分子复合寡肽不仅原料绿色天然，口感细腻醇香，而且具有显著的助眠效果，可大大缩短睡眠潜伏期时间和延长睡眠有效期时间，在很大程度上克服了现有助眠产品功效不明显、副作用大的缺陷；且为固体制剂的形式，避免了相关液体制剂不易储存与携带等问题；（2）本发明提供的制备方法工艺简单、通过酶解工艺制得不同的蛋白肽，制备过程简单、绿色环保、能充分去除其中杂蛋白及各种腥味杂味，易于推广和规模化生产；且小分子复合寡肽遇水易复溶还原、利于消化吸收；易于储存和携带，适应当前快节奏的生活方式，具有较高的社会效益和经济效益。
具体实施方式
24.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明 。
25.实施例1本实施例的小分子复合寡肽，包括如下重量份数的主料和辅料：主料：核桃低聚肽25%、花生低聚肽16%、鱼皮低聚肽13%、牛骨低聚肽22%、燕麦低聚肽11%、玉米低聚肽6%；辅料：γ-氨基丁酸2%、n-乙酰神经胺酸1.5%、甜菊糖0.2%。
26.本实施例的小分子复合寡肽的制备方法，包括以下步骤：（1）将燕麦粕、玉米粕与水按照重量比1：（6-10）混合，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解，酶解温度为45-65℃，酶解液ph值为7-9，保温2-3.5h后过滤除去酶解液中的杂质，滤
液再进行二次酶解，酶解条件与第一次相同，向二次酶解液中加酸调节ph值至4-6，离心分离，得上清液；将上清液按照2-3ml/min的速度通过大孔树脂进行脱色除味，喷雾干燥，即可得到燕麦低聚肽、玉米低聚肽的粉末。
27.（2）将海洋鱼皮清洗干燥后，浸泡在0.05mol/l的氢氧化钠溶液中，常温浸泡2-4h后分离出海洋鱼皮，用蒸馏水清洗干净；将处理过的海洋鱼皮放入重其8-10倍的蒸馏水中，加入1-1.5%的中性蛋白酶酶解4-8h得胶原蛋白溶液，酶解温度为25-45℃，酶解压力为0.01-0.03mpa；向酶解得到的胶原蛋白溶液中加入重其1.5-2.5%的活性炭吸附，在常温下，压力控制在0.03-0.05mpa，30-50min后分离纯化出胶原蛋白溶液，向胶原蛋白溶液中加入β-环糊精进行包覆，然后在40-70℃喷雾干燥得鱼皮低聚肽。
28.（3）将核桃粕、花生粕真空烘干后粉碎，加水，调节ph值5-6，升温至50-60℃，加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶和风味蛋白酶质量比1：1，酶解3h，酶解过程中每半个小时调节一次ph，使ph值维持在5-6，酶解结束后灭酶，过滤得澄清液，滤液浓缩后喷雾干燥，即可得到核桃低聚肽、花生低聚肽。
29.（4）将除杂后的牛骨粉碎至2～3cm的骨块洗净放入蒸煮罐中加水蒸煮，将蒸煮液进行油水分离，并将所得水相降温至50～55℃，得到粗胶原蛋白溶液，加入用量为原料重量0.05～0.15％的高效率复配酶制剂，混合均匀后在不调节ph值、不控制温度的自然条件下酶解0.5～2h，得到胶原蛋白肽溶液；采用截留分子量为800da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，将所得高纯度胶原蛋白肽溶液进行高温高压处理，得到处理液；所述高效率复配酶制剂由30～40wt％复合蛋白酶、25～30wt％风味蛋白酶，25～30wt％碱性蛋白酶、7～8wt％动物蛋白水解酶和2～3wt％酶激活剂组成，所述酶激活剂含有还原剂和二价金属离子；所述还原剂为二硫苏糖醇和/或β-巯基乙醇；所述酶激活剂中还原剂和二价金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)；所述二价金属离子为mg2 、zn2 和ca2 的混合物，所述高温高压处理的条件包括温度为110～130℃，压力为0.1～0.3mpa，时间为5～20min；将所述处理液进行减压加热浓缩，浓缩液喷雾干燥，得牛骨低聚肽。
30.（5）将制得的核桃低聚肽、花生低聚肽、鱼皮低聚肽、牛骨低聚肽、燕麦低聚肽、玉米低聚肽与柠檬酸、苹果酸、甜菊糖机械混合均匀后喷雾干燥得粉末，粉末过50-100目筛后进行分包包装。
31.实施例2本实施例的小分子复合寡肽，包括如下重量份数的主料和辅料：主料：核桃低聚肽32%、花生低聚肽20%、鱼皮低聚肽10%、牛骨低聚肽17%、燕麦低聚肽9%、玉米低聚肽4%；辅料：γ-氨基丁酸2%、n-乙酰神经胺酸2%、甜菊糖0.5%。
32.本实施例的小分子复合寡肽制备方法同实施例1。
33.实施例3本实施例的小分子复合寡肽，包括如下重量份数的主料和辅料：主料：核桃低聚肽25%、花生低聚肽16%、鱼皮低聚肽10%、牛骨低聚肽22%、燕麦低聚肽11%、玉米低聚肽6%；辅料：γ-氨基丁酸3%、n-乙酰神经胺酸2%、甜菊糖0.3%。
34.本实施例的小分子复合寡肽制备方法同实施例1。
35.实施例4本实施例的小分子复合寡肽，包括如下重量份数的主料和辅料：主料：核桃低聚肽
25%、花生低聚肽20%、鱼皮低聚肽10%、牛骨低聚肽22%、燕麦低聚肽9%、玉米低聚肽6%；辅料：γ-氨基丁酸2%、n-乙酰神经胺酸2%、甜菊糖0.4%。
36.本实施例的小分子复合寡肽制备方法同实施例1。
37.实施例5本实施例的小分子复合寡肽，包括如下重量份数的主料和辅料：主料：核桃低聚肽32%、花生低聚肽16%、鱼皮低聚肽13%、牛骨低聚肽17%、燕麦低聚肽11%、玉米低聚肽4%；辅料：γ-氨基丁酸3%、n-乙酰神经胺酸1.5%、甜菊糖0.5%。
38.本实施例的小分子复合寡肽制备方法同实施例1。
39.本发明实施例1-实施例5制备得到的小分子复合寡肽不仅能增强机体免疫力，而且能调节机体的免疫系统，有助于缓解体力疲劳和有助于增加骨密度，适用于易感疲劳及骨质疏松患者的辅助治疗，为了表明本发明的有助于缓解体力疲劳和有助于增加骨密度的保健效果，将实施例1-5的制得的小分子复合寡肽缓解体力疲劳和增加骨密度的有益效果进行研究，具体方法如下：一、小鼠负重游泳实验(1)实验动物：昆明种小鼠48只，雌雄小鼠各24只，个体质量20-25g。
40.(2)实验仪器：游泳箱(40cm
×
55cm
×
55cm)(3)实验方法：将48只小鼠随机分为6组，分为实验1-5组及空白对照组，实验1-5组每组8只，空白对照组8只，且每组中雌雄各半，在进行实验研究的过程中向空白对照组给予去离子水，实验1-5组分别给予实施例1-5中的产品进行灌胃，并使得每个实验组均分成3个小组，每个小组内8只昆明种小鼠，每组按0.3g/kg体重灌服10d，于小鼠受试物30min后进行抗疲劳指标测定：(4)负重游泳试验取每组8只小鼠灌胃30min后，尾根部负荷小鼠体质量5％的铅丝，置于游泳箱中，水深30cm，水温25℃，记录小鼠从游泳开始至死亡的时间。
41.(5)血乳酸的测定每组8只小鼠灌胃30min后，尾根部负荷小鼠体质量5％的铅丝，置于游泳箱中，水深30cm，水温25℃，游泳10min停止，分别从游泳前、游泳之后0、15、60min的小鼠眼内眦静脉丛取血，于5ml离心管中加入质量分数为1％的naf溶液0.48ml，准确吸取全血20μl加入试管底部。用试管上清液冲洗微量吸管数次，再加入蛋白沉淀剂1.5ml，振荡混匀，3000r/min离心条件下离心10 min，取上清液测定。
42.(1)负重游泳试验实验结果表1小分子复合寡肽对小鼠负重游泳时间的影响组别灌服的物质剂量（g/kg）动物数（只）游泳时间(min)空白对照组去离子水0.385.59
±
1.04实验1组实施例10.3813.02
±
2.22实验2组实施例20.3810.98
±
1.37实验3组实施例30.388.98
±
2.44实验4组实施例40.3811.27
±
2.31实验5组实施例50.3811.92
±
1.49由表1可见，实施例1-5的小鼠的游泳时间均长于空白对照组的游泳时间，说明在
给小鼠灌服本发明的小分子复合寡肽后能够提升小鼠的抗疲劳能力和明显延长小鼠负重时间，实施例1的0.3g/kg体重的小分子复合寡肽可以明显延长小鼠负重时间，差异有显著性；说明本发明制备得到的小分子复合寡肽具有明显的抗疲劳效果，且实施例1与其他实施例的游泳时间相比，高于实施例2-5的游泳时间，说明实施例1的小分子复合寡肽的抗疲劳能力优于实施例2-5的小分子复合寡肽。
43.(2)血乳酸测定结果表2小分子复合寡肽对小鼠血乳糖的影响
组别灌服的物质剂量(g/kg)动物数(只)游泳前游泳后(0min)游泳后(15min)游泳后(60min)空白对照组去离子水0.3824.7
±
3.543.7
±
4.330.7
±
2.219.5
±
2.3实验1组实施例10.3822.9
±
4.240.5
±
4.224.3
±
3.016.8
±
3.4实验2组实施例20.3822.5
±
4.840.9
±
3.423.3
±
3.215.7
±
2.5实验3组实施例30.3821.6
±
6.240.5
±
4.723.0
±
4.216.2
±
2.7实验4组实施例40.3823.1
±
3.638.9
±
4.522.6
±
2.715.9
±
3.8实验5组实施例50.3822.1
±
4.637.0
±
3.921.1
±
3.714.6
±
2.6
实验1-5组在游泳后0min和15min与对照组相比，血乳酸含量都分别降低了25％左右(e《0.051)，并且在15min时趋于游泳前的乳酸含量，见表2。运动后15min内血乳酸含量分别降低，说明小分子复合寡肽具有促进体力性疲劳消除的积极作用，而且中高低剂量都有类似的作用。且实施例1-实施例4的血乳糖与实施例5的血乳糖相比，略高于实施例5 的血乳糖，说明实施例5的小分子复合寡肽的促进体力性疲劳消除优于实施例1-4的小分子复合寡肽。
44.二、小鼠骨密度影响实验按中华人民共和国卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)方法操作。对大鼠抗骨质疏松症的作用主要考察大鼠体重；股骨长度、湿重、干重；股骨骨密度和骨硬度；(1)实验动物：6月龄sd大鼠70只，spf级，体重80
±
10g，雌性和雄性各半。
45.(2)实验仪器：xr-36型双能x线骨密度仪(3)实验方法：大鼠适应性喂养3d后，随机分为7组，每组10只，包括空白对照组、碳酸钙对照组、及实验1-实验5组，实验1-实验5组每组10只大鼠，对空白对照组饲喂ca含量为0mg/kg体重的饲料，并每日灌胃每100g体重给予1.0ml去离子水；对碳酸钙对照组饲喂 160mg/kg体重的碳酸钙；实验1-5组分别饲喂实施例1-5 制备得到的小分子复合寡肽，对实验1-实验5组饲喂的每组10个大鼠饲喂10倍人体推荐量的受试物组(300mg/kg体重)，给样方法为灌胃。各组大鼠连续饲养3周后进行3d钙代谢实验，测定钙吸收率，继续喂养至13周，实验结束时检测各组大鼠身长，体重变化和股骨密度含量。
46.股骨密度测定方法：采用xr-36型双能x线骨密度仪测定股骨样品中点及远心端的骨密度；(4)实验结果：表3小分子复合寡肽对大鼠身长的影响
组别灌服的物质剂量(g/kg)始长/cm第四周身长/cm空白对照组1.0ml去离子水0.014.82
±
0.3218.21
±
0.45碳酸钙对照组160mg/kg体重的碳酸钙0.1614.84
±
0.4319.83
±
0.44
实验1组实施例10.314.92
±
0.3521.85
±
0.32实验2组实施例20.314.82
±
0.2623.12
±
0.38实验3组实施例30.314.84
±
0.4121.98
±
0.35实验4组实施例40.315.07
±
0.2624.43
±
0.31实验5组实施例50.315.08
±
0.2124.84
±
0.33
从表3可见，碳酸钙对照组饲喂160mg/kg体重和实验1-5组饲喂300mg/kg 体重的大鼠相比，在始长上无明显差异，但是在第4周身长的对比中出现明显的差异，与碳酸钙对照组比较差异有显著性意义(p《0.01)，其中实施例5组动物喂养第4周时的身长与相同水平碳酸钙对照组比较身长增长最大。且实施例1-3的大鼠身长与实施例4-5的大鼠身长相比，略低于实施例4-5的大鼠身长，说明实施例4-5的小分子复合寡肽促进大鼠生长优于实施例1
‑ꢀ
3的小分子复合寡肽。
47.表4小分子复合寡肽对大鼠股骨骨密度的影响
组别灌服的物质剂量(g/kg)中点骨密度/g.cm2远端骨密度/g.cm2空白对照组1.0ml去离子水00.216
±
0.0100.312
±
0.002碳酸钙对照组160mg/kg体重的碳酸钙0.160.238
±
0.0020.344
±
0.008实验1组实施例10.30.261
±
0.0050.394
±
0.006实验2组实施例20.30.275
±
0.0030.471
±
0.014实验3组实施例30.30.252
±
0.0070.387
±
0.021实验4组实施例40.30.289
±
0.0120.487
±
0.011实验5组实施例50.30.282
±
0.0070.491
±
0.003
从表4可见，实验2、4、5组动物左侧股骨中点及远端骨密度与低钙对照组和碳酸钙对照组比较增加，经统计学检验，差异有非常显著性意义(p《0.01)，表明骨密度结果阳性。且实施例1、3的左侧股骨中点及远端骨密度与实施例2、4、5的左侧股骨中点及远端骨密度相比，略低于实施例2、4、5的左侧股骨中点及远端骨密度，说明实施例2、4、5的小分子复合寡肽促进左侧股骨中点及远端骨密度优于实施例1、3的小分子复合寡肽。
48.实验结论：实施例1具有显著抗疲劳保健效果，实施例5具有显著提高骨密度效果，实施例2、4、5在抗疲劳和提高骨密度上也具有一定保健效果。
49.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。